介孔二氧化硅纳米粒共递送NQO1抑制剂与5-氟尿嘧啶增强头颈鳞癌抗肿瘤活性

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是最致命癌症之一，90%源于鳞状细胞。NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）在鳞状细胞癌中过表达，在增殖和化疗耐药中起重要作用。本研究主要目的：研究β-拉帕酮（临床制剂ARQ761）在HNSCC中的抑制作用；研究5-FU与β-拉帕酮联用提高HNSCC治疗疗效的协同效应。制备负载5-FU/β-拉帕酮的脂质双层组装介孔二氧化硅纳米粒，研究其理化和生物学性质。β-拉帕酮在Cal33细胞中呈浓度依赖性抑制NQO1酶活性，20-50 μg/ml剂量显著抑制。5-FU+β-拉帕酮联用导致细胞活力更低；显著地，负载5-FU/β-拉帕酮的介孔二氧化硅纳米粒（FNQ-MSN）细胞活力显著低于单药或物理混合组。β-拉帕酮降低NQO1蛋白条带，但FNQ-MSN处理组NQO1水平下降最显著。FNQ-MSN导致60%以上细胞凋亡（早期和晚期）及癌细胞核碎片化为主，显示载体联合给药方案优越抗癌效果。5-FU+β-拉帕酮物理混合组肿瘤体积显著降低；但载体递送5-FU和β-拉帕酮联合治疗（FNQ-MSN）显著延缓肿瘤生长并延长携瘤异种移植小鼠生存期。研究提示NQO1抑制剂增强5-FU化疗潜力治疗HNSCC的潜力。

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是最致命癌症之一，90%源于鳞状细胞[1]。HNSCC高血管生成，其血管表达多种细胞因子包括成纤维细胞生长因子（FGFs）和血管内皮生长因子（VEGFs），与高转移和预后差相关[2]。中国HNSCC发病率居癌症相关死亡第六位，2015年约25万新增病例，7.75万死亡。因侵袭性强、早期复发、高转移、预后差导致高死亡率，HNSCC总体5年生存率极低[3]。主要治疗为手术联合放疗或化疗。化疗若在早期或术后有效使用可抑制肿瘤生长[4, 5]。有效化疗可清除肿瘤组织内癌细胞并抑制复发。但长期单药化疗常导致耐药和疗效下降[6]，亟需创新策略改善HNSCC患者生存率和生活质量。

HNSCC治疗抗癌药物包括顺铂、5-氟尿嘧啶（5-FU）、紫杉醇、多西他赛。其中5-FU作为HNSCC和其他鳞癌一线治疗药物[7]。5-FU为嘧啶类似物，通过不可逆抑制癌细胞胸苷酸合酶抑制DNA复制致细胞死亡[8]。如所有抗癌药，5-FU全身循环有不良反应并损伤正常组织，但有报道5-FU联合第二药物可潜在减少副作用并提高癌症治疗总体疗效[9]。

NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）是黄素蛋白，肿瘤组织表达比正常组织高100-200倍[10]。该两电子氧化还原酶为可诱导II相解毒酶，通过形成稳定氢醌解毒醌类[11]。NQO1在正常人组织低基础水平表达，保护细胞抗氧化应激并稳定p53抑制因子。NQO1在乳腺癌、胰腺癌、鳞状细胞癌等多种癌症中持续过表达[12]。NQO1过表达促进癌症进展并使癌细胞对5-FU或顺铂等化疗药物（氧化应激诱导剂）更耐药，使NQO1成为提高疗效潜在致癌靶点[13]。报道siRNA敲低NQO1增强吉西他滨、多柔比星等多药细胞毒效应[14]。另有多种合成和天然NQO1抑制剂如香豆素、姜黄素、ES936[15-17]。本研究采用β-拉帕酮（β-lap，3,4-二氢-2,2-二甲基-2H-萘[1,2-b]吡喃-5,6-二酮）作为NQO1抑制剂[18]。β-lap通过NQO1依赖机制产生大量活性氧（ROS）导致DNA链损伤引起癌细胞死亡[19]。

