Carbon Dots @ Platinum Porphyrin Composite 作为用于有效光动力癌症治疗的治疗诊断纳米剂

背景

光动力疗法 (PDT) 已被广泛用作一种有前途的非侵入性治疗方式，用于治疗多种人类疾病，包括多种皮肤病、与年龄相关的黄斑退化和癌症 [1]。 PDT 可单独使用或与手术、化疗或电离辐射联合使用 [2]。在光动力疗法中，光敏剂 (PS) 被特定波长的光照射，触发细胞内氧产生活性氧，从而诱导细胞死亡和近端组织坏死 [3,4,5,6]。由于光敏剂通常在没有光的情况下是无害的，因此可以通过选择性照明精确靶向肿瘤治疗，从而限制对周围健康组织的损害 [7,8,9]。可活化的光敏剂，如卟啉和酞菁衍生物，已被证明具有同步癌症成像和治疗能力，其中一些光敏剂已被批准用于临床 [10, 11]。然而，它们中的许多由于水溶性差、皮肤光敏性延长、选择性不足以及在皮肤最透明的区域（> 700 nm）不能被吸收而受到限制，这些在临床应用中经常遇到。化学品。因此，已经提出了许多方法将 PS 掺入载体中，例如脂质体 [12]、聚合物纳米粒子 [13, 14]、金纳米粒子 [15,16,17]、碳纳米管 [18]、石墨烯 [19] 和碳纳米点 [20,21,22].

近年来，碳量子点（CQDs）作为一种新型的碳纳米材料，以其优异的光学性能、优异的水溶性、低毒性、良好的生物相容性、良好的细胞渗透性和制备简便等独特的性能而备受关注。和修改。因此，CQD 已在光电子学、传感 [23, 24]、治疗诊断学 [25,26,27] 和生物成像领域被证明具有许多有前景的应用。在过去的几年中，已经开发了多种方法来合成各种 CQD，例如水热法、微波法、热处理法和电化学法 [28]。其中，利用天然前驱体制备碳量子点的水热法因其绿色化学性质而被广泛报道[29, 30]。

此外，由于其丰富的表面基团和合理的生物相容性，CQDs 有可能成为各种分子的装载平台 [31, 32]。特别是，当用不同的化学基团进行功能​​化时，CQD 可以通过共价或非共价相互作用与各种功能元件（如药物分子、蛋白质和适体）进行工程设计，用于多种生物医学应用 [33]。例如，2012 年，Huang 等人。设计了一种基于光敏剂共轭碳点的新型治疗诊断平台。辐照后，制备的 CQDs-Ce6 相对于单独的 Ce6 显示出更强的荧光发射和更高的光动力功效 [34]。 2014 年，Choi 等人。开发了一个类似的治疗诊断平台，基于加载有 ZnPc 的 FA 共轭 CQD [3]。同年，王等人。通过将 TMPyP 与无毒 CQD 静电连接来开发共轭物 [35]。 2015 年，Beack 等人。合成了一种CQDs-Ce6-HA共轭物，其光动力效应远高于游离Ce6和CQDs-Ce6[36]。

最近，Naik 等人报道了一种新的四铂卟啉复合物。结果表明，铂卟啉在黑暗中表现出轻微的细胞毒性，但在 420 nm 激光照射下，IC50 值降至 19 nM，表明四铂卟啉复合物是一种有前途的癌症治疗抗癌剂 [37]。然而，合成的四铂卟啉表现出较低的生物相容性和水溶性，这限制了它们的临床应用。为此，我们在这里通过四铂卟啉复合物（PtPor）和带负电荷的 CQD 之间的静电相互作用开发了一种新的治疗诊断纳米试剂（CQDs@PtPor）（方案 1）。 CQDs@PtPor 复合材料将 CQDs 的光学特性和卟啉的抗癌功能整合到一个单元中。光谱结果表明 CQDs@PtPor 复合材料中从 CQDs 到 PtPor 的有效共振能量转移。令人印象深刻的是，CQDs@PtPor 表现出比单独的 PtPor 更强的 PDT 效应，这可能归因于 ¹ 的更高效率 通过 CQD 生成 O2 PtPor。此外，小尺寸的 CQDs@PtPor 可能通过 EPR 效应在肿瘤部位选择性积累。因此，所制备的纳米磁体（CQDs@PtPor）在癌症治疗中显示出巨大的应用潜力。

