基于介孔二氧化硅纳米颗粒的 NQO1 抑制剂和 5-氟尿嘧啶的组合对头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 具有有效的抗肿瘤作用

介绍

头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 是最致命的癌症形式之一，90% 的癌症起源于鳞状细胞 [1]。 HNSCC 本质上是高度血管生成的，其脉管系统表达各种细胞因子，包括成纤维细胞生长因子 (FGF) 和血管内皮生长因子 (VEGF)，它们与较高的转移率和较差的存活率有关 [2]。中国 HNSCC 的发病率在癌症相关死亡中排名第六，2015 年登记的新病例约为 250,000 例，死亡病例为 77,500 例。由于侵袭性、早期复发、高转移和预后不良导致的高死亡率等因素，HNSCC的总体5年生存率非常低[3]。 HNSCC 的主要治疗选择是手术，然后是放疗或化疗。具体而言，如果在早期或手术后阶段有效地使用化学疗法，将抵消肿瘤的生长 [4, 5]。有效地使用化学疗法将根除肿瘤组织内的癌细胞，抑制肿瘤的复发。然而，基于单一药物的长期化疗往往会导致耐药性和疗效降低[6]。因此，有必要采用创新策略来提高HNSCC患者的生存率和生活质量。

用于治疗 HNSCC 的几种抗癌剂包括顺铂、5-氟尿嘧啶 (5-FU)、紫杉醇或多西紫杉醇。其中，5-氟尿嘧啶 (5-FU) 被用作 HNSCC 和其他鳞状细胞癌治疗的一线治疗 [7]。 5-FU 是一种嘧啶类似物，它通过不可逆地抑制癌细胞内的胸苷酸合酶来抑制 DNA 复制，从而导致细胞死亡 [8]。与所有抗癌药物一样，5-FU 在体循环中并非没有副作用，对正常组织造成毒性，而据报道，5-FU 与辅助药物联合使用可能会减少副作用并改善癌症治疗的总体疗效[9].

NAD(P)H:醌氧化还原酶 1 (NQO1) 是一种黄素蛋白，与正常组织相比，它在肿瘤组织中升高 100-200 倍 [10]。双电子氧化还原酶是一种诱导型 II 相解毒酶，能够通过形成稳定的氢醌来解毒醌 [11]。 NQO1 显示在正常人体组织中以低基础水平表达，在那里它保护细胞免受氧化还原循环和氧化应激，并稳定 p53 抑制因子。 NQO1 在多种癌症中组成型过度表达，包括乳腺癌、胰腺癌和鳞状细胞癌 [12]。 NQO1 的过表达促进了癌症负担的进展，并使癌细胞对 5-FU 或顺铂（氧化应激诱导剂）等化疗药物更具抵抗力，从而使 NQO1 成为提高治疗效果的潜在肿瘤靶点 [13]。据报道，siRNA 对 NQO1 的敲低增强了多种药物（如吉西他滨或多柔比星）的细胞毒作用 [14]。此外，还报道了几种合成和天然 NQO1 抑制剂，如香豆素或姜黄素或 ES936 [15,16,17]。在本研究中，我们采用了 ß-lapachone（ß-lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtho [1,2-b]pyran-5,6-dione）作为 NQO1 抑制剂 [ 18]。 ß-lap 通过依赖于 NQO1 的机制起作用并产生大量活性氧 (ROS)，这将导致 DNA 链受损并导致癌细胞死亡 [19]。

使用纳米粒子全身递送小分子成为癌症治疗的一种有前途的方法 [20]。载药纳米颗粒需要较少的给药方案，并显示出提高抗癌功效并相对减少不良反应。在所有载体中，介孔二氧化硅纳米颗粒 (MSN) 具有将有效载荷有效递送至肿瘤组织的巨大潜力 [21, 22]。微米尺寸的孔允许药物稳定负载并防止其在体循环中释放，并利用增强渗透和保留（EPR）效应允许在渗漏的癌组织中优先积累[23]。

