碳量子点-铂卟啉复合物：增强光动力癌症治疗的双功能诊疗一体化纳米剂

摘要

光敏剂（PSs）因疏水性臭名昭著，限制其在光动力治疗（PDT）临床应用。为克服此问题，我们通过四铂卟啉复合物（PtPor）与带负电碳量子点（CQDs）静电结合，构建新型诊疗一体化纳米剂CQDs@PtPor。全面表征（XRD、TEM、XPS、FTIR）确认CQDs与PtPor成功组装成单一纳米结构。光谱分析揭示CQDs到PtPor的高效共振能量转移，显著增强单线态氧（¹O₂）产生。HeLa细胞体外实验显示，CQDs@PtPor光毒性优于游离PtPor，且暗毒性可忽略，凸显其作为安全有效癌症治疗平台的潜力。

背景

PDT已成为治疗皮肤病、黄斑变性和多种癌症的非侵入性策略。疗法依赖光激活PSs照射产生活性氧（ROS），选择性杀灭肿瘤细胞同时保护正常组织。虽可激活PSs如卟啉和酞菁衍生物可兼具成像与治疗双重角色，但临床转化受阻于水溶性差、皮肤光敏性持久、组织穿透有限、700 nm以上吸收欠佳。各类纳米载体——脂质体、聚合物纳米颗粒、金纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯、碳量子点（CQDs）——均被探索以改善PS递送与性能。

CQDs作为多功能碳纳米材料，展现卓越光学性质、高水溶性、低毒性、优异生物相容性、易表面功能化。丰富表面基团使其能共价或非共价连接药物、蛋白、靶向配体，成为诊疗一体化应用理想载体。前人研究证实CQDs与PSs（如Ce6、ZnPc、TMPyP）偶联可通过能量转移机制增强荧光成像和光动力疗效。

近期四铂卟啉复合物显示低暗细胞毒性，但420 nm照射下IC₅₀低至19 nM，显示强抗癌活性。然而其疏水性和有限生物相容性阻碍临床应用。我们因此设计CQDs@PtPor，利用CQDs溶解性和表面化学保留PtPor治疗效力。带正电PtPor与带负电CQDs静电组装不仅改善水分散性，还促进能量转移，放大¹O₂生成和光毒性。

方法

材料
反式-铂二氨二氯化物（反式-顺铂）（Aladdin®）、1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）（Sigma-Aldrich），所有溶剂购自天津富陈化学试剂或国药化学试剂有限公司。所有试剂直接使用。

[反式-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉硝酸盐合成

反式-顺铂（0.193 mmol，58 mg）和AgNO₃（0.193 mmol，33 mg）溶于5 mL DMF搅拌24 h。离心除去白色AgCl沉淀得澄清溶液。加入3 mL DMF中悬浮的5,10,15,20-四(4-吡啶基)卟啉（0.487 mmol，30 mg），50 °C搅拌48 h。冷却后加10 mL乙醚沉淀红色产物，甲醇、二氯甲烷、乙醚洗涤。真空干燥得81 mg产物（产率86%）。¹H NMR和ESI-MS确认结构。

CQDs制备

柠檬酸（0.45 g）和乙二胺（500 µL）溶于10 mL去离子水，PTFE衬里高压釜200 °C水热处理5 h。所得褐黑溶液离心纯化，透析去离子水得CQDs。

CQDs@PtPor复合物制备

PtPor（20 mg/3 mL DMSO）分散于12 mL水，超声下缓慢加入CQDs悬浮液（5 mg/15 mL H₂O）。室温搅拌24 h，离心纯化，透析2天。终水溶液4 °C冻干得复合物。

量子产率测定

CQDs量子产率（Φ）参奎宁硫酸酸（Φ_st≈54%）标准比较法计算。360 nm处吸光度控<0.1避免再吸收。

单线态氧生成

样品（5 mg mL⁻¹）混合10 mM DPBF于3 mL比色皿，50 W氙灯（500 nm长通滤波，6 mW cm⁻²）照射至30 min。每3 min监测415 nm处DPBF吸光度下降量化¹O₂产生。DCFH荧光（λ_em=525 nm）作定性探针。