CQDs@PtPor的制备示意图

方法

反式二氯化二氨铂 (transplatin) 购自 Aladdin®。 1,3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF) 购自 Sigma-Aldrich。所有溶剂均购自天津富臣化学试剂。其他化学品购自国药集团化学试剂有限公司，按原样使用。

[Trans-PtCl(NH3)2]4-5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)-Porphyrin Nitrate的合成

将转铂 (0.193 mmol, 58 mg) 和硝酸银 (0.193 mmol, 33 mg) 溶解在 5 mL DMF 中。串24小时后，通过离心从混浊溶液中除去形成的白色氯化银，得到澄清溶液，然后将其加入5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉的悬浮液中(0.487 mmol, 30 mg) 在 3 mL DMF 中。在 50°C 搅拌 48 小时后，将混合物冷却至室温。然后加入10mL乙醚得到红色沉淀，然后用甲醇、二氯甲烷和乙醚洗涤。最后，样品在真空下干燥，得到 81mg 产物。收率86%。 ¹ H NMR (400 MHz; DMSO-d6):δ 9.45 (d, 8H), 9.14 (s, 8H), 8.52 (m-吡啶基, d, 8H), 4.70 (NH3, s, 24H), - 3.04 (s , 2H); MS (ESI):m /z =1209 [M-3(NO3)-2{PtCl(NH3)2}] ⁺ , 1074 [M-4(NO3)-2{PtCl(NH3)2}-2NH3-Cl-2H] ⁺ , 883 [M-4(NO3)-3{PtCl(NH3)2}] ⁺ , 866 [M-4(NO3)-3{PtCl(NH3)2}-NH3] ⁺ , 812 [M-4(NO3)-3{PtCl(NH3)2}-Cl-2(NH3)] ⁺ , 574 [M-4(NO3)-2{PtCl(NH3)2}] ²⁺ .

CQD 的准备

通常，将柠檬酸 (0.45 g) 和乙二胺 (500 μL) 溶解在去离子水 (10 mL) 中。然后将溶液转移到聚（四氟乙烯）（特氟龙）衬里的高压釜（30 毫升）中，并在 200°C 下加热 5 小时。反应结束后用水或自然冷却至室温。粗品呈棕黑色，离心30 min去除团聚颗粒，再用去离子水透析得到CDs。

CQDs@PtPor 复合材料的制备

PtPor 分子在吡啶环上带有四个正电荷，可以通过静电相互作用与带负电荷的 CQDs 表面结合，得到 CQDs@PtPor 复合材料。通常，将溶解在 3 mL DMSO 中的 20 mg PtPor 分散在 12 mL 水中。在超声处理下将溶液缓慢加入 CQDs 悬浮液（5 mg CQDs 溶于 15 mL H2O）中。在室温下搅拌 24 小时后，将溶液在离心机中纯化 30 分钟以去除团聚颗粒，然后用去离子水透析 2 天。将CQDs@PtPor的水溶液在4℃下冻干得到所需产物。

CQDs 量子产率的计算

CQDs的量子产率以硫酸奎宁为参比（0.1 M H2SO4水溶液，荧光量子产率∼ 54%）通过下式测定：

其中 Φ 是荧光量子产率，I 是曲线的斜率，η 是溶剂的折射率。下标“st”是指已知量子产率的参考（0.1 M H2SO4 中的硫酸奎宁）。在360 nm激发波长下吸收保持在0.1以下，以减少重吸收。

单线态氧气生成

在室温下，在玻璃比色皿 (3 mL) 中辐照样品和 3-二苯基异苯并呋喃的溶液。 DPBF 在 415 nm 处的吸收衰减以 3 分钟至 30 分钟的辐照间隔测量。通过单线态氧猝灭剂 DPBF 定性评估单线态氧的产生。 DPBF吸收衰减的百分比，与 ¹ 的产生成正比 O2 是通过初始吸光度和给定照射时间后吸光度之间的差异来评估的。每个实验重复3次。