利用纳米粒系统递送小分子成为癌症治疗有前景途径[20]。药物负载纳米粒需给药频次少、提高抗癌疗效、相对减少不良反应。在所有载体中，介孔二氧化硅纳米粒（MSN）显著潜力有效递送药物至肿瘤组织[21, 22]。微米级孔道允许稳定负载药物、防止全身循环中释放、利用增强渗透滞留效应（EPR效应）在漏性癌组织优先富集[23]。

总体，本研究主要目的结合5-FU和NQO1抑制剂治疗优势增强HNSCC抗癌效果。体外抗癌效果通过细胞活力、Western blot、流式细胞术/Hoechst凋亡分析、活/死分析等技术分析。体内研究在Cal33肿瘤细胞异种移植模型进行。

结论

总之，我们成功制备了5-FU+β-lap负载脂质双层包覆介孔二氧化硅纳米粒。研究表明：(i) β-lap在HNSCC肿瘤细胞中浓度依赖性抗肿瘤效应；(ii) 5-FU+β-lap联用显著抑制NQO1蛋白和Bcl-2蛋白；(iii) 基于载体的FNQ-MSN在HNSCC异种移植模型中显著减轻肿瘤负担。这些数据明确表明亚致死剂量NQO1抑制剂（β-lap）可潜在增强5-FU在HNSCC肿瘤中治疗疗效，并可潜在延伸至其他恶性肿瘤临床治疗。

材料与方法

5-FU/β-lap负载脂质双层-介孔二氧化硅纳米粒制备

将十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，210 mg）溶于180 mL水中加热至80℃，加入5-FU和β-lap（总纳米粒重量20% w/w），再加入氟化铵（NH₄F，30 mg）搅拌60 min。滴加1.6 mL四乙基正硅酸酯（TEOS）30 min并持续搅拌3 h。形成半透明白色胶体，10000 rpm离心15 min（24 ± 1℃）收集。MSN用超纯水重悬，离心重复2次。另制薄膜：用DSPE-PEG2000（MSN总重量2%）水化含药物负载MSN悬液。混合物立即探针超声5 min（50 W，室温25℃）。PEG化脂质双层支持MSN最终洗涤两次并超纯水重悬。

粒径、Zeta电位分析与形态分析

用Zetasizer Nano ZS（马尔文仪器，英国）测定粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位。采用动态光散射（DLS）机制分析，实验前颗粒分散液充分稀释。所有实验室温三重复。用透射电镜（TEM，CM 200 UT，飞利浦，美国）100 kV测定纳米粒形态。稀释颗粒分散液滴置300目TEM铜网沉降10 min，2%磷钨酸（PTA）负染色，自然干燥，透射电镜观察。

药物负载

通过计算上清液中未负载药物和纳米粒中负载药物两种方式分析药物负载。采用HPLC法测定负载效率。HPLC配备岛津LC-20 AD PLC泵和SPD-M20A PDA检测器、岛津LC分析软件、反相C18柱（Phenomenex C18, 150×4.6 mm, 5 μm）。5-FU流动相为乙腈/水（10:90, v/v），流速1 ml/min，检测波长265 nm。β-lap流动相为乙腈/水（31:69, v/v），检测波长254 nm，35℃。负载容量（LC）和负载效率（LE）按公式计算：

LE(%) = (W_{total 5-FU+β-lap} - W_{free 5-FU+β-lap}) / W_{total 5-FU+β-lap} × 100

LC(%) = (W_{total 5-FU+β-lap} - W_{free 5-FU+β-lap}) / W_{total NP mass} × 100

药物释放研究

用透析法在PBS（pH 7.4）和ABS（pH 5.0）37℃评价5-FU和β-lap释放。简述：装载相当于1 mg各药物负载纳米粒的透析袋置于1 ml相应缓冲液，密封两端。将密封透析袋置于25 ml相应ABS和PBS缓冲液中，37℃振荡水浴。预定时间间隔取样，等体积新鲜缓冲液补充。按前述HPLC法测定各缓冲液中药物释放量。

细胞培养与NQO1活性测定

Cal33 HNSCC细胞在含10% FBS和1%抗生素混合物的DMEM中培养，常规条件孵育。NQO1活性测定：Cal33细胞接种96孔板（8×10³细胞/孔）过夜。用不同浓度β-lap处理24 h。用0.8%地高辛（50 μl 2 nM EDTA）裂解细胞，以甲萘醌和MTT为底物偶联反应测定活性，620 nm测定。三重复实验。

