杯状细胞介导的金属纳米颗粒体内清除：中药诱导腹泻加速的体内途径

摘要

尽管金属纳米颗粒在医学中得到广泛应用，但其体内清除机制仍知之甚少。本研究证实，肠道杯状细胞（GCs）和胃壁细胞（PCs）能主动转运多种金属纳米颗粒——三角银纳米板、磁性纳米颗粒、金纳米棒和金纳米簇——进入肠腔，随粪便排出。利用胆总管（CBD）结扎小鼠模型阻断肝胆途径，我们发现这些纳米颗粒在整个肠道的杯状细胞内积聚，且三角银纳米板和金纳米棒也在壁细胞内积聚。肠道组织未观察到病理改变。此外，中药提取物诱导的腹泻模型中，杯状细胞和壁细胞分泌纳米颗粒的速率显著增强，提示胃肠道蠕动对纳米颗粒排泄具有调节作用。这些发现揭示了一条此前未被认识的清除途径，可为纳米颗粒制剂的安全设计提供依据。

引言

纳米技术已迅速拓展至药物、诊断和工业应用，但工程纳米结构的健康与环境风险仍未完全界定。纳米毒理学作为一门多学科交叉领域，旨在绘制纳米颗粒与生物系统的相互作用图谱，评估潜在危害，并制定安全准则[1–3]。金属纳米颗粒——如金、银、磁性及量子点等——因其光学、磁性和催化特性备受关注，可实现靶向成像、光热治疗和药物递送[4–10]。然而，赋予这些材料功能的理化特性也阻碍了其生物降解和清除；多数粒径大于~5 nm的颗粒无法经肾小球滤除，而较大聚集体则滞留于肝、脾或肺组织[11–12]。因此，阐明机体如何清除这些颗粒对治疗安全性和风险评估至关重要。

目前对体内清除途径的认识尚显零散。肝胆系统（HBS）将肾脏无法降解的颗粒输送至粪便，而肾-尿路处理5 nm以下的微小颗粒[16,21,22]。但这两条途径对许多金属纳米颗粒的清除效率有限，促使研究者探索替代机制。近期研究提示肠壁可作为排泄途径：二氧化硅纳米颗粒在小鼠肠黏膜和粪便中积聚；鱼类实验中较大颗粒（达500 nm）清除更快，表明肝胆非唯一路径[20,23]。

肠道杯状细胞（GCs）是分布于全肠道的极性粘液分泌上皮细胞，可抵御机械和化学损伤[24–26]。既往工作显示GCs可内化纳米颗粒，静脉注射的颗粒可在GCs中检出，但该过程的动力学和范围尚未深入探讨[27–28]。本研究旨在阐明杯状细胞——以及在较小程度上胃壁细胞（PCs）——在一组典型金属纳米颗粒排泄中的作用，并评估由中药诱导腹泻模型调控的胃肠动力如何影响该途径。

材料与方法

三角银纳米板的合成与表征

三角银纳米板遵循Mirkin等人的方案合成，略作调整[29,30]。简述：室温下混合AgNO₃（0.1 mM，100 mL）、三钠柠檬酸（30 mM，6 mL）、PVP（30 kDa，0.7 mM，6 mL）及240 µL H₂O₂（30 wt%）。剧烈搅拌后快速加入0.8 mL新配制的0.1 M NaBH₄，所得黄色溶液在光照下5 h内转蓝。最终悬浮液4 ℃保存。

UV-vis光谱（200–950 nm，狭缝2 nm）用Shimadzu UV-3600记录。TEM成像（JEOL JEM-200CX）确认单分散三角形颗粒，平均边长44.3 nm（图1b）。648.5 nm处的特征等离子体峰证实三角形态合成成功[36]。

胆总管结扎动物模型构建

雌性Wistar大鼠（180–220 g）和昆明小鼠（20–22 g）购自上海SLAC实验动物有限公司。所有操作经上海交通大学实验动物伦理委员会批准（No.SYXK2007-0025）。参照Lee法结扎胆总管（CBD）[34]。小鼠戊巴比妥麻醉（25 mg kg⁻¹），正中切开腹部，游离胆总管，置入两根0.2 mm尼龙线结扎并切断。术后第14天测定血清胆红素和AST，确认胆汁淤积（图2e）。

