纳米颗粒诱导的细胞力学调控：SiO₂ 与 TiO₂ 对 Caco-2 和 A549 细胞影响的比较分析

摘要

纳米颗粒（NP）在消费品中的广泛应用已超越全面安全评估。本研究探讨 SiO₂ 和 TiO₂ NP 的理化属性如何影响两种临床相关体外模型——Caco-2（肠上皮）和 A549（肺泡上皮）的细胞摄取、胞内运输和力学扰动。通过 ICP-AES 定量 NP 内化，WST-8 和 LDH 评估细胞毒性，测量氧化应激（ROS、SOD、MDA），共聚焦显微镜评估肌动骨架重塑。原子力显微镜（AFM）测定核和细胞质区的杨氏模量变化。TiO₂ NP 表现出更高细胞摄取、显著 ROS 产生和显著肌动蛋白重组，导致 A549 细胞硬度增加、Caco-2 细胞硬度降低。这些生物力学改变与 NP 诱导的细胞毒性相关，凸显在纳米毒理学方案中整合力学终点的重要性。

背景

工程纳米颗粒（ENP）广泛存在于药品、化妆品、食品添加剂和工业配方中，引发对人类和环境暴露途径（摄入、吸入、皮肤接触）的担忧。ENP 毒性受其尺寸、形状、表面化学和晶体状态强烈调控，但标准化评估方法有限，导致文献结论冲突 [1–5]。金属氧化物 NP，特别是非晶 SiO₂ 和结晶 TiO₂，因光学和化学稳定性被广泛使用，但证据表明它们可破坏细胞功能，包括细胞因子释放、肠道微绒毛完整性、ROS 产生、ATP 合成抑制和基因毒性 [15–26]。然而，它们对细胞力学的影响——迁移、分化和组织稳态的关键决定因素——鲜受关注 [27, 28]。本研究通过系统评估 20 nm SiO₂ 和 TiO₂ NP 对 Caco-2 和 A549 细胞的生物力学效应填补这一空白。

方法

SiO₂ 和 TiO₂ 纳米颗粒合成

SiO₂ NP 采用 W/O 微乳液法，以 TEOS、Triton X-100、环己烷和 NH₄OH 为原料，制得 20±2 nm 球形颗粒。TiO₂ NP 经改性溶胶-凝胶法由 TTIP 在酸性条件下合成，430 °C 煅烧得混合金红石-锐钛矿相，平均直径 25±5 nm。两类 NP 均经 TEM、DLS、ζ-电位、XRD 表征形貌、水动力学尺寸、表面电荷和晶体结构（图 1）。

细胞培养与暴露

Caco-2 和 A549 细胞在含 10–20% FBS、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素的 DMEM 中培养。摄取研究中，细胞暴露于 15 或 45 µg/mL NP 48–96 h。暴露后洗涤、胰酶消化、计数，用 HCl/HNO₃ 裂解，ICP-AES 分析 Si 和 Ti 含量。

细胞毒性、膜完整性与氧化应激

WST-8 测定活性；LDH 释放量化膜损伤。DCF-DA 荧光测 ROS 产生；SOD 活性和 MDA 水平（脂质过氧化）评估抗氧化响应。所有实验三次重复并设对照。

肌动蛋白骨架与形态测量

细胞固定、透化，用 Phalloidin-ATTO 488 和 DAPI 染色。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）捕获皮层肌动蛋白分布。ImageJ 量化积分密度和相干性（OrientationJ 插件）评估肌动蛋白量和排列。计算核/浆面积比（N/C）检测形态变化。

原子力显微镜

AFM 力-体积模式测量 45 µg/mL NP 处理 72 h 后细胞核和细胞质区的杨氏模量。力-距离曲线拟合修正 Sneddon 模型提取弹性模量（E）。每组 20 个细胞数据经统计分析。

统计分析

结果以均值±SD 表示。Student's t 检验比较处理组与对照组，显著性阈值 p<0.05 (*)、p<0.01 (**)、p<0.005 (***)。

结果

纳米颗粒表征

TEM 确认单分散球形 SiO₂ NP（~20 nm）和 TiO₂ NP（~25 nm，混合金红石-锐钛矿相）（图 1）。DLS 显示水中水动力学直径 SiO₂ 21±7 nm、TiO₂ 27±12 nm；在含 20% FBS 的 DMEM 中 96 h 后分别增至 29±9 nm 和 41±14 nm，表明形成蛋白冠。ζ-电位水中 SiO₂ -45±3 mV、TiO₂ -50±3 mV，培养基中更负。

