金纳米棒核/银壳纳米结构致基因毒性中ROS与细胞周期阻滞的研究

摘要

为理解银纳米颗粒（AgNPs）和银离子诱导的肝脏基因毒性，本研究采用工程化金纳米棒核/银壳纳米结构（Au@Ag NR）和人源化肝细胞HepaRG细胞。通过彗星实验、γ-H2AX实验和微核实验，探讨了0.4–20 µg/mL Au@Ag NR诱导DNA和染色体损伤中氧化应激和细胞周期阻滞的参与。进一步分析了Au@Ag NR分布。结果表明，Ag⁺和Au@Ag NR均导致HepaRG细胞DNA断裂和染色体损伤（断裂性），滞留在细胞核中的Au@Ag NR可能进一步释放Ag⁺加剧损伤，主要由细胞周期阻滞和ROS形成引起。结果揭示了细胞内积累、Ag⁺离子释放与AgNPs潜在基因毒性之间的相关性。

引言

尺寸1-100 nm的银纳米颗物（AgNPs）可通过穿透病原体并使其代谢酶内部巯基失活，展现广谱抗菌性能。它们在大肠杆菌、淋球菌和沙眼衣原体中显示出强大的抑菌和杀菌作用，广泛用作医用涂层、家用产品及伤口敷料。确凿证据显示纳米颗粒能进入细胞核并干扰DNA合成与转录过程。前期研究报道，单次静脉注射5 mg/kg AgNPs可导致SD大鼠骨髓细胞显著染色体断裂。单次腹腔注射10 mg/kg或更高剂量AgNPs诱导DNA和染色体损伤。Flower等建议50和100 µg/mL AgNPs给药5分钟内即可触发DNA损伤，凸显快速释放银的基因毒性。考虑过度暴露风险，纳米基因毒理学即工程纳米材料DNA损伤和致癌潜力研究受关注。

AgNPs诱导遗传损伤主要机制被认为是活性氧过量产生、炎症和细胞周期紊乱。前期研究提示AgNPs可通过氧化损伤直接与DNA相互作用，干扰DNA水平间期和染色体水平有丝分裂，或与核蛋白和有丝分裂纺锤体装置相互作用干扰细胞周期检查点。但AgNPs诱导基因毒性是部分归因于纳米颗粒本身还是完全归因于释放的Ag⁺离子尚不清楚。

因组织中银不稳定持续释放，导致AgNPs定位困难、难以区分纳米核心与银，研究AgNPs基因毒性有难度。本团队近期开发金纳米棒核/银壳（Au@Ag NR）纳米结构用于研究纳米颗粒诱导毒性。Au@Ag NR金核在组织中生理惰性，可作为内标通过监测Ag/Au比值变化（用电感耦合等离子体质谱ICP-MS测量）监控银壳Ag⁺释放。此法可识别不同毒性来源。前期研究显示Au@Ag NR壳释放Ag⁺导致肾脏氧化损伤，最终致肾小球滤过功能形态学改变和损伤。Jiang等提示Au@Ag NR颗粒特异性活性和细胞内银离子释放均促成颗粒细胞毒性反应。我们也采用Au@Ag NR模型研究AgNPs体内基因毒性潜力，证实断裂性而非突变性是Ag壳和释放Ag⁺诱导基因毒性主要形式，两者毒性模式无差异。

肝脏是AgNPs主要积累器官之一，被认为是AgNPs诱导基因毒性靶器官/组织。前期研究显示SD大鼠静脉注射一次Au@Ag NR八周后肝脏仍残留银（8.26±3.90 µg/g）和金（80.07±64.72 µg/g）。本研究尝试用Au@Ag NR在人肝癌源HepaRG细胞中鉴定细胞周期阻滞和活性氧化应激在AgNPs诱导染色体和DNA损伤中的作用。并行进行彗星实验、γ-H2AX实验和微核实验，结合氧化自由基清除剂探究ROS在DNA/染色体损伤中贡献；测定细胞凋亡、细胞周期及相关蛋白探索AgNPs干扰DNA合成复制机制；结合ICP-MS和透射电镜（TEM）研究Au@Ag NR细胞内积累分布，区分纳米颗粒和释放银离子作用。

