荧光新糖蛋白金纳米团簇：合成及在植物凝集素传感和细胞成像中的应用

介绍

由十到一百个金原子形成的金纳米团簇 (AuNC) 因其有吸引力的化学和物理特性而受到科学界的关注 [1]。小于 3 nm 的金纳米团簇接近电子的费米波长，从而产生与尺寸相关的荧光发射，并为体外和体内应用提供了作为传感和成像探针的机会 [2,3,4]。当前的荧光检测主要涉及有机染料，如罗丹明或荧光素，或者不太常见的量子点 [5,6,7]。然而，由于某些有机染料的光化学稳定性低、pH 敏感荧光或水溶性差以及量子点的毒性，它们的使用可能会受到影响 [8]。在这种情况下，金纳米团簇可以被认为是替代的超小荧光团，没有上述限制。此外，AuNCs 具有较大的斯托克斯位移和从红色可见光到近红外 (IR) 区域的荧光发射波长，这在生物成像中非常有利，因为它与组织透明窗口重叠 [8,9,10]。

2009 年首次报道了使用牛血清白蛋白 (BSA) [11] 的蛋白质辅助合成金纳米团簇，此后，水溶性蛋白质保护的纳米团簇已成为纳米科学的新兴趋势 [9, 12, 13]。对于用于制备 AuNCs 的糖蛋白 [14] 的关注要少得多，我们不知道有任何报告描述了从合成的新糖蛋白作为支架形成 AuNCs。通常，糖基化调节糖蛋白的理化特性，例如折叠、循环寿命或稳定性。它还影响蛋白质的重要​​生物学功能，例如受体-配体识别。因此，通过精心设计和表征的碳水化合物的化学附着，从蛋白质中生成合成新糖蛋白 [15]，可以为它们提供用于生物学应用的新功能特性。由于碳水化合物通过与碳水化合物结合蛋白的相互作用参与了大量不同的生物过程 [16, 17]，我们设想新糖蛋白金纳米团簇作为新的探针来研究和利用体外和体内的碳水化合物识别事件 [18]。在这方面，蛋白质表面多聚糖拷贝的存在提供了碳水化合物的多价呈现，随后增强了结合亲和力。

在这里，我们探索使用自发荧光的新糖蛋白功能化的 AuNC 作为植物凝集素的传感探针和作为树突细胞 (DC) 体外成像的凝集素受体的靶向试剂。凝集素是碳水化合物结合蛋白，有助于不同的生物识别现象。例如，在高等植物中，凝集素通过识别和凝集外来糖蛋白，抑制它们的生长和繁殖来防止食植物生物 [19]。另一方面，在哺乳动物 DC 中，C 型凝集素受体 (CLR) 在细胞表面表达，在病原体识别中起主要作用 [20]。聚糖修饰的抗原被特定的 CLR 识别，进一步被内吞、加工并最终呈递给 T 细胞，从而诱导特定的免疫反应。在我们之前的研究中，我们表明 [21] 模型抗原卵清蛋白 (OVA) 的功能化以及终止 N-聚糖 G0 的合成双天线 GlcNAc 增强了对 DC 的靶向以及随后的抗原摄取和呈递。我们假设上述现象是由 G0 聚糖和 DC 表面表达的内吞 C 型凝集素受体的相互作用引发的。因此，我们相信荧光和多价 G0-OVA 金纳米团簇可以替代我们之前研究中应用的荧光标记 G0-OVA，并可用作 DC 可视化的新工具。此外，聚糖介导的 DC 靶向能够启动强 T 细胞免疫反应，可用于增强候选疫苗的功效 [22,23,24]。在这项初步研究中，我们将展示从新糖蛋白开始合成金纳米团簇，以及使用凝集素凝集实验评估 G0 聚糖的功能和可及性。最后，我们将展示荧光金纳米团簇在树突细胞成像中的潜力。

