原位制备的壳聚糖/银纳米颗粒溶液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株的抗菌活性

背景

尽管存在大量抗生素和防腐剂，但感染仍然是全世界发病率和死亡率的主要原因。在中度和重度感染中，通常在获得细菌学检查结果之前凭经验开始抗生素治疗。抗生素的持续使用为抗生素耐药微生物的选择和繁殖创造了有利条件[22]。现在有文献证明，对所有感染过程的病原体的多药耐药率很高 [6]。最臭名昭著的多重耐药菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) [9]。该病原体导致了广泛的人类和动物疾病，从皮肤感染到肺炎、心内膜炎和败血症等严重疾病，这些感染可能会影响人类健康 [32]。对治疗不足患者感染的病因分析显示，32.6% 的基于 MRSA 的感染病例治疗不充分 [12] 并与每年 3-40 亿美元的医疗保健费用相关 [32]。

研究抗MRSA的新药有效是现代医学的一个紧迫课题。作为抗生素替代品的防腐剂是针对耐药菌株的强效、持续和活性制剂，并且不会违反微生物群落。克服这些问题需要新的和创新的准备。通过设计混合纳米材料结合不同抗菌作用机制的方法为对抗耐药细菌提供了新的范例[18]。金属，例如铜和银，在极低的浓度下对细菌具有极大的毒性。由于具有杀生物活性，金属已被广泛用作与农业、医疗保健和一般工业相关的多种应用中的抗微生物剂。与其他抗菌剂不同，金属在目前工业中发现的条件下是稳定的，可以用作添加剂 [19]。

银的抗菌特性在古代就已为人所知，细菌对抗生素的耐药性不断增加，合成抗生素对某些细菌菌株无效，这导致人们重新关注银、银盐、银化合物和纳米晶银作为抗菌剂。银纳米粒子 (Ag NPs) 具有显着的抗菌和抗真菌作用 [26]。 Ag NPs 显示出与其他抗生素和防腐剂（头孢他啶、链霉素、卡那霉素、多粘菌素）的协同作用 [25, 38]。但 J. Jains 研究表明，氯霉素会降低 Ag NPs 溶液的抗菌作用 [16]。

限制使用 Ag NPs 的主要缺点是它们容易聚集、银离子的不受控制的释放以及它们的细胞毒性潜力 [40]。 Ag NPs 与天然试剂，如壳聚糖、蜂胶、粘土或沸石 [33, 35] 的组合，提供了额外的效果。聚合物和纳米银的结合可以协同提高它们的抗菌作用，而原位合成方法的使用可以使其掺入聚合物基质中，实现均匀分布并避免聚集[28]。

近年来，绿色化学方法合成金属纳米颗粒的效率显着提高[1]。植物提取物通常用作还原剂、稳定剂和封端剂 [23]，为 NPs 合成提供了经济高效且环境友好的方法。在植物提取物中，姜提取物因其化学和生物学特性而具有重要的科学意义[8]。姜叶提取物已用于合成银纳米颗粒 [37]；然而，产生的颗粒具有相当宽的粒径分布（10-100 nm）。姜根茎被广泛用作香料和民间药物；它的提取物含有特定的酚类化合物：姜辣素及其衍生物、许多具有生物活性的酚类和非酚类成分 [31]。这些化合物表现出广泛的活性，包括抗微生物、抗真菌和抗病毒活性。姜根提取物似乎是开发具有生物活性和生物相容性纳米颗粒的非常有前途的基质，因为它也表现出抗氧化和抗炎特性。

几丁质和壳聚糖因其抑菌/杀菌特性以及与人体组织的生物相容性而成为有前途的医学应用材料 [20]。壳聚糖是甲壳素的衍生物，可通过甲壳素脱乙酰化得到。它们都包含相同的单体，N -乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖，它们的乙酰化和脱乙酰化单体的比例不同。壳聚糖是一种很有前途的材料，可以与不同的物质形成复合材料，包括金属纳米粒子，如银和铜 [33]。另一方面，西曲溴铵 (CTAB) 可以稳定溶液中的纳米粒子并降低某些纳米粒子的毒性，例如 ZnO、TiO2 和 Ni [17]。但有关CTAB-NPs复合物抗菌活性的数据有限[7]。

本研究的目的是寻找壳聚糖和纳米银纳米粒子的最佳比例，通过 CTAB 修饰以获得对 MRSA 临床菌株具有活性的溶液组成（壳聚糖/银）。

方法

材料

硝酸银、L-抗坏血酸和西曲溴铵 (C16H33)N(CH3)3Br (CTAB) 购自 Sigma-Aldrich 并按原样使用。生姜 (生姜 , 姜科 ) 根茎购自当地超市（波兰波兹南）。壳聚糖 200 kDa，脱乙酰度 82% 购自 CJSC“Bioprogress”（俄罗斯，莫斯科），无需进一步纯化即可使用。超纯水（电阻率> 17 MΩcm ^{− 1} ) 来自 GZY-P10 水系统用于整个实验。所有含有抗生素的培养基和磁盘均购自 Hi Media（印度）。