总体而言，本研究的主要目的是结合 5-FU 和 NQO1 抑制剂的治疗益处，以增强 HNSCC 的抗癌作用。使用各种技术分析体外抗癌效果，例如细胞活力、蛋白质印迹分析、流式细胞仪/基于 Hoechst 的细胞凋亡测定和活/死测定。对Cal33肿瘤细胞移植瘤模型进行了体内研究。

结论

总之，我们已经成功地配制了 5-FU+ß-lap 负载的脂质双层包被的介孔二氧化硅纳米粒子。我们已经表明 (i) ß-lap 在 HNSCC 肿瘤细胞中以浓度依赖性方式的抗肿瘤作用，(ii) 5-FU+ß-lap 的组合导致 NQO1 蛋白和 Bcl-2 蛋白的显着抑制，（ iii) 基于组合的 FNQ-MSN 证明 HNSCC 异种移植物中的肿瘤负荷显着减少。这些数据明确指出，亚致死剂量的 NQO1 抑制剂 (ß-lap) 可能会增强 5-FU 对 HNSCC 肿瘤的治疗效果，并有可能扩展到其他恶性肿瘤的临床治疗。

材料和方法

5-FU/ß-lap-Loaded Lipid Bilayer-Mesoporous Silica Nanoparticles 的制备

通过将十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) (210 mg) 溶解在 180 ml 水中并煮沸至 80 °C，然后加入 5-FU 和 ß-lap 制备载药 MSN，占总纳米颗粒的 20% w/w 和然后加入氟化铵（NH4F）（30 mg）并充分搅拌60 分钟。接着在30 min内滴加1.6 ml原硅酸四乙酯(TEOS)，连续搅拌3 h。形成半透明的白色胶体，在 24±1 °C 下以 10000 rpm 离心（15 分钟）后收集。将 MSN 重悬于超纯水中，重复离心 2 次。另外，使用 DSPE-PEG2000（MSN 总重量的 2%）制备薄膜膜，并用悬浮有载药 MSN 的水进行水合。混合物立即在室温（25 °C）下以 50 W 探头超声处理 5 分钟。最后将聚乙二醇化脂质双层负载的MSN洗涤2次后重悬于超纯水中。

粒径、Zeta 电位分析和形态分析

使用 Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments，Malvern，UK）评估粒径、多分散指数 (PDI) 和 zeta 电位。使用动态光散射 (DLS) 机制分析粒子，并在实验前充分稀释粒子分散体。所有实验在室温下一式三份进行。纳米粒子的形态通过透射电子显微镜 (TEM) 使用 CM 200 UT，飞利浦，马萨诸塞州，美国) 在 100 kV 下操作来确定。简而言之，将颗粒分散体稀释，将一滴液滴置于 300 目 TEM 网格中并使其沉降 10 分钟。颗粒用2%磷钨酸（PTA）复染阴性染色，风干，透射电镜观察。

药物加载

通过计算上清液中未加载或未结合的药物和纳米颗粒中加载的药物，进行两种载药分析。载药效率采用高效液相色谱法测定。 HPLC配备Shimadzu LC-20 AD PLC泵和SPD-M20A PDA检测器和分析软件Shimadzu LC，含有反相C18柱（Phenomenex C18，150 4.6 mm，5 μm）。 5-FU 的流动相由乙腈和水的混合物 (10:90, v/v) 组成，以 1 ml/min 的速度泵入。 5-FU 的检测波长设置为 265 nm。 ß-lap 的流动相由乙腈/水 (31:69, v/v) 组成，检测波长设置为 254 nm，温度 35 °C。 5-FU/ß-lap的负载能力（LC）和负载效率（LE）通过相应的公式计算。

药物释放研究

5-FU 和 ß-lap 的释放在 PBS (pH 7.4) 和 ABS (pH 5.0) 中于 37 °C 下使用透析方法进行评估。简而言之，将 1 mg 当量的每个载药纳米颗粒加载到透析膜中的 1 ml 相应缓冲液中，并密封末端。将密封的透析膜置于 25 ml 各自的 ABS 和 PBS 缓冲液中，并置于 37 °C 的振荡水浴中。在预定的时间间隔收集样品并更换为等体积的新鲜缓冲液。如前一节所述，通过 HPLC 方法评估了相应缓冲液中释放的药物量。