细胞毒性实验

HeLa细胞DMEM培养（5% FCS，100 U mL⁻¹青霉素，100 µg mL⁻¹链霉素，37 °C，6% CO₂）。暗细胞毒性：细胞孵育不同浓度CQDs、PtPor或CQDs@PtPor 24 h，MTT法测定。光毒性：24 h孵育后照射，再MTT测定活力。

细胞成像

HeLa细胞（5×10⁴ cells mL⁻¹）孵育0.25 mg mL⁻¹ CQDs@PtPor 1 h，洗涤，共聚焦显微镜（Zeiss LSM7 DUO）405 nm激光成像。

结果

CQDs@PtPor制备与表征

透射电镜（TEM）显示均匀单分散颗粒：CQDs平均2.5 nm，CQDs@PtPor平均7.6 nm，反映PtPor吸附（图1）。XRD呈~23°宽峰，指示非晶碳结构。FTIR确认羟基、氨基、酰胺基存在（图2b）。动态光散射（DLS）测CQDs@PtPor平均流体动力学直径9.2 nm，佐证TEM。Zeta电位从-15.6 mV（游离CQDs）转为+4.5 mV（PtPor偶联后），确认静电结合（图3d）。

光物理性质

UV-Vis显示CQDs特征吸收（~360 nm）和卟啉Soret/Q带（~425、520、580 nm）。CQDs呈激发依赖性光致发光（PL），激发280-500 nm时发射从460 nm红移至552 nm，量子产率36%。复合物中500 nm处PL强度降低而660 nm发射增强，证实高效荧光共振能量转移（FRET）。荧光寿命测定证实CQDs@PtPor中给体寿命缩短，进一步支持能量转移（图4）。

单线态氧产生增强

DPBF降解实验显示CQDs@PtPor产生¹O₂显著多于游离PtPor，单独CQDs活性可忽略（图5a）。DCFH荧光佐证，CQDs@PtPor信号最强（图5b）。

HeLa细胞光毒性

暗细胞毒性实验显所有样品50 µg mL⁻¹下活力>90%（图6a）。光毒性实验呈剂量依赖性活力下降：50 µg mL⁻¹ CQDs@PtPor仅8%存活，优于PtPor（18%）和CQDs（90%）（图6b）。优异疗效归因于CQDs介导的增强¹O₂生成。

细胞摄取与稳定性

共聚焦成像显示CQDs@PtPor主要定位于HeLa细胞胞质，蓝色CQDs荧光与红色PtPor发射重叠，指示摄取后复合物稳定（图7）。

讨论

CQDs至PtPor显著FRET（给体发射减弱、寿命缩短）直接转化为更高¹O₂产生和增强光毒性。CQDs@PtPor小尺寸（~10 nm）利于通过增强渗透滞留（EPR）效应肿瘤富集，改善水分散性和生物相容性降低全身毒性。静电组装模块化特性允许轻易替换不同PSs或靶向配体，定位CQDs@PtPor为个性化PDT多功能平台。

结论

我们成功制备CQDs@PtPor纳米剂，融合CQDs优异光学性质与四铂卟啉强抗癌活性。复合物展现高水相稳定性、低暗毒性、高效能量转移、显著增强体外光动力疗效。这些属性使CQDs@PtPor成为癌症治疗临床转化极具前景的候选者。

修订历史

• 初次投稿。

缩略语

CA

柠檬酸

CQDs

碳量子点

DPBF

1,3-二苯基异苯并呋喃

EDA

乙二胺

MTT

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

PDT

光动力治疗

PSs

光敏剂

TEM

透射电子显微镜

UV

紫外

XPS

X射线光电子能谱

XRD

X射线衍射