体外细胞活力测定

采用MTS法测定β-lap浓度依赖性细胞活力及单药/联合方案细胞活力。Cal33细胞接种96孔板（1×10⁴细胞/孔）过夜。次日分别用增加浓度β-lap处理；分别用5, 10, 20 μg/ml基础浓度单药和联合方案5-FU、β-lap处理24 h。洗涤两次后按厂家指南加入MTS溶液。以未处理细胞为对照计算细胞活力，酶标仪460 nm测定吸光度。

Western Blot分析

6孔板接种细胞分别用增加浓度β-lap处理；单药（5-FU或β-lap）和联合方案（FNQ-MSN）处理24 h。收集细胞，裂解（M-per缓冲液），离心，收集含蛋白上清液。用BCA法测定细胞裂解液蛋白浓度。10% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并立即转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉在含Tween 20的TBS缓冲液（TBST，pH 7.2）中封闭。兔多克隆NQO1（1:1000）、小鼠单克隆Bcl-2（1:1000）、小鼠单克隆GAPDH（1:1000）一抗4℃过夜孵育。TBST洗膜后，二抗（抗小鼠或抗兔IgG）1:10000稀释孵育。再次TBST洗膜，ECL底物显影，照片显影仪评估蛋白条带密度。

凋亡与Hoechst分析

Cal33细胞接种6孔板（2×10⁵细胞/孔）过夜。分别用单药（5-FU或β-lap）和联合方案（FNQ-MSN）处理24 h。收集、洗涤、离心、沉淀细胞。用2.5 μl Annexin V和2.5 μl PI避光孵育15 min。定容至1 ml，流式细胞仪（BD FACSverse）分析，记录10,000细胞事件。同法接种处理后用Hoechst 33342染料（10 μg/ml）染色10 min。洗涤、4%多聚甲醛（PFA）固定、再洗涤。荧光显微镜（尼康A1，日本）观察细胞形态。

FNQ-MSN在HNSCC异种移植瘤模型抗肿瘤疗效

购自郑州轻工业大学河南实验动物中心18-22 g雄性BALB/c小鼠（4-5周龄）。恒温空调室（12 h明暗循环）饲养，自由饮食饮水。所有动物方案经郑州轻工业大学伦理委员会批准。建立异种移植模型：1×10⁷ Cal33细胞在150 μl培养基中皮下接种小鼠右髋。肿瘤平均体积达80-100 mm³时，随机分5组（对照、5-FU、β-lap、5-FU+β-lap、FNQ-MSN），每组8只。5-FU固定剂量5 mg/kg，β-lap固定剂量25 mg/kg，每3天尾静脉注射1次，共3次。定期监测小鼠体重和肿瘤体积18天。肿瘤体积计算公式：V(mm³) = 宽²(mm²) × 长(mm) / 2。研究期间未因肿瘤负载致小鼠死亡，实验结束时CO₂安乐死后颈椎脱位处死。

统计分析

多组比较用双向方差分析（ANOVA）。p < 0.05为显著，数据以均值±标准差表示除非特别说明。

结果与讨论

5-FU/β-lap负载脂质双层支持介孔二氧化硅纳米粒制备

本研究定制PEG化脂质双层稳定介孔二氧化硅纳米粒。采用乳液-超声法制备5-FU/β-lap负载MSN，将药物负载MSN引入含DSPE-PEG2000脂质薄膜烧瓶。混合物超声获得含5-FU/β-lap脂质包覆MSN（FNQ-MSN）（图1a）。5-FU和β-lap负载效率（LE）分别为91.5 ± 1.65%和92.9 ± 1.24%。FNQ-MSN表现出8.1 ± 1.12 wt% 5-FU和7.6 ± 0.95 wt% β-lap，显示MSN载体高负载容量（LC）。脂质双层防止全身循环中非预期释放从而防止毒性。药物负载MSN平均粒径92.1 ± 0.85 nm（PDI ~ 0.089），MSN表面组装脂质双层（FNQ-MSN）平均粒径增至128.4 ± 1.24 nm（PDI ~ 0.115），表明脂质材料稳固存在于MSN表面（图1b）。Zeta电位从-18.2 ± 1.22变为-26.4 ± mV。FNQ-MSN小粒径将使药物负载载体凭借EPR效应在漏性肿瘤组织优先富集。此外，表面PEG化赋予优异稳定性和延长血液循环时间，进一步增加FNQ-MSN在肿瘤组织机会。TEM图像显示类似脂质体形态，完美球形均匀分布网格上。TEM清晰显示灰色外层和深色核心，表明脂质组装在MSN表面（图1c）。TEM观测尺寸与Zetasizer DLS粒径一致。MSN具有序通道利于药物分子均匀分布。孔道表面性质是小分子稳定负载重要因素。主客体相互作用物理力主要包括疏水作用和范德华力。更高药物负载量提供更高细胞内浓度和肿瘤部位杀伤效率。FNQ-MSN在PBS中表现优异稳定性，粒径在30天研究期内保持不变。这种改进的载体系统稳定性和高负载能力将改善生物分布和肿瘤治疗效率。