细胞培养和 NAD(P)H：醌氧化还原酶 1 (NQO1) 活性测定

Cal33 HNSCC 细胞在补充有 10% FBS 和 1% 抗生素混合物的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中培养。细胞在培养箱中保持在环境条件下。对于 NQO1 活性测定，Cal33 细胞以 8 × 10 ³ 的接种密度接种在 96 孔板中 每孔细胞并孵育过夜。细胞用不同浓度的 ß-lap 处理并孵育 24 h。使用 0.8% 毛地黄皂苷（50 μl 的 2 nM EDTA）裂解细胞，并使用甲萘醌和 MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）进行测定。在620 nm处测量底物偶联反应和活性。该测定一式三份进行。

体外细胞活力测定

通过 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4 -磺苯基)-2H-四唑鎓(MTS)测定。简而言之，将 Cal33 细胞以 1 × 10 ⁴ 的接种密度接种于 96 孔板中。 每孔细胞并孵育过夜。第二天，细胞分别用浓度增加的 ß-lap 处理；将细胞用 5-FU 和 ß-lap 的单独和组合方案以 5、10 和 20 μg/ml 的基础浓度处理，并孵育 24 小时。根据制造商的指南，将细胞洗涤两次并用 MTS 溶液处理。计算未处理细胞的细胞活力，酶标仪检测460 nm处的吸光度。

蛋白质印迹分析

6 孔板中的接种细胞分别用增加浓度的 ß-lap 处理；用单独的（5-FU 或 ß-lap）和 5-FU 和 ß-lap（FNQ-MSN）的组合方案处理细胞，并孵育 24 小时。收获细胞、裂解（每缓冲液 M 倍）并离心，收集含有蛋白质的上清液。使用二辛可宁酸 (BCA) 方法评估细胞裂解物中的蛋白质浓度。 10% 的 Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶用于分离蛋白质并立即转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。使用在含有吐温 20（TBST，pH 7.2）的 n Tris 缓冲盐水 (TBS) 缓冲液中制备的 5% 脱脂牛奶封闭膜。兔多克隆 NQO1 (1:1000)、小鼠单克隆 Bcl-2 (1:1000) 和小鼠单克隆 GAPDH (1:1000) 的一抗在膜上于 4 °C 下孵育过夜。用 TBST 洗涤膜，然后用稀释度为 1:10000 的二抗（抗鼠或抗兔 IgG）孵育。再次用TBST洗涤膜，将印迹暴露于ECL底物溶液中，并用显影剂评估蛋白质条带的密度。

细胞凋亡和 Hoechst 检测

Cal33细胞接种于6孔板中，接种密度为2×10 ⁵ 每孔细胞并孵育过夜。然后用单独的（5-FU 或 ß-lap）和 5-FU 和 ß-lap（FNQ-MSN）的组合方案处理细胞，并孵育 24 小时。收获、洗涤、离心和沉淀细胞。细胞用 2.5 μl 膜联蛋白 V 和 2.5 μl PI 处理，并在黑暗条件下孵育 15 分钟。然后将细胞定容至 1 ml，并使用荧光激活细胞分选（FACS、BD、FACSverse）进行评估。总共分析了 10,000 个细胞。遵循细胞接种和药物处理的类似程序，然后用 Hoechst 33342 染料 (10 μg/ml) 染色并孵育 10 分钟。用 4% 多聚甲醛 (PFA) 洗涤和固定细胞并再次洗涤。在荧光显微镜（Nikon A1，日本）下观察细胞形态。