结果与讨论

我们根据之前使用未结合 OVA 蛋白的报告优化了用 G0 聚糖 (G0-OVA-AuNCs) 修饰的卵清蛋白金纳米团簇的合成 [25, 26]。通过加入金四氯金酸 (HAuCl4 ^. ) 制备了蛋白质保护的 AuNCs。 3H2O) 到蛋白质溶液，然后是 1 M 氢氧化钠水溶液。反应 pH 值的增加增强了 OVA 中存在的色氨酸和酪氨酸残基的还原潜力（图 1a）[14]。蛋白质支架充当还原剂和稳定剂，将小的金簇捕获在蛋白质结构内并将其与环境隔离。以前用于合成荧光 OVA-AuNCs 的方案需要非常高浓度的 OVA 溶液（高达 65 mg mL ⁻¹ ) [25]。为了限制使用有价值的 OVA 新糖缀合物制备 AuNCs，我们确定了可以有效生产 OVA-AuNCs 的未结合 OVA 的最小量。我们发现 OVA 浓度为 15 mg mL ⁻¹ 足以产生具有强荧光发射的簇（附加文件 1：图 S1）。微波辐射显着加速了 OVA-AuNCs 的形成，将反应时间从 18 小时缩短到 6 分钟 [25]。此外，微波辐射为溶液提供均匀加热，有利于形成均匀和单分散的簇 [1]。以这种方式制备的 OVA-AuNCs 在紫外光照射下呈现浅棕色并发出强烈的红色荧光（图 1b）。 OVA-AuNCs 的 UV-Vis 光谱缺乏与局部表面等离子体共振带相对应的吸光度，表明不存在大于 5 nm 的金纳米粒子 [27]，这通过透射电子显微镜 (TEM) 得到进一步证实。我们测量了 OVA-AuNCs 金核的平均直径，范围为 1.9 ± 0.7 nm（附加文件 1：图 S2）。最后，OVA-AuNCs 的平均流体动力学尺寸为 8.7 nm ± 2.5 nm，这是通过动态光散射指定的（附加文件 1：图 S2）。它的大小范围与 OVA（直径 6.5-7 nm [28]）相似，表明每个金核存在一个蛋白质分子。通过琼脂糖凝胶电泳进一步分析 OVA-AuNCs 显示 OVA 和 OVA-AuNCs 向正极的相似迁移率，这进一步证实了两种物质的相似大小及其在中性 pH 下的负电荷（图 1c）。 OVA-AuNCs 的荧光发射光谱在 350 nm 激发时在 λ 670 nm 处显示最大发射峰（图 1d）。 AuNCs 的激发光谱很宽，斯托克斯位移很大（超过 200 nm），非常适用于存在另一个具有相似激发波长的荧光探针（多路复用）的光谱多色检测应用，例如蓝色发射 Alexa Fluor® 405 染料[26]。当荧光素在 0.1 M NaOH 中（QY =≈ 92%）用作参考标准时，计算出 OVA-AuNCs 的量子产率 (QY) ≈ 4% [29]。基于 X 射线光电子能谱 (XPS) 测量（附加文件 1：图 S3）[11, 30]，金核的氧化态被指定为 Au(I) 和 Au(0) 物种的混合物。对蛋白质二级结构圆二色性 (CD) 的研究表明，无规卷曲组织表明 AuNC 中 OVA 的天然折叠丢失，这可能是由于合成过程中的恶劣碱性条件所致（附加文件 1：图 S4）[31]。最后，我们还观察到 OVA-AuNCs 在广泛的 pH 值（3-11）范围内以及在含有胎牛血清（FBS）的溶液中具有非凡的稳定性，胎牛血清是体外细胞培养最常用的血清补充剂（附加文件 1：图 S5）。 OVA 金纳米团簇的这一特性突出了它们在体外和体内生物测定中的实用性，并开辟了令人兴奋的新应用。例如，OVA-AuNCs 的 pH 不敏感荧光发射可以允许在细胞内进行有效的粒子追踪，即使在以微酸性 pH 为特征的内体隔室内也不会丢失信号[32, 33]。相反，在这些条件下，某些荧光素偶联物的使用可能会受到影响，因为这些染料的最大荧光发射是在碱性 pH 值下实现的。 OVA-AuNCs 在水和细胞生长培养基中也表现出极好的溶解性。观察到 OVA-AuNCs 在水和细胞生长培养基中完全溶解，浓度高达 40 mg/mL。 （附加文件 1：图 S6）。测量了不同 OVA-AuNCs 稀释度的荧光发射光谱，并探测到在 37°C 孵育 24 小时后是稳定的。