体外药物释放

在PBS和ABS中研究FNQ-MSN中5-FU和β-lap体外释放（图2）。观察到pH 7.4和pH 5.0两种不同释放趋势。例如，pH 7.4下24 h释放25% 5-FU，pH 5.0下24 h释放~40%。类似地，pH 7.4和pH 5.0分别释放20%和30% β-lap。释放动力学整个研究期一致，pH 7.4下72 h释放50% 5-FU，pH 5.0下释放80%。酸性条件下pH响应性药物释放有利癌症治疗。两种pH条件下均未观察到爆发释放，主要归因于DSPE-PEG层控制FNQ-MSN药物释放。pH 7.4和pH 5.0药物释放显著差异。pH 7.4下PEG-b-DSPE表现高隐身层特性阻止包封化合物释放。结果显示pH 5.0药物释放加速，表明MSN表面保护壳解体。确保癌细胞内最大药物释放的pH敏感释放速率可提高抗肿瘤疗效并降低正常组织非预期毒性。FNQ-MSN可能在pH响应元件存在下导致MSN脂质双层脱落，从而在低pH条件下增强释放。

NQO1对β-lap敏感性

NQO1在包括HNSCC在内许多癌细胞上调与预后差和治疗结果差相关，靶向NQO1药物可成癌症治疗潜在策略[24]。NQO1在鳞癌中比正常组织过表达100-200倍。因此在Cal33细胞研究β-lap对NQO1酶活性影响。如图所示，β-lap在Cal33细胞中呈浓度依赖性抑制NQO1酶活性（图3a）。20-50 μg/ml β-lap剂量观察到显著抑制效应。Western blot进一步研究β-lap对NQO1蛋白抑制潜力（图3b）。结果清晰显示随β-lap浓度增加癌细胞NQO1蛋白显著下降。100 μg/ml β-lap观察到约80% NQO1抑制。NQO1生物激活药物如β-lap经NQO1代谢形成不稳定氢醌化合物即时转回原组分，留下2个单电子氧化并消耗2 O²⁻。这形成徒劳氧化还原循环：1分子β-lap以消耗60-70摩尔NAD(P)H为代价产生130摩尔超氧阴离子。形成的超氧阴离子（O₂^·−）转化为过氧化氢（H₂O₂⁻）导致细胞凋亡和死亡[25]。

FNQ-MSN在HNSCC细胞体外抗癌效果

MTT法研究β-lap在Cal33细胞体外抗癌效果。结果显示β-lap呈典型浓度依赖性降低细胞活力（图4a）。50 μg/ml浓度观察到显著降低细胞活力。后续实验选20 μg/ml（低于β-lap IC50值）。在3个不同浓度（5, 10, 20 μg/ml）研究β-lap对5-FU增敏效应。如图所示，5-FU+β-lap联用导致细胞活力更低；显著地，FNQ-MSN细胞活力显著低于单药或物理混合（图4b）。例如，5-FU和β-lap细胞活力分别为35.7%和70.2%，5-FU+β-lap为26.5%，FNQ-MSN为13.1%。结果明确显示β-lap联合显著增加5-FU细胞毒效应。值得注意的是FNQ-MSN比5-FU+β-lap更有效，归因于载体系统更好内化和负载治疗药物控释。结果明确揭示β-lap对NQO1酶活性和蛋白水平抑制效应，增强5-FU抗癌效果，导致HNSCC治疗治疗结果增强。