FNQ-MSN 在 HNSCC 异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤功效

18 至 22 克雄性 BALB/c 小鼠平均 4-5 周龄，购自河南郑州轻工业大学室内动物设施中心。将动物饲养在空调房中，暗光循环为 12 h，并可以自由进食和饮水。所有动物实验方案均经河南郑州轻工业大学伦理委员会批准。建立异种移植模型，1 × 10 ⁷ Cal33 细胞在 150 μl 培养基中被接种到小鼠的右臀部皮下。当肿瘤平均大小达到80-100 mm3时，将小鼠随机分为5组作为对照，分别为5-FU、ß-lap、5-FU+ß-lap和FNQ-MSN，每组8只小鼠. 5-FU以5 mg/kg的固定剂量给药，ß-lap以25 mg/kg的固定剂量给药，每次尾静脉注射间隔3 天给药3次。定期监测小鼠体重和肿瘤体积 18 天。肿瘤体积计算公式为

本研究未观察到任何小鼠因肿瘤细胞加载而死亡，所有动物都用二氧化碳安乐死，然后在研究结束时通过颈椎脱臼处死。

统计分析

使用双向方差分析 (ANOVA) 比较多个组。 p 的显着性水平 <0.05 被认为是显着的，所有数据均以平均值±标准差的形式呈现，除非在各自的实验中特别提到。

结果与讨论

5-FU/ß-lap-Loaded 脂质双层负载介孔二氧化硅纳米粒子的制备

在这项研究中，我们定制了一种由聚乙二醇化脂质双层稳定的介孔二氧化硅纳米颗粒。 5-FU/ß-lap-loaded MSN 采用乳化超声法制备，然后将载药 MSN 引入含有 DSPE-PEG2000 脂质薄膜的烧瓶中。对混合物进行超声处理，获得含有 5-FU/β-lap 的脂质包覆 MSN（FNQ-MSN）（图 1a）。 5-FU 和 ß-lap 的加载效率 (LE) 分别为 91.5 ± 1.65% 和 92.9 ± 1.24%。 FNQ-MSN 表现出 8.1 ± 1.12 wt% 的 5-FU 和 7.6 ± 0.95 wt% 的 ß-lap，表明 MSN 载体的高负载能力 (LC)。脂质双层的存在将防止其在体循环中不想要的释放，从而防止毒性。载药 MSN 的平均粒径为 92.1 ± 0.85 nm (PDI ~ 0.089) 而 MSN 表面脂质双层的组装 (FNQ-MSN) 使平均粒径增加至 128.4 ± 1.24 nm (PDI ~ 0.115) MSN 表面脂质材料的固体存在（图 1b）。 zeta 电位从 − 18.2 ± 1.22 变为 − 26.4 ± mV。由于 EPR 效应，FNQ-MSN 的小粒径将允许载药载体优先积聚在渗漏的肿瘤组织中。此外，表面聚乙二醇化将赋予优异的稳定性和延长的血液循环时间，这将进一步增加 FNQ-MSN 在肿瘤组织中的机会。 TEM 图像显示出与脂质体的形态相似，并呈现出完美的球形，均匀分布在网格上。 TEM 图像清楚地显示出灰色的外层和较暗的核心，表明 MSN 表面存在脂质组装（图 1c）。从 TEM 观察到的尺寸与来自 zetasizer 的 DLS 颗粒尺寸相一致。 MSN 拥有用于药物分子均匀分布的有序通道。孔的表面性质是小分子稳定负载的重要因素之一。主客体相互作用中涉及的各种物理力主要包括疏水力和范德华相互作用力。更高的载药量将提供更高的细胞内浓度和更高的肿瘤部位杀伤效率。 FNQ-MSN 在 PBS 培养基中表现出优异的稳定性，并且在整个研究期间粒径保持不变，直到 30 天。这种载体系统稳定性的提高和载体系统的高负载能力将改善肿瘤治疗中的生物分布和效率。

一 5-FU 和 ß-lap 负载脂质双层包被的介孔二氧化硅纳米粒子的构建示意图。两种药物装载在 MSN 的孔中，通过 MSN 外表面上的聚乙二醇化脂质双层组件进一步稳定。 b FNQ-MSN 的粒径分布。 c FNQ-MSN TEM图像，放大倍率较高