CQD、PtPor 和 CQDs@PtPor 的细胞毒性分析

人宫颈癌 (HeLa) 细胞在补充有 5% 胎牛血清 (FCS)、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 6% CO2 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中培养。根据标准方法进行甲基噻唑基四唑鎓 (MTT) 活力测定。简而言之，HeLa细胞（3 × 10 ³ /well) 在接触药物之前接种在 96 孔板中 24 小时。在黑暗中用样品处理细胞过夜。通过MTT还原测定确定细胞毒性。将细胞单层用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 冲洗两次，然后与 50 μL MTT 溶液 (0.5 mg/mL) 在 37°C 下孵育 3 小时。除去培养基后，加入 100 μL DMSO。将溶液摇动 30 分钟以溶解活细胞中形成的甲臜晶体。在 Labsystem Multiskan 酶标仪（瑞士默克欧洲实验室）上在双波长 540 nm 和 690 nm 下测量吸光度。每个给药浓度在三次重复孔中进行，并重复两次用于MTT测定。

样品的光细胞毒性通过类似的方案进行评估。一般来说，HeLa细胞（3 × 10 ³ 每孔）在暴露于药物之前在 96 孔板中孵育 24 小时。在黑暗中用样品处理细胞过夜。之后，将电池暴露于装有隔热过滤器和 500 nm 长通过滤器的 50 W 氙灯下 10 分钟。通量率为 6 mW/cm ² . MTT还原法测定细胞活力。

CQDs@PtPor 的生物成像应用

使用共聚焦激光扫描显微镜评估细胞成像。 HeLa 细胞 (5 × 10 ⁴ 每孔细胞）接种在 6 孔培养板中，并使其粘附 12 小时。然后在 37°C 下用 CQDs@PtPor (0.25 mg/mL) 处理细胞 1 小时。之后，小心除去上清液，用PBS洗涤细胞3次。随后，使用ZEN 2009软件（Carl Zeiss）通过共聚焦显微镜（Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope; LSM7 DUO）安装和观察载玻片。

结果

制备 CQDs@PtPor

根据文献[38]中描述的方法，通过一锅水热反应制备 CQDs，如方案 1 所示。 PtPor 是通过取代的反铂与 5, 10, 15, 20-Tetra(4-pyridyl )卟啉根据报道的方法[37]。由于PtPor分子在吡啶环上带有四个正电荷，可以通过静电相互作用结合在带负电荷的CQDs表面，得到所需的CQDs@PtPor复合材料。

CQDs@PtPor 的表征

透射电子显微镜 (TEM) 图像（图 1 左）显示所制备的 CQDs 和 CQDs@PtPor 均匀分布且尺寸均匀。图 1 右侧显示的粒径很窄（1-9 nm），由直方图确定的 CQDs 和 CQDs@PtPor 的平均粒径分别为 2.5 和 7.6 nm。 CQDs@PtPor的平均尺寸大于CQDs，可能是由于PtPor分子通过静电相互作用吸附在CQDs表面。

a 的 TEM 图像（左）和相应的尺寸分布直方图（右） CQD 和 b CQDs@PtPor

图 2a 显示了合成的 CQD 的 X 射线衍射（XRD）图。 CQDs 的宽 XRD 峰出现在 23°左右，表明 CQDs 的结构无序 [39]。 CQDs的官能团通过FTIR光谱表征。如图 2b 所示，从 3000 到 3500 cm ^-1 的宽峰 归因于 O-H 和 N-H 伸缩振动，表明存在羟基和氨基。 1150 和 1230 cm ^-1 处的峰 分别归因于 C-O 和 C-N 伸缩振动。酰胺键由 1678 和 1392 cm ^-1 处的典型峰证实 ，分别归因于酰胺的 C=O 和 C-N 的振动。最后，在 1600 cm ⁻¹ 处的峰值 标识为 C=C/C=N 键。与柠檬酸的 FTIR 结果相比，CQDs 没有表现出任何明显的柠檬酸 (CA) 特征吸收，表明 CA 在水解过程中应该大部分碳化。此外，在 1700 cm ⁻¹ 处出现了一个新的尖峰 , 归因于酰胺键被发现，表明乙二胺应该通过 -CONH- 键在 CQDs 表面官能化。 CQDs 和 CQDs@PtPor 的平均直径和粒径分布由 DLS 测量确定（附加文件 1：图 S1 和图 2c）。如图 2c 所示，CQDs@PtPor 的平均尺寸约为 9.2 nm，这与 TEM 测试的结果一致。进一步进行 zeta 电位测量以确认 CQD 和 PtPor 之间的共轭。如图 3d 所示，由于表面带负电荷，游离 CQD 的 zeta 电位为 - 15.6 mV。与PtPor结合后，CQDs@PtPor复合材料的zeta电位变为4.5 mV，表明PtPor分子成功覆盖了CQDs。