FNQ-MSN在信号通路作用：Western Blot分析

Western blot进一步探究β-lap介导细胞毒效应机制。如图所示，β-lap较对照组降低NQO1蛋白条带；但FNQ-MSN处理组NQO1水平下降最显著（图4c）。通过Bcl-2蛋白水平评价β-lap诱导增强Cal33化学敏感性促进细胞凋亡。Bcl-2家族在调节细胞稳态、控制癌细胞增殖和死亡中起重要作用。Bcl-2下降和Bax增加导致细胞色素C释放至胞质启动整个caspase级联反应致细胞死亡[26]。结果明确突出5-FU和β-lap联合（FNQ-MSN）显著下调Bcl-2，表明Cal33癌细胞抗癌效果增强。

HNSCC凋亡分析

细胞活力分析后，用流式细胞术经Annexin V/PI双染分析单药和联合药物对Cal33细胞凋亡效应（图5）。单药5-FU（10 μg/ml）或β-lap（30 μg/ml）凋亡效应未导致癌细胞显著凋亡；但5-FU+β-lap导致癌细胞凋亡比例剧增。关键是FNQ-MSN导致60%以上细胞凋亡（早期和晚期凋亡），表明载体联合给药方案优越治疗效果。Hoechst 33342染色进一步确认凋亡效应。如图所示，FNQ-MSN处理细胞凋亡、核浓缩和碎片化特征比单独5-FU或β-lap更多（图6）。凋亡过程中细胞收缩但外膜未损伤，导致染色质浓缩伴随凋亡小体形成增加。

活/死分析

用活/死分析进一步评价单药和联合药物抗癌效果。处理细胞经Calcein AM和溴化乙锭染色分别标记活/死细胞（图7）。未处理细胞100%绿色荧光。单药5-FU（10 μg/ml）或β-lap（30 μg/ml）虽显示轻微红色荧光染色细胞，但以绿色荧光细胞为主表明有限细胞死亡。FNQ-MSN处理癌细胞观察到显著细胞死亡，以红色荧光为主、绿色荧光染色细胞较少。FNQ-MSN更高抗癌效果归因于5-FU和β-lap在癌细胞协同活性及β-lap增强5-FU化学敏感性。

FNQ-MSN对HNSCC异种移植模型体内抗肿瘤疗效

为在动物模型进一步评价联合方案疗效，制备HNSCC异种移植瘤分别给予5 mg/kg 5-FU和10 mg/kg β-lap。β-lap药学级制剂ARQ761目前处于转移性恶性肿瘤治疗I期临床试验。临床前研究设定β-lap人体最大耐受剂量[27]。考虑此点，体内研究最优选择10 mg/kg β-lap剂量。如图所示，单独给予5-FU和β-lap与未处理对照组相比肿瘤体积无显著下降（图8a）。5-FU+β-lap物理混合组肿瘤体积显著下降；但载体递送5-FU和β-lap联合治疗（FNQ-MSN）显著延缓肿瘤生长并延长携瘤异种移植小鼠生存期。FNQ-MSN肿瘤体积曲线可分两部分：第9天前肿瘤体积无显著增长，第9-18天显著增加，但总体肿瘤体积比对照组或其他组小数倍。单药和联合方案毒性通过体重评价（图8b）。5-FU+β-lap物理混合导致严重毒性，表现为体重下降>10%，5-FU导致5%体重下降。如预期，FNQ-MSN未导致体重下降，显示脂质-MSN载体系统独特优势。FNQ-MSN增强抗肿瘤效应归因于：第一，β-lap抑制NQO1酶和蛋白进而增加5-FU化学敏感性产生协同抗癌效应；第二，脂质双层包覆MSN保护药物全身循环中稳定性并可能在肿瘤组织控释；第三，纳米载体PEG化延长血液循环时间使其凭借EPR效应在肿瘤组织优先富集[28, 29]。PEG化MSN主要滞留肝、脾、肺网状内皮系统（RES），占给药剂量80%以上。PEG修饰明显降低MSN在器官清除率，表明PEG化NPs无论粒子形状均更难从RES器官清除[30, 31]。总体，HNSCC模型体内研究提供“概念验证”：稳定纳米载体中有效5-FU+β-lap联合可增强肿瘤治疗疗效同时减轻相关毒性效应。