体外药物释放

在 PBS 和 ABS 中研究了来自 FNQ-MSN 的 5-FU 和 ß-lap 的体外药物释放（图 2）。如图所示，在 pH 7.4 和 pH 5.0 中观察到两种不同的释放趋势。例如，25% 的 5-FU 在 pH 7.4 的 24 h 内释放，而在 pH 5.0 的 24 h 释放约 40% 的药物。类似地，分别在 pH 7.4 和 pH 5.0 中释放 20% 和 30% 的 ß-lap。整个研究期间的释放动力学是相同的，50% 的 5-FU 在碱性缓冲液中释放，80% 的药物在 pH 5.0 时释放，研究 72 小时后。在酸性条件下药物的 pH 响应性释放有利于癌症治疗。在两种 pH 条件下均未观察到突释现象，这主要归因于在整个研究期间控制药物从 FNQ-MSN 释放的 DSPE-PEG 层的存在。在 pH 7.4 和 pH 5.0 条件下观察到药物释放的显着差异。在 pH 7.4 条件下，PEG-b -DSPE 表现出高隐形层特性，从而防止封装化合物的释放。目前的结果表明，在 pH 5.0 时药物释放加速，表明 MSN 表面周围的保护壳发生了分解。 pH 敏感的药物释放速率可确保在癌细胞内最大程度地释放药物，可提高抗肿瘤功效并降低对正常组织的有害毒性。可能在pH响应元件存在下，FNQ-MSN可能导致MSN上的脂质双层脱落，导致在较低pH条件下释放增加。

在 pH 7.4 和 pH 5.0 缓冲条件下，FNQ-MSN 中 5-FU 和 ß-lap 的体外释放。释放研究持续至72 h，并使用HPLC法定量药物释放。 **p <0.01

NQO1 对 ß-lap 的敏感性

由于 NQO1 在包括 HNSCC 在内的许多癌细胞中的上调与不良预后和不良治疗结果相关，因此靶向 NQO1 的药物可能是癌症治疗的潜在策略 [24]。与正常组织相关的 NQO1 在鳞状细胞癌中的过度表达水平为 100 到 200 倍。因此，在 Cal33 细胞中研究了 ß-lap 对 NQO1 酶活性的影响。如图所示，ß-lap 在 Cal33 细胞中显示出浓度依赖性的 NQO1 酶活性抑制（图 3a）。值得注意的是，在 20–50 μg/ml 的 ß-lap 剂量下观察到显着的抑制作用。此外，通过蛋白质印迹分析进一步研究了 ß-lap 对 NQO1 蛋白的抑制潜力（图 3b）。结果清楚地表明，随着 ß-lap 浓度的增加，癌细胞中 NQO1 蛋白显着降低。在 100 μg/ml 的 ß-lap 下观察到大约 80% 的 NQO1 抑制。 NQO1 生物可活化药物如 ß-lap 被 NQO1 代谢并形成不稳定的氢醌化合物，该化合物立即转化回原始成分，留下 2 个单电子氧化并消耗 2 O ²⁻ .这将创建一个无效的氧化还原循环，其中 1 分子的 ß-lap 将产生 130 摩尔的超氧化物，代价是消耗 60-70 摩尔的 NAD(P)H6。如此形成的超氧化物（O2.-）自由基会转化为过氧化氢（H2O2-）并导致细胞凋亡和细胞死亡[25]。

一 通过酶促方法，ß-lap 的浓度依赖性活性对 Cal33 癌细胞的 NQO1 活性的影响。 b 通过使用GAPDH作为看家蛋白的蛋白质印迹分析β-lap浓度依赖性活性对NQO1蛋白水平的影响