一 OVA-AuNCs 合成的示意图。 b OVA（蓝线）和 OVA-AuNC（橙线）的紫外-可见光谱。插入：OVA-AuNCs 的图像 (a ) 和 OVA (b ) 在可见光照射下（左）和在紫外光照射下（365 nm）（右）。 c OVA（用考马斯蓝 G-250 染色）和 OVA-AuNCs（在紫外光照射下）的琼脂糖凝胶电泳。 d OVA-AuNCs的荧光激发（绿线）和发射（粉线）光谱

为了合成 G0-OVA 新糖蛋白保护的 AuNC，我们最初制备了 G0 功能化的 OVA 新糖蛋白。配备有 C5 氨基接头的双天线 N-聚糖 G0 如前所述 [34] 合成，并使用二琥珀酰亚胺辛二酸酯 (DSS) 作为交联剂实现与 OVA 的缀合（图 2a）[21, 35]。简而言之，缀合在两步反应中进行：N-聚糖 G0 用 13 倍过量的 DSS 接头进行功能化，然后与 OVA 上的游离氨基偶联。通过控制聚糖/蛋白质比例，我们可以有效地调整 OVA 取代的程度（参见 SI）。新糖蛋白的成功形成通过 SDS-PAGE 凝胶上出现的扩散电泳较慢的迁移带得到证实（图 2b），而引入的聚糖的平均数量由 MALDI-TOF 质谱法进一步确定 [21]（图 2b） . 2c)。按照这种策略，我们生产了 OVA 新糖缀合物，每个蛋白质显示 2-3、3-4 和 5-6 个 N-聚糖 G0 拷贝。

一 G0-OVA 新糖缀合物的合成 (n =价）。 b 含有不同价态 N-聚糖 G0 的 OVA 和 G0-OVA 新糖蛋白的 SDS-PAGE 凝胶电泳。 c 含不同价态N-聚糖G0的OVA和G0-OVA新糖蛋白的MALDI-TOF质谱图

接下来，我们在先前优化的条件下使用合成的新糖蛋白制备 AuNC（图 3a），并研究了聚糖功能化及其化合价对簇的物理和光学性质的影响。如图 3 所示，G0-OVA-AuNCs 的吸收 UV-Vis 和荧光发射与 OVA-AuNCs 相同，特征吸收在 278 nm，红色荧光发射在 670 nm 附近最大（图 3b，c）。

一 G0 聚糖衍生的 OVA-AuNCs 合成的示意图。 b G0-OVA-AuNCs（蓝色、橙色和绿色线）与 OVA-AuNCs（粉红色线）的荧光发射光谱。 c G0-OVA-AuNC（蓝、橙、绿线）和OVA-AuNC（粉线）的紫外可见光谱

此外，通过 TEM 测量，我们确定 G0-OVA-AuNCs 核心的平均直径为 1.6 ± 0.5 nm（图 4），这与 OVA-AuNCs 的大小相当（1.9 ± 0.7 nm）。因此，根据我们的结果，我们认为通过赖氨酸残基或 N 末端与 OVA 缀合的聚糖不会影响糖蛋白的整体还原电位和在测试的价态下进一步形成簇 [36]。此外，糖似乎不会妨碍蛋白质和金核的半胱氨酸基团之间形成簇稳定金 (I) 硫醇盐聚合物 [37, 38]，即使存在数量较多（5-6 个拷贝）。