材料与方法

细胞培养与处理

使用人肝癌细胞系HepaRG（Thermo Fisher Scientific）。细胞在含10%胎牛血清（FBS，澳洲源，Gibco）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液（Gibco）的RPMI 1640培养基中培养，5% CO₂，37°C湿润环境。细胞经Au@Ag NR不同浓度处理24 h或72 h，浓度按ATP细胞活力实验估算IC₅₀确定。探究ROS作用时，用1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Sigma-Aldrich）预处理1 h后再处理Au@Ag NR。

ATP细胞生长/活力实验

细胞以5×10³/孔密度接种96孔板。孵育24 h后吸除培养基，用不同浓度Au@Ag NR处理24 h或48 h。制备宽浓度范围，每处理周期每浓度4复孔。用三磷酸腺苷（ATP）实验（CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega）检测Au@Ag NR细胞毒性，通过定量ATP量（活细胞重要代谢参数）测定细胞代谢活性。用多标签板读数仪（VICTOR Multilabel Plate Reader, 2030-0050, PerkinElmer）检测发光信号，用Prism 7（GraphPad Prism 7, CA, USA）估算IC₅₀值。活力比计算公式：活力比(%) = RLU_sample / RLU_vehicle × 100%，RLU为4孔平均相对发光单位，RLU_vehicle为未处理纳米棒细胞，RLU_sample为不同浓度Au@Ag NR处理细胞。

细胞中银金浓度测定

细胞样品用硝酸微波消化系统消化。消化后用1%硝酸和盐酸混合液配制。用ICP-MS（NexION300X, PerkinElmer）测定溶液中Ag和Au含量。TEM分析确定细胞内Au NR和Au@Ag NR存在。细胞样品用2.5%戊二醛和2%多聚甲醛混合液4°C固定2 h。细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，1%四氧化锇4°C后固定2 h。随后蒸馏水洗涤3次，依次经50%、70%、90%、100%乙醇脱水各15 min。随后丙烯酸氧化物1:1和1:3稀释液分别在20-26°C渗透树脂2 h。分级加热聚合：35°C 16 h，45°C 8 h，55°C 14 h，65°C 48 h。超薄切片醋酸铀和柠檬酸铅染色25 min，透射电镜（H-7650, HITACHI, Japan）分析。

常规与改良彗星实验

细胞以2×10⁵/孔或3×10⁵/孔密度接种12孔板，分别用于24 h或72 h处理。200 µmol过氧化氢（H₂O₂）处理1 h作为阳性对照。每样品制备2孔分别进行常规处理和嘌呤嘧啶糖基化酶（Fpg）处理。常规彗星实验在碱性条件（pH>13）下进行。Fpg处理孔在DNA解旋前额外进行Fpg处理，载玻片在酶缓冲液（0.1 M KCl, 0.5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0.2 mg/mL BSA）中浸泡3次每次5 min。Fpg（New England Biolabs, Inc., UK）按1:50,000用酶缓冲液稀释。每载玻片凝胶加100 µL稀释酶，37°C湿箱孵育30 min。后续步骤同常规处理。彗星实验重复3次。用尼康Eclipse 80i荧光显微镜（Nikon, Tokyo, Japan）独立评分每样品至少50个细胞，用Komet 6.0（Andor Technology, Belfast, UK）分析每样品尾部DNA百分比中值和橄榄尾矩（OTM）。

