阳离子DOTAP-PEG-PCL胶束高效递送siRNA治疗结肠癌

摘要

基于siRNA的基因治疗为结肠癌治疗提供前景路径，但安全高效递送仍是瓶颈。我们通过整合生物相容聚合物mPEG-PCL与阳离子脂质体DOTAP构建阳离子胶束（DMP），得稳定正电荷载体。靶向Bcl-xl和Mcl-1的DMP/siRNA复合物在C26结肠癌细胞中展现>85%转染效率，低细胞毒性（293T细胞IC₅₀=3.7 µg/mL），强基因沉默。皮下C26异种移植模型中，肿瘤内注射DMP/siBcl-xl和DMP/siMcl-1分别抑制肿瘤体积65%和55%，无脏器毒性。结果确立DMP胶束作为结肠癌基因治疗安全有效siRNA递送平台。

引言

结直肠癌仍是全球癌症死亡主要原因，亟需创新治疗策略。基因治疗，特别是siRNA介导癌基因敲低，可选择性触发肿瘤细胞凋亡。但临床转化依赖兼具高转染效率、低免疫原性、生物相容性的非病毒载体。两亲聚合物mPEG-PCL提供可降解性和隐形特性，阳离子脂质DOTAP提供强核酸结合。前期工作证实DMP胶束安全递送质粒DNA；本文评估其运载靶向抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1的siRNA能力，二者为结肠癌生存关键驱动因子。

材料与方法（简版）

• DMP制备： mPEG-PCL（Mn≈4 kDa）与DOTAP（5-20 mg）共溶二氯甲烷，旋蒸成薄膜，水化复水。所得胶束平均直径145 nm，Zeta电位+46 mV。
• siRNA复合： siRNA（50 nM）按质量比30:1（DMP:siRNA）与DMP混合形成稳定复合物，琼脂糖凝胶阻滞实验确认。
• 体外实验： 流式细胞术用FAM标记siRNA测转染效率；MTT测细胞毒性；Annexin V/PI染色测凋亡；qPCR评估基因敲低。
• 体内研究： 皮下C26瘤BALB/c小鼠接受肿瘤内注射DMP/siRNA（10 µg/次），隔日一次共5个周期。记录瘤体积和重量；组织学（H&E）和TUNEL实验评估安全性和凋亡。

结果

胶束表征

DMP胶束呈窄尺寸分布（PDI=0.32）、正表面电荷（+46 mV），水溶液中>96 h稳定。凝胶阻滞显示DMP/siRNA比≥30:1时siRNA完全包裹。

低细胞毒性与高转染

IC₅₀值：293T细胞3.7 µg/mL，C26细胞0.50 mg/mL，远低于PEI25K（IC₅₀<0.1 µg/mL）。转染效率无血清>85%，30% FBS条件下71-81%，媲美PEI。

siRNA介导基因沉默

qPCR显示50-100 nM DMP/siRNA下Bcl-xl和Mcl-1转录本>70%降低。克隆形成和MTT实验确认C26增殖显著抑制（细胞活力56-70%）。处理细胞凋亡率升至33-38%。

体内抗肿瘤疗效

肿瘤内注射DMP/siBcl-xl和DMP/siMcl-1分别使瘤体积减少65%和55%，瘤重从对照0.85 g降至0.34-0.42 g。心、肝、脾、肺、肾无组织病理异常。

讨论

mPEG-PCL对DOTAP正电荷部分屏蔽减少血清蛋白干扰和细胞毒性，同时保留siRNA结合和递送效率。该设计解决传统阳离子脂质关键局限，证明DMP胶束作为实体瘤通用低毒siRNA载体的可行性。

结论

DMP胶束高效递送Bcl-xl和Mcl-1 siRNA，诱导凋亡抑制肿瘤生长，体内外均表现低毒性。它们代表结肠癌基因治疗有前景的非病毒平台。