CQDs (a ）。 CQDs 的 FTIR 光谱 (b ）。通过动态光散射测量的 CQDs@PtPor 的粒度分布 (c ）。 CQDs 和 CQDs@PtPor (d )

XPS 调查频谱 (a ) 和 C 1s (b ), N 1s (c ) 和 O 1s (d ) CQDs的高分辨率XPS光谱

进行 X 射线光电子能谱 (XPS) 以进一步研究 CQD（图 3）和 CQDs@PtPor（附加文件 1：图 S2）的化学成分。图 3a 中 CQD 的测量光谱表明表面存在元素为 C、N 和 O，相关信号分别为 535、402 和 283 eV [40]。图 3b 中显示的 C 1s 信号在 284.4 eV、286.3 eV 和 288.2 eV 处具有三个不同的峰，分别属于 C-C 键、C-O 键和 C=O 键。图 3c 中显示的高分辨率 XPS N 1s 具有三个峰，结合能分别为 395.3、399.1 和 402.2 eV，分别对应于类吡啶 N、吡咯 N 和四元 N [41]。 O 1s的解卷积表现出C-O和O-H峰（图3d），表明CQDs表面存在大的羧基。

CQDs@PtPor 的光物理性质

运行紫外-可见吸收和荧光光谱以研究复合材料的光物理性质。如图 4a 所示，CQDs@PtPor 复合材料显示了来自 CQDs 和卟啉的特征峰。例如，360 nm 附近的显着吸收峰可能归因于 CQD [42] 的 n → π* 跃迁，而 425 nm、520 nm 和 580 nm 附近的峰归因于卟啉的 soret 和 Q 带， 分别。 CQDs 的水溶液在 365 nm 紫外 (UV) 灯的照射下显示蓝色发射。此外，CQD 表现出依赖于激发的 PL 行为，当激发波长从 280 变为 500 nm 时，发射峰从 460 移到 552 nm，如图 4b 所示。以硫酸奎宁为参比制备的CQDs荧光量子产率为36%。

紫外-可见吸收 (a ) 和荧光 (b ) CQDs、PtPor 和 CQDs@PtPor 的光谱。荧光光谱 (c ) 具有不同激发波长的 CQD。荧光衰减 (d ) 的 CQDs 和 CQDs@PtPor。样品浓度：CQDs（5 μg/mL）、CQDs@PtPor（5 μg/mL、3 μg/mL）和PtPor（3 μg/mL）

讨论

通过比较 CQDs@PtPor 与 CQDs 和 PtPor 的荧光强度，可以研究 CQDs@PtPor 复合材料中的荧光共振能量转移（FRET）效应。在 360 nm 激发下测量具有相同浓度的 CQDs、PtPor 和 CQDs@PtPor 的荧光光谱和强度（图 4c）。由于 CQD 在 360 nm 处显示出非常强的吸收（图 4a），PL 量子产率高达 36%，因此它发出非常强的荧光。相反，由于 PtPor 在 360 nm 处的吸收非常低，并且其 PL 量子产率小于 1%，因此 PtPor 表现出非常弱的发射。值得注意的是，与游离 CQDs 相比，CQDs@PtPor 中的蓝色发射强度（500 nm）明显降低，而红色发射强度（660 nm）相对于单独的 PtPor 显着增强，表明 CQDs@PtPor 复合材料中的有效能量转移. CQDs@PtPor 复合材料中 CQDs 的荧光寿命相对于游离 CQDs 的荧光寿命降低，如图 4d 所示。供体寿命的这种明显降低进一步表明了CQDs@PtPor复合材料中从CQDs到PtPor的有效共振能量转移。