G0-OVA-AuNCs (3/4) 的 TEM 图像。插入：G0-OVA-AuNCs（3/4）金核直径的尺寸分布

最后，以与 OVA-AuNCs 类似的方式，G0-OVA-AuNCs (3/4) 蛋白质的二级结构由 CD 分配并显示随机卷曲组织（附加文件 1：图 S4）。然而，通过将聚糖附着到 AuNCs 的蛋白质支架上，我们引入了能够与碳水化合物结合蛋白相互作用的靶向分子，同时，OVA 蛋白仅作为载体，其构象变化不会改变凝集素识别整个系统。已经描述了变性 OVA 在小鼠中产生抗体 [39] 和 T 细胞活化中的抗原能力。 T 细胞的激活与抗原二级结构无关，因为它是通过识别天然和变性 OVA 中存在的某些氨基酸序列来介导的 [40]。事实上，抗原 OVA 323-339 肽是对 OVA 的主要特异性 T 细胞反应，该肽已被用于纳米颗粒中以诱导免疫反应 [41]。

为了研究新糖蛋白保护的金纳米簇上新引入的聚糖链的功能，我们在凝集实验中检查了它们与不同植物凝集素的相互作用。我们将 G0-OVA-AuNCs 和 OVA-AuNCs 与两种不同的植物凝集素、对末端 GlcNAc 部分和 Solanum tuberosum 特异的 Bandeiraea simplicifolia 凝集素-II (BSL-II) 进行孵育 凝集素 (STL)，识别 N-聚糖中存在的核心壳二糖 [34, 42]。此外，为了丢弃 G0-OVA-AuNCs 和凝集素之间的任何非特异性相互作用，Aleuria aurantia L-岩藻糖特异性凝集素（AAL）作为对照。我们在 G0-OVA-AuNCs (5/6) 溶液中添加了越来越浓度的 BSL-II、STL 和 AAL 凝集素。在黑暗中孵育后，将溶液离心并测量上清液的荧光。如图 5 所示，在与 BSL-II 和 STL 孵育后，我们可以观察到荧光强度以浓度依赖性方式降低（图 5a-d），而在 AAL 存在下荧光强度保持不变（图 5a-d） . 5e)。在 G0-OVA-AuNCs (5/6) 与 STL 孵育后，在紫外灯照射下观察到可见沉淀，而与 AAL 孵育后没有出现沉淀（图 5f）。凝集素孵育后初始荧光值 (F0) 与最终值 (F) 的关系代表凝集素浓度的增加（图 5b、d）。 STL 与 G0-OVA-AuNCs (5/6) 的相互作用显示出 0 到 7.5 μM 的线性，检测限根据等式 SD*3/S 计算（其中 SD 是校准曲线的标准偏差，S 是斜率值) [12, 13] 为 2.35 μM (y =1.95x + 0.4266, R ² =0.97)。以同样的方式，BSL-II 与 G0-OVA-AuNCs (5/6) 的相互作用显示出 0 到 10 μM 的线性，计算出的检测限 (LOD) 为 2.83 μM (y =0.5687x + 0.5838, R ² =0.965)。有趣的是，在添加 BSL-II 和 STL 后，含有较少数量共轭糖的簇，如 G0-OVA-AuNCs (2/3)（附加文件 1：图 S7，AB）没有显示荧光强度的任何显着变化，表明缺乏凝集。这种行为突出了聚糖的多价呈现对凝集素交联活性的重要影响，即使仅应用了聚糖密度的微小差异。重要的是，未观察到与凝集素孵育的未结合 OVA-AuNCs 的荧光发射强度发生变化（附加文件 1：图 S7，C-D）。尽管天然鸡 OVA 包含一个 N-连接糖基化位点 (Asn-292)，主要被高甘露糖或较少丰度的杂种和复合型 N-聚糖取代 [43]，但 STL 和 BSL-II 都无法识别这种糖修饰，可能是由于单价呈现。这证实了在 G0-OVA-AuNCs 上化学引入的 G0 和 STL/BSL-II 之间存在特定的碳水化合物-凝集素相互作用，并排除了 OVA-AuNCs 与凝集素的非特异性结合。我们设想该系统可能应用于检测碳水化合物结合蛋白生物标志物。尽管如此，制备显示高聚糖拷贝数的新糖蛋白会增加构建体对所需凝集素的亲合力，从而提高检测限[44]。