流式细胞术与高含量筛选定量γ-H2AX焦点

流式细胞术定量：细胞以2×10⁵/孔或3×10⁵/孔密度接种12孔板，分别24 h或72 h处理。高含量筛选：细胞以6×10³/孔或1×10⁴/孔密度接种96孔板，分别24 h或72 h处理。2 µM甲基甲烷磺酸酯（MMS, Sigma-Aldrich）并行处理1 h作阳性对照。细胞用TBS洗涤，4%多聚甲醛室温固定15 min。TBS洗涤后，冰冷甲醇50 µL于-20°C孵育30 min。TBS再洗3次，封闭试剂（TBS含0.3% Triton X-100和10%山羊血清）孵育1 h。一抗（小鼠抗磷酸化-H2AX Ser139, Millipore）按1:200用封闭试剂稀释，4°C过夜孵育。板再用TBS洗3次，二抗（Alexa Fluor 488山羊抗小鼠, Life Technologies）按1:20用封闭试剂稀释加入。避光室温孵育1 h，每孔加2 µg/mL（20 µL/孔）DAPI（Invitrogen）。用流式细胞仪（FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA）或高含量分析系统（Operetta CLS, PerkinElmer）测量荧光。流式细胞术每组分析至少10,000细胞，重复3次；高含量分析每孔20视野，每组至少5孔。

细胞阻滞微核细胞学（CBMN-cyt）实验

按Fenech等程序进行CBMN-cyt。细胞以2×10⁵/孔或3×10⁵/孔密度接种12孔板，分别24 h或72 h处理。0.2 µg/mL环霉素C（MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japan）处理24 h作阳性对照。处理24 h或72 h后加3 µg/mL细胞松弛素B阻滞胞质分裂，再培养40 h收集细胞。经预热0.075 mol/L KCl渗透压处理、甲醇乙酸3:1混合液固定后，用5%吉姆萨染色。每组3复孔，每孔检查至少1000双核细胞。

MDA、总GSH和SOD含量测定

细胞以5×10⁵/孔或3×10⁵/孔密度培养于12孔板，分别24 h或72 h处理。收集细胞用PBS洗涤3次。用硫代巴比妥酸法（南京建成生物工程研究所）测定细胞匀浆中丙二醛（MDA）含量。用总谷胱甘肽（GSH）定量和超氧化物歧化酶（SOD）实验盒（Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japan）分别测定总GSH和SOD含量。用多标签板读数仪（VICTOR Multilabel Plate Reader, 2030-0050, PerkinElmer）测定各孔光密度（O.D）。

流式细胞术细胞周期分析

细胞以1×10⁶/孔或5×10⁵/孔密度培养于6孔板，分别24 h或72 h处理，随后用70%乙醇4°C过夜固定。用PBS洗涤3次，用PI/RNase染色缓冲液（BD Biosciences）室温染色15 min。用流式细胞仪（FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA）和FlowJo（BD Bioscience）采用FL2面积对FL2宽度区域确定20,000细胞中G0/G1、S、G2/M期细胞群体。重复3次。

流式细胞术细胞凋亡分析

细胞以1×10⁶/孔或5×10⁵/孔密度培养于6孔板，分别24 h或72 h处理。随后用PBS洗涤2次，用500 µL 1×结合缓冲液（FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience）调整悬液至~1×10⁶ cells/mL，取100 µL稀释液混合5 µL FITC Annexin V和5 µL PI。室温避光染色15 min，用流式细胞仪（FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA）和FlowJo采用FL1H对FL2H区域分析至少10,000细胞确定早期和晚期凋亡细胞群体。重复3次。

Western blot分析

细胞以1×10⁷/孔和6×10⁶/孔密度培养于75 cm²瓶，分别24 h和72 h处理。用含蛋白酶抑制剂（PMSF）RIPA裂解液裂解细胞，用BCA蛋白定量盒（Beyotime Biotechnology, China）测定蛋白浓度。用RIPA裂解液调整样品浓度，95°C变性3 min。蛋白样品经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜（Millipore）。5%脱脂奶封闭30 min，分别与p53（SC-137174, Santa Cruz）、p21（SC-6246, Santa Cruz）、β-actin（sc-47778, Santa Cruz）一抗和羊抗鼠IgG(H+L)-HRP（SE131, solabio）二抗孵育。用增强化学发光（ECL）法显影，ImageJ系统（National Institutes of Health）分析目标蛋白表达水平。