由于单线态氧的产生是 PDT 的关键因素， ¹ 以 1,3-二苯基异苯并呋喃 (DPBF) 为 ¹ 的化学方法测定 O2 的生成 O2 清除剂。一般来说，在单线态氧存在下，DPBF的吸收强度会逐渐降低。因此，DPBF吸收强度的下降率可以用来评价单线态氧的相对产率。在本实验中，CQDs (5 mg/mL)、PtPor (5 mg/mL) 或 CQDs@PtPor (5 mg/mL) 分别与 DPBF (10 mM) 混合，然后用氙灯照射。如图 5a 所示，加入 CQDs 后，DPBF 的吸收没有随着照射时间的延长而发生任何变化，表明 CQDs 没有显着的单线态氧产生。此外，CQDs@PtPor复合材料对DPBF表现出非常明显的降解，远高于PtPor，表明 ¹ 在 CQD 的作用下，卟啉的 O2 产量可以提高。同时， ¹ 的制作 使用二氯荧光素 (DCFH) 试剂进一步量化 O2。已知 DCFH 的绿色荧光 (λem =525 nm) 在与 ¹ 反应时会定量增加 光敏剂产生的 O2。如图 5b 所示，CQDs@PtPor 复合材料表现出更高的 ¹ 效率 O2 产量高于纯 PtPor。该结果与DPBF方法得到的结果高度一致。

CQDs、PtPor 和 CQDs@PtPor 的单线态氧产生来自 DPBF 方法 (a ) 和 DCFH 方法 (b )

CQDs、PtPor 和 CQDs@PtPor 对 HeLa 细胞的细胞毒性通过甲基噻唑基四唑 (MTT) 测定进行了测试。如图 6a 所示，在黑暗中处理 24 小时后，所有三个样品对 HeLa 细胞的细胞毒性都可以忽略不计。超过 90% 的癌细胞仍然存活，它们的浓度增加到 50 μg/mL，表明所有三个样本在黑暗中对癌细胞没有不利影响。此外，使用类似的方法进一步评估了三个样品的光细胞毒性。如图 6b 所示，用 CQDs@PtPor 处理癌细胞 24 小时后进行光照射，细胞活力随着样品浓度的增加而逐渐降低。当CQDs@PtPor的浓度为50 μg/mL时，癌细胞的存活率仅为8%，明显低于单独使用PtPor（18%）和CQDs（90%）的存活率。也就是说，CQDs@PtPor复合材料比单独使用PtPor表现出更强的治疗效果，表明CQDs@PtPor优于常规配方，这可能是由于CQDs提高了PtPor产生单线态氧的效率。

暗细胞毒性 (a ) 和光细胞毒性 (b ) 不同浓度的 CQDs、PtPor 和 CQDs@PtPor

使用共聚焦激光扫描显微镜在 405 nm 激光激发下研究了纯 CQD、PtPor 和 CQDs@PtPor 的细胞摄取。如图 7 所示，CQDs@PtPor 复合物主要分布在 HeLa 细胞的细胞质中。此外，CQDs 的蓝色荧光成像与 CQDs@PtPor 复合材料中 PtPor 的红色发射几乎重叠，表明 CQDs@PtPor 复合材料进入细胞后，CQDs 和 PtPor 保持结合状态。这些结果验证了CQDs@PtPor复合材料在细胞环境中是稳定的，并且仍然可以在细胞内进行荧光共振能量转移。

用 50 μg/mL 纯 CQDs (a –c ), PtPor (d –f ) 和 CQDs@PtPor (g –我 ) 24 小时。 一 , d , g 明亮的领域。 b , e , h 在 410-450 nm 波长区域检测到的 CQDs 成像通道。 c , f , i PtPor 成像通道，用 590 nm 长通区域检测； （比例尺 =20 μm）

结论

通过四铂卟啉复合物（PtPor）和带负电荷的CQDs之间的静电相互作用，成功设计和开发了一种新型治疗诊断纳米试剂（CQDs@PtPor）。所制备的 CQDs@PtPor 复合材料具有高水分散性、良好的稳定性和生物相容性，以及增强的光敏剂荧光检测。 CQDs@PtPor 的 PDT 效应相对于单独的 PtPor 显着增强，表明由于 ¹ 的效率提高，CQDs@PtPor 优于常规配方 通过 CQD 生成 O2 PtPor。因此，这种基于CQDs的纳米药物在体外显示出增强的癌细胞治疗功效和低副作用，在不久的将来在临床治疗癌症患者方面显示出巨大的应用潜力。

更改历史

缩写

CA：

柠檬酸

CQD：

碳量子点

DPBF：

1,3-二苯基异苯并呋喃

EDA：

乙二胺

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

PDT：

光动力疗法

PS：

光敏剂

TEM：

透射电子显微镜

紫外线：

紫外线

XPS：

X射线光电子能谱

XRD：

X射线衍射