G0-OVA-AuNCs 的凝集素凝集测定 (5/6)。 一 与 BSL-II 孵育后 OVA-G0 (5/6)-AuNCs 溶液上清液的代表性荧光光谱。 b F0/F 代表 BSL-II 浓度增加。 c 与 STL 孵育后 OVA-G0 (5/6)-AuNCs 溶液上清液的代表性荧光光谱。 d F0/F 代表 STL 浓度增加。 e 与 AAL 孵育后 OVA-G0 (5/6)-AuNCs 上清液的代表性荧光光谱。 f 对应于 G0-OVA-AuNCs (5/6) 与 AAL 和 STL 在紫外光照射 (365 nm) 下孵育的图像。与 STL 孵育后，形成了可见的沉淀物。右侧：G0-OVA-AuNCs与植物凝集素结合示意图

我们还研究了 G0-OVA-AuNCs (5/6) 与 STL 在细胞生长培养基存在下的相互作用，以区分培养基成分在碳水化合物蛋白质相互作用中的可能影响。将 G0-OVA-AuNCs (5/6) 溶解在补充有胎牛血清的完全 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM) 中，并与越来越多的 STL 一起孵育；通过琼脂糖凝胶电泳分析所得溶液。 （附加文件 1：图 S8）。 G0-OVA-AuNCs (5/6) 的电泳迁移率在水中和复杂介质中均保持不变。然而，在 STL 数量增加的情况下，G0-OVA-AuNCs (5/6) 向负极发生剂量依赖性置换，突出蛋白质碳水化合物相互作用，即使在存在复杂细胞介质的情况下。这表明蛋白质碳水化合物与 G0-OVA-AuNCs (5/6) 的相互作用不受培养基成分的影响。

荧光成像簇的潜力和之前 G0-OVA 新糖蛋白靶向 DCs 的成功 [21] 鼓励我们研究 G0-OVA-AuNCs 在体外小鼠 DCs 的摄取。我们采用共聚焦荧光显微镜来可视化自发荧光 G0-OVA-AuNCs (3/4) 的内化。从 C57BL/6J 小鼠和 CD11c ⁺ 中分离出脾 DCs 通过磁激活细胞分选 (MACS)（附加文件 1：图 S9）纯化群体，并在聚 d-赖氨酸涂层的玻璃盖玻片上播种过夜。作为概念证明，纯化的 DCs 与 G0-OVA-AuNCs (3/4) 一起孵育，洗涤以去除未结合的材料，然后固定。孵育 40 分钟后，获得共聚焦荧光显微镜图像（图 6），我们观察到与 G0-OVA-AuNCs (3/4) 一起孵育的树突细胞的强荧光，证明它们有效内化（图 6a）并且缺乏荧光在阴性对照中（未受刺激的 CD11 ⁺ 细胞;附加文件 1：图 S9）。通过堆叠沿其 Z 拍摄的单个 DC 图像进一步证实了纳米团簇的内化 -axis (z-stack) 并通过重建单个 DC 的 3D 图像来可视化来自细胞内部的荧光发射（图 6b 和附加文件 1：图 S10）。

通过共聚焦显微镜测量的鼠 DCs 对 G0-OVA-AuNCs (3/4) 的吸收。 一 CD11c ⁺ 的代表性图像 与 G0-OVA-AuNCs (3/4) 孵育后的细胞。 b 单个树突状细胞的 Z-stack 图像代表细胞内 G0-OVA-AuNCs 的摄取

总之，我们已经制备并表征了新糖蛋白保护的金纳米团簇，这些纳米团簇已用于凝集实验和 DCs 摄取测定。在特定植物凝集素传感的例子中，我们已经证明了 G0-OVA-AuNCs 在分析碳水化合物-蛋白质相互作用方面的效用。我们还通过荧光显微镜显示了树突细胞的体外成像。然而，必须进行进一步的实验，首先更好地了解聚糖在 DCs 吸收纳米团簇中的作用（例如，通过跟踪纳米团簇在细胞隔室中的定位），其次，研究它们的生物相容性和细胞相容性。基于我们之前描述 G0 聚糖的靶向特性和 DCs 与未结合 OVA 相比增加 G0-OVA 摄取的结果，我们相信 G0-OVA-AuNCs 可能成为荧光标记的新糖蛋白的有吸引力的替代品。