壳聚糖/银纳米颗粒溶液的原位制备

为了原位制备壳聚糖/银溶液，首先合成并修饰了银纳米颗粒。

Ag NPs 的合成

Ag NPs 是使用绿色化学方法通过化学还原法合成的。按照这种方法，我们使用了生姜 (Zingiber officinale ) 提取物作为表面活性剂，抗坏血酸（维生素 C）作为还原剂。为了制备姜根茎提取物，将 250 克根茎用蒸馏水彻底清洗，然后切成小块。切碎的生姜根茎在水-乙醇溶液（250 毫升，1:1 比例）中保存 5 天（室温、暗处）。然后，将上清液真空过滤（通过 Whatman 滤纸）并储存（在 4°C 下）。为了合成 Ag NP，将硝酸银（840 毫克）溶解在水（20 毫升）中，并加入姜根茎提取物（20 毫升）。然后，在磁力控制下，将 L-抗坏血酸溶液（10%，10 毫升）和姜提取物（20 毫升）的混合物滴加到硝酸银溶液中。反应混合物变暗。然后，在回流下加热（60°C，1.5 小时）。然后，使用离心法（4000 rpm，30 分钟）用水洗涤新合成的 Ag NP，直至 pH 值达到 7。

为了提高Ag NPs的抗菌活性和分散性，通过CTAB对Ag NPs进行表面改性，由于其表面活性和防腐性能而广为人知[17]。通常，将 Ag NP 的分散体（3 毫升，76.4 毫克/毫升）与 CTAB 溶液（20 毫升，6.7 毫克/毫升）混合并进行超声处理（3 小时）。然后，收集上清液用于 UV-Vis 测量，并使用离心（4000 rpm，30 分钟）3 次用水洗涤 Ag NP。使用分光光度法 (UV-Vis) 通过监测 190 nm 峰的强度确定上清液中 CTAB 的含量。根据溶液中初始 CTAB 含量与其在与样品相互作用后上清液中的含量之间的差异计算 Ag NPs（以 mg/g 为单位）对 CTAB 的吸附性。吸附率和CTAB负载量由下式计算：

吸附率(mg/g) =(溶液中CTAB的重量 − 上清液中CTAB的重量)/(Ag NPs的重量),

CTAB负载量(%) =(1 − (Ag NPs的重量)/(CTAB负载的Ag NPs的重量)) × 100%。

壳聚糖/银纳米颗粒溶液的原位制备

为了获得壳聚糖/Ag NPs 溶液，在室温下将 200 kDa 壳聚糖（1 g）溶解在 2% 乙酸（100 ml）中 24 小时以形成 1% 壳聚糖溶液。实验中使用了两种Ag NPs样品——纯Ag NPs和Ag NPs-CTAB。

Ag NPs 和壳聚糖的物理化学表征

粉末 X 射线衍射 (XRD) 研究在 Empyrean 衍射仪 (PANalytical) 上进行，使用 Cu Kα 辐射 (1.54 Å)、反射-透射旋转器（样品台）和 PIXcel 3D 探测器，在 Bragg-Brentano 几何结构中运行. 2Theta扫描在室温下以10°到95°的角度范围以0.007°的步长在连续扫描模式下记录。

透射电子显微镜 (TEM) 测量使用 JEM-ARM-200F 透射电子显微镜在 200 kV 的加速电压下运行。

使用配备全局源和 MCT 检测器的 Tensor 27 (Bruker Optics) 光谱仪获得红外光谱。使用溴化钾作为基质材料制备样品，并以 1 mg 样品与 200 mg KBr 的比例混合。使用标准技术在 10 吨/厘米 ² 的压力下制备颗粒 枪管直径为 16 毫米。测量在室温下进行。对于每个光谱，在 4000–400 cm ^{− 1} 的光谱范围内进行 512 次扫描 以 4 cm ^{− 1 的分辨率拍摄。} 数据采用Opus软件包进行处理。

分光光度测量 (UV-Vis) 使用 UV/VIS/NIR 光谱仪 Lambda 950 (Perkin Elmer) 在 200-800 nm 波长下进行，水作为参考溶液。