FNQ-MSN 在 HNSCC 细胞中的体外抗癌作用

MTT法研究了β-lap在Cal33细胞中的体外抗癌作用。结果显示 ß-lap 表现出典型的浓度依赖性细胞活力降低（图 4a）。值得注意的是，在 50 μg/ml 的浓度下观察到细胞活力显着降低。对于进一步的实验，选择了 20 μg/ml（低于 ß-lap 的 IC50 值）。接下来，在 3 种不同浓度（5、10 和 20 μg/ml）下研究了 ß-lap 对 5-FU 的增强作用。如图所示，5-FU+ß-lap 的组合导致较低的细胞活力；最值得注意的是，与任何单个药物或物理组合相比，FNQ-MSN 表现出显着较低的细胞活力（图 4b）。例如，5-FU 和 ß-lap 的细胞活力分别为 35.7% 和 70.2%，而 5-FU+ß-lap 和 FNQ-MSN 分别为 26.5% 和 13.1%。结果清楚地表明，当与 ß-lap 结合使用时，5-FU 的细胞毒性作用显着增加。值得注意的是，FNQ-MSN 与 5-FU+ß-lap 相比更有效，这归因于载体系统中负载治疗剂的更好内化和受控释放。结果清楚地揭示了ß-lap对NQO1酶活性和蛋白质水平的抑制作用，并增强了5-FU的抗癌作用，从而提高了治疗HNSCC的疗效。

一 ß-lap 的浓度依赖性活性对 Cal33 细胞活力的影响。 b 分别为 5-20 μg/ml 的 3 种不同浓度的 5-FU 单独和与第二种化学治疗剂组合的细胞毒性作用。培养24 h后通过MTT法评估细胞活力。 c 单独和5-FU和β-lap联合处理后NQO1和Bcl-2蛋白表达的Western blot分析

FNQ-MSN 在信号通路中的作用：蛋白质印迹分析

通过蛋白质印迹分析进一步探索了 ß-lap 介导的细胞毒性作用的机制。如图所示，与对照相比，ß-lap 导致 NQO1 的蛋白质条带减少；然而，在 FNQ-MSN 处理的细胞组中观察到 NQO1 水平的最显着下降（图 4c）。通过 Bcl-2 蛋白水平评估 ß-lap 诱导的 Cal33 化学敏感性增强通过增强细胞凋亡。 Bcl-2家族在调节细胞稳态和控制癌细胞的增殖和死亡方面起着重要作用。 Bcl-2 减少和 Bax 增加的过程导致细胞溶质中细胞色素 C 的释放，这将启动整个半胱天冬酶级联反应，导致细胞死亡 [26]。结果清楚地表明，5-FU和ß-lap（FNQ-MSN）的组合显着下调了Bcl-2，表明Cal33癌细胞的抗癌作用增强。

HNSCC 细胞凋亡分析

在细胞活力分析之后，在膜联蛋白 V/PI 染色后通过流式细胞仪评估单个和组合药物对 Cal33 细胞的凋亡作用（图 5）。单独的 5-FU (10 μg/ml) 或 ß-lap (30 μg/ml) 的细胞凋亡作用不会导致癌细胞出现任何明显的细胞凋亡；然而，5-FU+ß-lap 导致癌细胞凋亡比例急剧增加。重要的是，FNQ-MSN 导致超过 60% 的细胞凋亡（早期和晚期凋亡），这表明基于载体的联合方案具有优越的治疗效果。 Hoechst 33342染色进一步证实了细胞凋亡作用。如图所示，与单独的 5-FU 或 ß-lap 相比，用 FNQ-MSN 处理的细胞导致更多数量的细胞发生凋亡、核浓缩和断裂特征（图 6）。在细胞凋亡过程中，细胞在细胞外膜未受损的情况下收缩，导致染色质凝聚，凋亡小体形成增加。

使用单独和 5-FU 和 ß-lap 组合处理后，使用膜联蛋白 V 和 PI 双重染色对 Cal33 细胞进行流式细胞仪分析。流式细胞仪记录了 10,000 个事件

用Hoechst 33342染色后Cal33细胞的核形态分析；用单独的和组合的 5-FU 和 ß-lap 处理细胞。流式细胞仪记录了 10,000 个事件

活/死检测

The anticancer effect of individual and combined drug was further evaluated by the Live/Dead assay. The treated cells were subjected to Calcein AM and ethidium bromide staining as a respective marker of live and dead cells (Fig. 7). As shown, untreated cells are stained with 100% of green fluorescence. The individual drugs, 5-FU (10 μg/ml) or ß-lap (30 μg/ml) though showed slight red fluorescence stained cells; however, predominant cells exhibited green fluorescence indicating limited cell death. Remarkable cell death was observed in FNQ-MSN-treated cancer cells as shown by predominant red fluorescence and fewer green fluorescence stained cells. The higher anticancer effect of FNQ-MSN was attributed to the synergistic activity of 5-FU and ß-lap in the cancer cells and the ability of ß-lap to increase the chemosensitivity of 5-FU.