结论

总之，在这项初步研究中，我们首次合成了新糖蛋白保护的金纳米团簇，并评估了与未结合的蛋白质团簇相比的物理和光学特性。我们通过与植物凝集素的特异性相互作用证实了凝集测定中 AuNC 上糖 G0 的可及性，这另外强调了最小聚糖密度对于凝集素有效交联活性的重要性。作为概念证明，我们还证明了 G0-OVA-AuNCs 在模型鼠 DCs 成像中的适用性。

我们相信自发荧光的新糖蛋白功能化的 AuNCs 可以成为分析和应用碳水化合物-蛋白质相互作用的有吸引力的工具。基于其独特的物理和化学性质，例如大斯托克斯位移、水溶性或 pH 稳定性，G0-OVA-AuNCs 可以成为有机染料标记的替代品，并用于 DCs 可视化、碳水化合物介导的摄取研究和植物凝集素感应。最后，通过使用像 OVA 这样的免疫原性载体来连接聚糖，新糖蛋白功能化的金纳米团簇不仅可以深入研究抗原摄取、加工和呈递，而且在未来，还可以作为荧光疗法或佐剂分子。

方法/实验

材料

所有溶液均在来自 Diamond UV 水净化系统（Branstead International，IA，Madrid，Spain）的纳米纯水（18 MΩ cm）中制备。用于制备 AuNCs 的所有玻璃器皿都事先用王水溶液（HNO3:HCl, 1:3, v /v ) 并用纳米纯水彻底冲洗。三水氯化金 (III)、氢氧化钠和三乙胺购自 Sigma Aldrich。不含 LPS 的卵清蛋白购自 Hyglos (Bernried, Germany)。二琥珀酰亚胺辛二酸酯 (DSS) 和 DMSO 购自 Thermo Fisher Scientific。 N-聚糖G0的化学合成如前所述[21]。

AuNCs 合成。一般程序

搅拌的 OVA 或新糖蛋白溶液 (15 mg mL ⁻¹ ) 在纳米纯水中，逐滴加入 0.1 M HAuCl4·3H2O（4.2 mM，最终浓度）的水溶液。将所得混合物在室温下搅拌 5 分钟并逐滴加入 1 M NaOH 水溶液（150 mM 最终浓度）以增加混合物的 pH 值。将所得溶液在 Biotage® Initiator 微波反应器中在 100°C 下孵育 6 分钟。 AuNC 的透析是在来自 Thermo Fisher Scientific 的 Slide-Z-lyser TM 透析盒（10 K MWCO）上通过纳米纯水进行的。

合成的 OVA 和新糖蛋白保护的 AuNC 的荧光发射光谱使用 Nunc™ 96 孔聚苯乙烯黑板在 Varioskan Flash 酶标仪（Thermo Scientific）上测量，激发波长为 λ 350 nm，使用 ScanIt 软件操作。

OVA-AuNC 和 OVA 蛋白的琼脂糖凝胶电泳在 0.75% 琼脂糖凝胶中以 80 V 进行 30 分钟。在紫外光照射（365 nm）下观察 OVA 保护的 AuNC，并用考马斯蓝 G-250 染色 OVA 蛋白。

TEM 成像在 JOEL JEM-2100F 场发射 TEM 上进行，加速电压为 200 kV。将 AuNCs 溶液滴铸到涂有超薄碳载体（Ted Pella，Redding，USA）的铜 TEM 网格上。使用ImageJ（Java）对金纳米团簇的平均直径进行量化。