统计分析

数据以均值±SEM表示。用单因素方差分析（ANOVA）检验阴性对照与处理组差异显著性，随后用Dunnett多重比较检验（SPSS版本22, IBM, Armonk, NY, USA），P<0.05为统计学显著。用GraphPad Prism 7 for Windows（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）制图。

结果

Au NR和Au@Ag NR表征

金纳米棒（Au NRs）、金纳米棒核/银壳纳米结构（Au@Ag NR）按前文描述制备表征。简述：Au NRs平均直径长度15.0±2.5 nm, 66.7±2.5 nm；Au@Ag NRs为26.2±3.0 nm, 72.7±8.9 nm。Ag壳厚度约5 nm。PDDAC包被Au NRs和Au@Ag NRs水分散液zeta电位分别为37.7±1.6 mV和52.5±1.4 mV。制备Au@Ag NR Ag/Au重量比估算为2.3。表征结果见图1。

细胞活力

ATP活力实验检测Au@Ag NR对HepaRG细胞细胞毒性（表1），细胞暴露于0.125-160 µg/mL Au@Ag NR 24或48 h。Au@Ag NR在24 h和48 h暴露后均呈时间和剂量依赖性显著细胞毒性，拟合IC₅₀分别为20 µg/mL和6 µg/mL。考虑整体细胞毒性，处理周期调整为24 h和72 h，浓度定为0.8、4、20 µg/mL。此外，Au NR作为惰性对照，Au NR组Au含量相当于20 µg/mL Au@Ag NR中的16 µg/mL。对照组另设1 mM NAC预处理Au@Ag NR+NAC组（Au@Ag NR浓度20 µg/mL）作氧化应激反应对照。

Au NR和Au@Ag NR细胞分布

ICP-MS分析HepaRG细胞中Au和Ag含量分布（表2、3）。Ag含量随剂量依赖性增加。但抗氧化剂NAC作为自由基清除剂可能限制纳米颗粒细胞摄取，因同浓度Au@Ag NR（20 µg/mL）下该组Ag含量较低。24 h至72 h Ag/Au比值下降表明Au@Ag NR壳持续释放Ag⁺。且细胞摄取Ag远多于Au（表4）。TEM数据显示大多数Au NR和Au@Ag NR以团聚形式滞留细胞内。纳米棒结构清晰可见于暴露Au NR或Au@Ag NR细胞内，未进入细胞核（图2）。

DNA损伤

彗星实验和γ-H2AX实验评估Au@Ag NR诱导DNA损伤（图3）。彗星实验显示0.8-20 µg/mL Au@Ag NR均可显著诱导DNA损伤。24 h或72 h暴露后，细胞尾部DNA百分比和OTM均呈时间和浓度依赖性增加。此外，Fpg酶改良彗星实验观测到20 µg/mL Au@Ag NR处理细胞存在氧化应激相关DNA损伤（图3a,b）。为评估与致癌关联更高的双链断裂程度，分析γ-H2AX阳性细胞比例和γ-H2AX阳性细胞平均荧光强度。24 h暴露后各组γ-H2AX阳性细胞无差异。但72 h处理后4 µg/mL Au@Ag NR组显著增加。所有Au@Ag NR组72 h后荧光强度较对照组显著增加（图3c-e, P<0.05）。

