新型糖蛋白功能化荧光金纳米簇用于植物凝集素检测与树突状细胞成像

摘要

糖-蛋白相互作用支撑受精、信号转导、宿主-病原体通讯等基本生物过程。糖基识别的复杂性要求先进分析工具。本文首次报道合成新型糖蛋白功能化荧光金纳米簇（G0-OVA-AuNCs），结合生物触角N-糖基（G0）作靶向配体、卵白蛋白作载体蛋白、自发光金核心。证明G0-OVA-AuNCs可作为植物凝集素的选择性传感器，并作为小鼠树突状细胞成像的高效探针。

引言

金纳米簇（AuNCs）由10-100个金原子组成，呈尺寸依赖性荧光，适合生物传感和成像。区别于传统有机染料或量子点，AuNCs具大斯托克斯位移、红光至近红外发射、优异光化学稳定性，可在组织透明窗口应用。蛋白模板AuNCs始于2009年牛血清白蛋白，已成为设计水溶性、生物相容性荧光团的多功能平台。然而，糖基化蛋白作为纳米簇支架仍未被充分探索，尽管糖基在调节蛋白折叠、稳定性和受体结合中起关键作用。合成新糖蛋白——蛋白共价连接定义糖基——提供策略赋予蛋白新功能性质同时保持结构完整性。

本研究利用合成生物触角G0糖基，经C5氨基连接戊二酸二琥珀酸酯（DSS）偶联卵白蛋白（OVA），制备G0-OVA-AuNCs。考察其理化特性，通过凝集素凝集实验评估糖基可及性，体外评价其标记树突状细胞（DCs）能力。结果确立G0-OVA-AuNCs作为稳健、多价凝集素传感器和免疫细胞成像高效探针的地位。

结果与讨论

我们通过改良非偶联OVA-AuNCs方案优化G0-OVA-AuNCs合成。15 mg mL⁻¹ OVA溶液与HAuCl₄·3H₂O（4.2 mM）和NaOH（150 mM）混合，微波辐照（100 °C，6 min），得淡褐色簇，350 nm激发下发亮红光（670 nm）。UV-Vis光谱无表面等离子共振带，确认粒径<5 nm；TEM显示平均核心直径1.9±0.7 nm，动态光散射测得流体动力学直径8.7±2.5 nm，符合单个蛋白包裹核心。量子产率~4%，pH 3-11和胎牛血清中光稳定，适合生物实验。

G0功能化簇制备：G0糖基经DSS偶联OVA，得新糖蛋白，每蛋白含2-3、3-4或5-6个糖基（SDS-PAGE和MALDI-TOF验证）。同条件下生成AuNCs得G0-OVA-AuNCs，光学性质与OVA-AuNCs匹配：278 nm吸收、670 nm发射峰。TEM确认核心直径1.6±0.5 nm。圆二色谱显示随机卷曲二级结构，可能因碱性合成，但糖基部分保持可及性供凝集素结合。

简豆凝集素-II（BSL-II）和马铃薯凝集素（STL）凝集实验显示，G0-OVA-AuNCs（5/6）呈浓度依赖性荧光猝灭，对照凝集素（Aleuria aurantia，AAL）无效应。猝灭遵循线性标定曲线，检测限分别为2.83 µM（BSL-II）和2.35 µM（STL）。糖基较少（2/3）的G0-OVA-AuNCs不凝集，凸显多价糖基呈现的必要性。细胞培养基中琼脂糖凝胶电泳确认凝集素结合在复杂生物环境中仍高效。

共聚焦显微镜观察小鼠脾源DCs（CD11c⁺）孵育G0-OVA-AuNCs（3/4）后，40 min内快速内化，荧光定位于细胞内，未处理对照无荧光。三维重构确认簇胞内分布。

总之，我们首次呈现新糖蛋白保护的AuNCs，展示其通过多价糖基实现选择性凝集素识别，并确立其成像树突状细胞的能力。其稳健荧光、水溶性、pH稳定性使其成为常规染料在糖-蛋白相互作用研究和免疫成像中极具前景的替代品。

结论

我们成功合成表征G0-OVA-AuNCs，确认糖基可及性和凝集素特异性凝集。多价糖基呈现对高效交联至关重要，簇保持高光稳定性和水溶性。小鼠树突状细胞体外成像验证其作为高效自荧光探针。这些发现支持进一步探索新糖蛋白功能化AuNCs作为糖-蛋白相互作用分析、免疫细胞成像及潜在治疗应用的多功能工具。

实验方法

材料

所有溶液用超纯水（18 MΩ·cm）配制。金(III)氯化物三水合物、NaOH、三乙胺购自Sigma-Aldrich。卵白蛋白购自Hyglos。DSS和DMSO购自Thermo Fisher。G0糖基按前文合成。

AuNCs合成通用步骤

15 mg mL⁻¹蛋白超纯水溶液混合4.2 mM HAuCl₄·3H₂O，搅拌5 min，加入150 mM NaOH。混合物微波反应器100 °C加热6 min。透析（10 kDa截留）对超纯水。Varioskan Flash酶标仪记录荧光（λ_ex=350 nm）。琼脂糖凝胶（0.75%）和TEM（200 kV）表征尺寸。圆二色谱测二级结构。XPS测金氧化态。