G0-OVA-AuNCs (5/6) 与植物凝集素的培养

10 微升 G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL ⁻¹ ] 在 TSM 缓冲液（20 mM Tris·HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl 2 、2 mM MgCl 2 ，pH =7.4）中的溶液置于 Nunc™ 384 孔聚苯乙烯黑色平板上。随后，10 μL Aleuria aurantia 凝集素（AAL），马铃薯 添加 TSM 缓冲液中的凝集素 (STL) 和 Bandeiraea simplicifolia 凝集素-II (BSL-II)，导致最终蛋白质浓度为 0、2.5、5、7.5、10 μM。相应的溶液在黑暗中轻轻摇动孵育过夜。蛋白质溶液以 11,000 g 离心 1 小时，上清液的荧光发射光谱用 Varioskan Flash 酶标仪（Thermo Scientific）记录，激发波长为 350 nm。为了观察 AuNCs-凝集素复合物形成时的沉淀，进行了对照实验。然后，10 μL G0-OVA-AuNCs (5/6) [0.2 mg mL ⁻¹ ] 与 10 μL AAL 和 STL [40 μM] 一起孵育 1 小时，然后以 11,000 克（1 小时）离心。图像是在紫外线照射 (365 nm) 下拍摄的。

小鼠脾树突状细胞的分离

所有实验中使用的鼠树突细胞是从 Charles River (CIC biomaGUNE, San Sebastian, Spain) 饲养的 C57BL/6J 小鼠中分离出来的。动物实验方案经 CIC biomaGUNE 动物伦理委员会批准，并按照欧盟关于动物伦理和福利的 ARRIVE 指南和指令进行。小鼠被饲养在常规饲养条件下（22 ± 2°C，55 ± 10% 湿度，12 小时昼夜循环），并随意喂食标准饮食。 小鼠用2.5%异氟醚100% O2麻醉，颈椎脱臼处死。

脾脏取自 C57BL/6J 小鼠 (n =3，雌性，27-28 周大）。为了分离脾细胞，用补充有 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 10% 胎牛血清（FCS；PAN Biotech）的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM) 冲洗脾脏。细胞悬液保持低温并通过 40 μm 细胞过滤器过滤以去除细胞聚集体。离心（300 g，5 分钟，4°C）后，将细胞沉淀重悬在 5 mL 新鲜制备的红细胞裂解缓冲液（10% 100 mM Tris pH 7.5 + 90% 160 mM NH4Cl）中，轻轻混合，并在室温下孵育2 分钟。细胞在完全 IMDM 培养基中洗涤两次并离心，然后再悬浮在 MACS 缓冲液（PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA）中。树突状细胞 (CD11c ⁺ 通过使用 CD11c ⁺ 的磁激活细胞分选从 C57BL/6 鼠脾细胞悬浮液中分离细胞） 微珠 (Miltenyi)。将用磁性微珠培养的细胞加载到置于磁场中的 MACS 柱上。未结合的细胞通过柱子，而剩余的 CD11c ⁺ 细胞用 MACS 缓冲液洗涤并从柱上洗脱。 To increase DC purity, the CD11c ⁺ cell purification was repeated. The cell suspension was centrifuged, resuspended in IMDM complete medium, and counted.

Uptake of G0-OVA-AuNCs (3/4) by DCs

CD11c ⁺ cells from C57BL/6J mice (2 × 10 ⁶ cells) were seeded on poly-d-lysine-coated glass cover-slips overnight. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL ⁻¹ ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.

缩写

AAL:

Aleuria aurantia lectin

AuNCs:

Gold nanoclusters

BSA:

牛血清白蛋白

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia lectin-II

CD:

Circular dichroism

CLRs:

C-type lectin receptors

DCs:

Dendritic cells

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DSS:

Disuccinimidyl suberate ester

FBS：

胎牛血清

G0:

Biantennary N-glycan

G0-OVA-AuNCs:

Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters

HAuCl4 ^. 3H2O:

Gold tetrachloroauric (III) acid

IMDM:

Iscove’s modified Dulbecco’s medium

IR：

红外线

LOD:

Limit of detection

MACS:

Magnetic-activated cell separation

OVA:

Ovalbumin

QY：

量子产率

STL:

Solanum tuberosum lectin

TEM：

透射电子显微镜

XPS：

X射线光电子能谱