染色体损伤

微核形成是识别染色体损伤的重要生物标志物，较DNA断裂对遗传物质损伤更严重。双核细胞含微核比例评分见图4c。Au@Ag NR呈浓度依赖性增加微核形成。24 h暴露后，4 µg/mL和20 µg/mL Au@Ag NR组微核率分别为1.133±0.145%和1.567±0.318%，均显著高于对照组。72 h暴露后，4 µg/mL组微核率1.767±0.233%显著高于对照组；20 µg/mL组2.167±0.252%显著高于对照组和16 µg/mL Au NR组（0.700±0.153%）。相反，20 µg/mL Au@Ag NR+NAC组与对照组无差异，提示ROS参与Au@Ag NR诱导染色体断裂。

Au@Ag NR对ROS形成影响

为进一步探究ROS形成在Au@Ag NR诱导DNA和染色体损伤中作用，测定MDA、GSH和SOD水平。暴露20 µg/mL Au@Ag NR 24 h和72 h后MDA形成显著增加（P<0.05，图5a）。暴露Au@Ag NR细胞GSH和SOD水平呈时间和浓度依赖性显著降低（P<0.05，图5b,c）。结果提示Au@Ag NR暴露导致氧化抗氧化失衡。

Au@Ag NR对细胞周期和凋亡影响

72 h暴露Au@Ag NR后，4 µg/mL、20 µg/mL Au@Ag NR和Au@Ag NR+NAC组G2/M期细胞比例分别为32.63%±1.77%、32.267%±2.17%、32.967%±4.25%，均显著高于对照组（22.37%±0.92%，图6a,b）。同时，72 h暴露后可观测Au@Ag NR诱导细胞凋亡，20 µg/mL Au@Ag NR和20 µg/mL Au@Ag NR+NAC组晚期凋亡率分别为78.90±1.19%和70.20±4.50%（图6c,d）。Au@Ag NR诱导晚期凋亡多于早期凋亡，NAC处理可减轻Au@Ag NR触发的晚期凋亡率。

Western blot检测p21和p53表达水平，观察到相似模式。4 µg/mL和20 µg/mL Au@Ag NR处理组p53和p21表达显著增加（P<0.05），而20 µg/mL Au@Ag NR+NAC组显著降低（P<0.05，对比20 µg/mL Au@Ag NR组，图6e-h）。已知p53蛋白是响应DNA损伤介导G2/M检查点激活核心分子，p21公认p53依赖性细胞周期抑制因子。因此Au@Ag NR可干扰DNA复制并通过细胞周期阻滞阻碍DNA修复。

讨论

目前释放Ag⁺和AgNPs在产生基因毒性中作用尚不清晰。本团队前期研究及其他研究表明，Ag⁺是引入毒性主要来源，但纳米颗粒本身也可能高毒性。例如AgNPs可通过诱导羟基自由基形成促成基因毒性。与Ag⁺单独相比，AgNPs引入更严重染色体损伤、氧化应激和凋亡，提示可能涉及不同途径。我们用Au@Ag NR模型材料理解AgNPs在细胞中形态分布，ICP-MS测定细胞内Ag和Au含量。制备Au@Ag NR Ag/Au重量比估算2.3。但24 h暴露后Au@Ag NR处理细胞中该比值骤增至16.5，提示大量Ag在24 h内从Au@Ag NR壳快速释放。暴露延长至72 h时Au/Ag重量比降至1.7，表明Ag⁺从细胞释放，纳米棒成为此时细胞内Au@Ag NR主要形式。故可推断Au@Ag NR进入细胞后，Ag⁺在24 h内从壳层快速溶解并逐渐释放至细胞外环境，而Au@Ag NR本身在细胞内滞留更长时期。

氧化应激被视为纳米颗粒最重要毒理学机制之一。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是巯基化合物、粘液溶解剂和L-半胱氨酸前体，可还原谷胱甘肽。NAC也是细胞巯基来源，通过与OH·和H₂O₂相互作用发挥ROS清除活性。本研究中，暴露Au@Ag NR后GSH和SOD水平显著降低，MDA水平呈浓度和时间依赖性增加，表明Au@Ag NR在细胞内引入氧化应激。