NP 摄取

ICP-AES 揭示剂量和时间依赖性内化。TiO₂ NP 更易积累：Caco-2 中 72 h 达 8.2±0.4 µg/3.6×10⁵ 细胞，96 h 9.7±0.03 µg；A549 中 72 h 5±0.6 µg，96 h 7.1±0.1 µg。SiO₂ NP 积累较低，尤其 A549（72 h 2.6±0.05 µg）。总体 TiO₂ NP 在两细胞系中摄取更高。

细胞活性、膜损伤与 ROS

WST-8 显示 45 µg/mL 下两细胞系活性适度下降。Caco-2 经 TiO₂ 72 h 活性降 ~40%，96 h ~50%；A549 仅 96 h 降 ~30%。LDH 释放趋势一致，Caco-2 96 h 峰值达对照 ~160%。ROS 产生剂量依赖增加，TiO₂ NP 诱导 Caco-2 DCF-DA 荧光高达 165%（图 4）。

抗氧化响应与脂质过氧化

SOD 活性剂量和时间依赖性下降。Caco-2 中 SOD 从对照 4.1±0.2 U/mL 降至 96 h 45 µg/mL TiO₂ 处理后 1.0±0.3 U/mL。SiO₂ 暴露降至 1.4±0.1 U/mL。两细胞系 MDA 相应升高，指示脂质过氧化增强。

肌动蛋白骨架重塑

共聚焦成像显示 NP 处理后 Caco-2 紧密连接破坏、形态拉长；A549 细胞间接触减少。定量分析显示积分密度（肌动蛋白总量）无显著变化，但相干性显著下降：Caco-2 相干性从对照 0.26±0.03 降至 TiO₂ 0.09±0.02；A549 从 0.40±0.03 降至 0.16±0.04。N/C 比在 Caco-2 升高（0.40→0.62），在 A549 降低（0.55→0.23），反映截然不同的形态响应。

力学性质（杨氏模量）

AFM 测量显示相反的硬度变化。Caco-2 中核杨氏模量从 105±25 kPa 降至 TiO₂ 处理后 27±4 kPa；细胞质模量从 47±21 kPa 降至 18±4 kPa。反之 A549 硬度剧增：核模量从 129±24 kPa 升至 372±60 kPa，细胞质模量从 147±26 kPa 升至 549±40 kPa。

讨论

研究表明，TiO₂ NP 凭借晶体结构和表面反应性引发比非晶 SiO₂ NP 更强的细胞响应。增强的摄取、ROS 产生和肌动蛋白重组与细胞弹性显著改变相关——Caco-2 软化、A549 僵化——提示上皮与肺泡环境中存在不同机制途径。此类生物力学变化可能影响细胞迁移、屏障完整性甚至肿瘤进展。将力学终点与常规细胞毒性分析结合，提供更全面的纳米毒理学评估。

结论

SiO₂ NP 细胞毒性低于 TiO₂ NP。TiO₂ 暴露诱导肌动蛋白重塑、N/C 比改变及分化力学响应：A549 硬度增加、Caco-2 硬度降低。这些生物力学扰动强调在纳米毒理学研究中评估细胞骨架动力学和细胞力学的重要性，以预测潜在病理后果。

缩略语

A549

人肺腺癌上皮基底细胞

AFM

原子力显微镜

ATP

三磷酸腺苷

Caco-2

人结直肠腺癌上皮细胞

CLSM

共聚焦激光扫描显微镜

DAPI

4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚

DCF-DA

2′,7′-二氯荧素二乙酸酯

DLS

动态光散射

DMEM

杜尔贝科改良鹰培养基

ENPs

工程纳米颗粒

FBS

胎牛血清

HCl/HNO₃

盐酸/硝酸

ICP-AES

电感耦合等离子体原子发射光谱

LDH

乳酸脱氢酶

MDA

丙二醛

NH₄OH

氨水

NPs

纳米颗粒

PBS

磷酸盐缓冲液

ROIs

感兴趣区域

ROS

活性氧

SiO₂ NPs

二氧化硅纳米颗粒

SOD

超氧化物歧化酶

TBA

硫代巴比妥酸

TEM

透射电子显微镜

TEOS

正硅酸乙酯

TiO₂ NPs

二氧化钛纳米颗粒

TTIP

异丙氧化钛

XRD

X 射线衍射