Live/dead analysis of Cal33 cells using double staining of Calcein AM and ethidium bromide after treatment with individual and combination of 5-FU and ß-lap

In Vivo Antitumor Efficacy of FNQ-MSN Against HNSCC Xenograft Model

To further evaluate the efficacy of combinational regimen in an animal model, HNSCC xenograft was prepared and administered with 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap, respectively. The pharmaceutical grade of ß-lap is ARQ761 which is presently in phase I clinical trial for the treatment of metastatic malignancies. ß-lap has set the limit for the maximum tolerable dose in humans as per the preclinical studies [27]. Keeping this in mind, we have optimally selected a dose of 10 mg/kg of ß-lap for the in vivo studies. As shown, no significant decrease in tumor volume was observed with individually administered 5-FU and ß-lap compared with that of non-treated control (Fig. 8a). Notable decrease in tumor volume was observed with a physical mixture of 5-FU+ß-lap; however, combined treatment of carrier-based 5-FU and ß-lap (FNQ-MSN) significantly delayed the tumor growth and prolonged the survival of tumor-bearing xenograft mice. The tumor volume graph of FNQ-MSN could be divided into two parts; insignificant growth in tumor volume was observed until day 9 while tumor significantly increased after day 9 until day 18, nevertheless, overall tumor volume was manifold smaller compared with that of control or other groups. The toxicity concern of the individual and combinational regimen was evaluated in terms of body weight (Fig. 8b). As shown, physical mixture of 5-FU+ß-lap resulted in severe toxicity as represented by more than 10% loss in body weight while 5-FU resulted in 5% of body weight. As expected, FNQ-MSN did not result in any loss of body weight indicating the unique advantage of the lipid-MSN-based carrier system. The enhanced antitumor effect of FNQ-MSN was attributed to the inhibitory effect of ß-lap towards the NQO1 enzyme and protein which in turn increased the chemosensitivity of 5-FU and resulted in synergistic anticancer effect in the Cal33 human tumors, second, lipid bilayer–coated MSN protected the drug during the systemic circulation and might release in a controlled manner in the tumor tissue, third, PEGylation of nanocarrier might prolonged the blood circulation time allowing for the preferential accumulation in the tumor tissues owing to EPR effect [28, 29]. PEGylated MSN were mainly trapped in RES of the liver, spleen, and lung, accounting for over 80% of the administered dose. PEG modification of MSN obviously decreased the clearance rate of MSN in organs, demonstrating that the PEGylated NPs were more difficult to be removed from the RES organs regardless of the particle shape [30, 31]. Overall, in vivo study on HNSCC model offer a “proof of concept” that effective combination of 5-FU+ß-lap in stable nanocarrier might enhance the therapeutic efficacy in tumor while alleviating the associated toxic effect.

一 In vivo antitumor efficacy of FNQ-MSN in HNSCC xenograft model. The mice bearing HNSCC tumors were treated with 5-FU, ß-lap, 5-FU+ß-lap and FNQ-MSN at a fixed dose of 5 mg/kg of 5-FU and 10 mg/kg of ß-lap intravenously for 3 times. Tumor volume was noted as a part of efficacy analysis and compared with non-treated control. b Body weight analysis corresponding to tumor volume data. *p <0.05 and ***p <0.001

数据和材料的可用性

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

缩写

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced permeation and retention effect

FNQ-MSN:

5-FU/ß-lap-loaded mesoporous silica nanoparticles

HNSCC:

Head and neck squamous cell carcinomas

MSN:

Mesoporous silica nanoparticle

NQO1:

NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1

ß-lap:

ß-lapachone