纳米颗粒注射

确认结扎成功后，12只小鼠随机分为四组实验组（三角银纳米板、磁性纳米颗粒、金纳米棒、金纳米簇）及生理盐水对照组。纳米颗粒悬浮液浓度550 µg mL⁻¹，超声1 min后尾静脉注射（150 µL）。另设5只未结扎小鼠作为第二对照。

组织处理与成像

注射后第7天处死小鼠，收集肠道和胃组织。5 µm切片经10%甲醛固定、石蜡包埋、苏木精-伊红染色作组织学观察。超微结构分析用2.5%戊二醛固定、脱水、环氧树脂包埋，经高分辨TEM（FEI Tecnai G2 Spirit Biotwin）观察。双光子激发（780 nm）配合Caliper IVIS-100系统可视化组织切片中的金纳米棒。

金属定量

连续7天收集粪便，称重后王水消解，ICP-MS（Agilent 7500a）定量金属含量。同法处理肠组织测金含量以评估滞留情况。

中药诱导腹泻模型

决明子（10 g）、大黄（2 g）、补骨脂（1 g）水煎（100 mL），滤浓缩至0.3 g mL⁻¹。小鼠每日灌胃0.1 mL提取液或生理盐水，连续7天诱导腹泻。

杯状细胞分析

肠段OCT包埋，8 µm切片，Alcian Blue/PAS染色定量杯状细胞密度及空泡化比例，倒置显微镜下成像。

结果与讨论

纳米颗粒的合成与表征

三角银纳米板显示648.5 nm强表面等离子共振峰，粒径分布窄（平均边长44.3 nm），合成成功（图1a–c）。磁性纳米颗粒（20 nm）和金纳米簇（5 nm）按成熟方案制备[31–33]。金纳米棒呈现预期的近红外纵向等离子共振峰。

CBD结扎模型验证

结扎导致胆管显著扩张，血清TBIL和AST较假手术组升高（图2d–e），确证肝胆途径有效阻断并诱导胆汁淤积。

纳米颗粒的组织学影响

HE染色显示各实验组肠组织均无显著炎症或上皮损伤（图3），表明给药纳米颗粒未破坏肠屏障完整性。

纳米颗粒在杯状细胞中的定位

TEM显示三角银纳米板存在于小肠、回肠、结肠全程的杯状细胞内，呈聚集或分散状态（图4）。磁性纳米颗粒、金纳米簇、金纳米棒分布相似（附件S4–S6）。聚集反映局部高浓度，分散对应低负载量。

肠组织ICP-MS定量证实：结扎组组织金属含量高于对照，而粪便金属含量显著降低，印证杯状细胞对排泄的贡献（图8）。

纳米颗粒进入杯状细胞的机制

纳米颗粒在循环红细胞内被检出，并观察到其穿越血管壁进入固有层，继而进入杯状细胞（图5）。提示颗粒尺寸和表面化学性质使其能被动扩散穿过内皮进入黏膜层。

腹泻对纳米颗粒排泄的影响

腹泻模型增加杯状细胞密度及空泡化比例（图6），与纳米颗粒从杯状细胞加速分泌相关。双光子成像显示：腹泻小鼠组织金纳米棒滞留降低，粪便金含量升高（图7）。证实胃肠动力可调控杯状细胞介导的清除途径。

壁细胞介导的分泌

金纳米簇和三角银纳米板亦在胃壁细胞（PCs）中检出（图9）。虽壁细胞参与程度较杯状细胞小，但提示其可为特定纳米颗粒提供额外排泄路径。

结论

本研究确立了一条此前未被认识的、由杯状细胞和壁细胞介导的多种金属纳米颗粒体内清除途径。通过CBD结扎隔离肝胆系统，证实纳米颗粒经循环主动转运入肠腔（杯状细胞），壁细胞参与胃部排泄。重要的是，中药提取物诱导的腹泻显著加速该过程，凸显调节胃肠动力以增强纳米颗粒清除的潜力。这些洞见为纳米制剂的安全设计、体内追踪及生物安全评价铺平道路。

缩略语

CBD

胆总管

GCs

杯状细胞

GNRs

金纳米棒

HBS

肝胆系统

PCs

壁细胞

TEM

透射电镜

ICP-MS

电感耦合等离子体质谱