通过一系列基因毒性实验进一步探究Ag和Au@Ag NR干扰遗传物质潜力。值得注意的是共培养NAC与Au@Ag NR可改善ROS形成，进而支持氧化应激参与Au@Ag NR触发基因毒性。本研究进行彗星和γ-H2AX实验确认Au@Ag NR可与DNA相互作用诱导DNA损伤，彗星实验中加入修复内切酶Fpg鉴定氧化DNA损伤。Fpg可识别氧化嘧啶并移除氧化嘌呤（如8-羟基鸟嘌呤），在DNA链产生嘌呤缺失或嘧啶缺失位点引入间隙。随后通过另一彗星实验确定氧化应激诱导DNA断裂。Mei等用hOGG1、EndoIII和Fpg内切酶彗星实验观测到5 nm AgNPs诱导氧化损伤特异性DNA损伤。Li等提示PVP包被和二氧化硅包被AgNPs（分别15-100 nm和10-80 nm）在hOGG1和EndoIII存在下显著增加小鼠肝细胞DNA断裂。γ-H2AX焦点形成代表早期细胞对基因毒性应激反应，是检测DSBs最敏感特异生物标志物。本研究显示暴露Au@Ag NR细胞γ-H2AX焦点24 h后显著增加，72 h后进一步增加。20 µg/mL组减少可能因高浓度对HepaRG细胞细胞毒性。不同包被AgNPs也观测到类似结果。结果提示Au@Ag NR可诱导HepaRG细胞染色体损伤，微核率显著增加。这与前期研究一致，AgNPs在HaCaT和TK6细胞中增加微核率。相反，添加氧化自由基清除剂NAC可抑制Au@Ag NR诱导微核形成。综上，这些数据提示氧化应激参与AgNPs在体外引入断裂性风险。

前期研究探讨AgNPs诱导细胞周期阻滞和细胞毒性。随暴露时间延长，AgNPs对细胞周期和凋亡影响可能增强，进而加剧细胞毒性和基因毒性。通常细胞经历DNA损伤时启动细胞周期检查点（如G2/M），防止细胞进入有丝分裂（M期）。G2/M细胞周期阻滞表明越来越多细胞滞留G2期进行DNA修复。成功修复DNA细胞继续进入有丝分裂；但致死损伤细胞发生不可逆G2/M阻滞和细胞凋亡。我们观测到Au@Ag NR可阻滞大多数HepaRG细胞于G2/M期，诱导晚期凋亡并增加p53和p21表达，这两者是细胞周期调节相关重要蛋白。p53在DNA无法正常修复时也可诱导凋亡，p21可能通过p53依赖途径下调核蛋白ICBP90参与DNA复制和细胞周期调节，间接参与细胞凋亡。此外，大蒜提取物给药后HepG2细胞通过p53/p21系统激活诱导凋亡和G2/M阻滞也有报道。因此可推断氧化应激触发的DNA/染色体损伤可能促进p53和p21表达，进而诱导细胞周期阻滞。延长Au@Ag NRs对DNA/染色体复制期间暴露可能进一步加剧基因毒性或凋亡。

结论

AgNPs诱导基因毒性可归因于纳米颗粒诱导氧化应激及释放离子。本研究用Au@Ag NR模型确定纳米颗粒进入细胞后Ag分布和释放行为。考虑细胞内Au@Ag NR不同形式，暴露后Ag⁺从银壳快速溶解。Ag⁺和Au@Ag NR均可在细胞内引入细胞毒性和基因毒性（断裂性），滞留细胞核中Au@Ag NR可能进一步释放Ag⁺加剧损伤，主要由细胞周期阻滞和ROS形成引起（总结见图7）。综上，这些数据揭示了细胞内积累、Ag⁺释放及AgNPs潜在基因毒性间相关性。