微生物测试

细菌培养

使用无菌棉签线拭子从 70 名住院患者的中鼻道区域和喉咙中收集细菌培养物。标本立即用运输培养基运送到实验室，然后接种在血琼脂上。根据苏梅州立大学细菌学实验室的一般细菌学方法手册，通过标准实验室程序在形态学和生物化学上鉴定细菌培养物。我们分离了 50 个金黄色葡萄球菌 菌株。每种培养物均进行革兰氏染色，并在蛋黄琼脂培养基（Hi Media，Mumbai）上测试过氧化氢酶、游离凝固酶、黄色素的产生、甘露醇发酵、高盐浓度下的生长和脂肪酶的产生。

抗菌药物敏感性测试

对所有S进行了抗生素药敏试验 . 金黄色葡萄球菌 分离株以确定其抗生素耐药性。 Kirby-Bauer 圆盘扩散法用于评估分离株的抗生素敏感性。在 Muller-Hinton 琼脂上对阿奇霉素、左氧氟沙星、克拉霉素、环丙沙星和甲氧西林进行了抗微生物药敏试验（国家临床实验室标准委员会，1999）。制备新鲜过夜培养物并用于测试。 S 的标准菌株 . 金黄色葡萄球菌 ATCC 25923用作对照。将来自每个分离物悬浮液的等分试样 (100 μL) 铺在 Mueller Hinton 琼脂上。将抗生素圆盘轻轻压在接种的 Mueller Hinton 琼脂上，以确保与表面紧密接触，然后将平板在 37°C 有氧条件下培养 18-24 小时。测量抑制区直径。根据临床和实验室标准协会 (CLSI) 指南 [24] 制定的评估标准，临床菌株被归类为敏感和耐药。 金黄色葡萄球菌菌株 对甲氧西林耐药的菌株筛选为MRSA。

测定壳聚糖-Ag NPs 溶液的最小抑制浓度

壳聚糖溶液、Ag NPs 和壳聚糖-Ag NPs 溶液的抗菌活性根据 NCCLS (1999) 的建议使用肉汤宏观稀释法测定。我们确定了针对每种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的测试溶液的最低抑菌浓度 (MIC) （总共 10 个 MRSA 菌株）。以完全抑制细菌视觉生长（无混浊）最低浓度的试管为MIC。

简而言之，在开始时，使用营养肉汤和 2 倍连续稀释方法制备了七种浓度的纯银纳米颗粒和银/CTAB 纳米颗粒。每种类型的 Ag NPs 稀释液都有三行相同的行。然后，在每排的每一管中，我们添加 1、2 或 3 毫升的 1% 壳聚糖溶液。试管中壳聚糖和Ag NPs的终浓度见表1。

测试细菌菌株在合适的肉汤中生长，在无菌盐水中洗涤一次，并在蒸馏水中稀释。细菌浓度标准化为 600 nm 处 0.08 的光密度（约 1.5 × 10 ⁸ UFC/mL) 使用 McFarland 标度。然后，100 μl S . 金黄色葡萄球菌 将悬浮液接种到含有 Ag NPs、壳聚糖溶液和 Ag NPs-壳聚糖溶液的管中。含有生长培养基的试管和不含接种物的测试样品用作对照。所有管在 37°C 下有氧孵育 24 小时。所有措施一式三份。

结果

用于原位溶液制备的 Ag NPs 和壳聚糖的表征

部分合成的 Ag NPs 被 CTAB (Ag/CTAB NPs) 修饰（以提高 Ag NPs 分散体的生物活性和稳定性）。发现 Ag NPs 对 CTAB 的吸附率为 70.0 mg/g，对应于样品中约 6.54% 的 CTAB 含量。

Ag NPs 的 XRD 测量结果显示在 38.15、44.33、64.48、77.47 和 81.54°2Theta 处存在四个尖峰（图 1a）。根据美国矿物学家晶体结构数据库 (AMCSD) [5]，这些峰归因于银。 12.00–21.06°2Theta 范围内的宽峰可能归因于源自合成的有机化合物（L-抗坏血酸和生姜）。壳聚糖的 XRD 图案（图 1a，插图）在大约 9 和 20°2Theta 处显示出衍射峰，这是半结晶壳聚糖的典型指纹 [5]。壳聚糖的结晶度是由相应的羟基和N之间的氢键产生的 -乙酰基。每个结晶峰表征结晶结构，其由聚合物链或片的平行和反平行排列产生。半结晶壳聚糖具有非晶区和结晶区。

Ag NPs 和壳聚糖的表征。 一 XRD图谱，b FTIR 光谱，c Ag NPs（水）的紫外-可见吸收光谱，d Ag NPs的TEM图像

壳聚糖和 Ag NPs 的 FTIR 光谱如图 1b 所示。壳聚糖的光谱在 3450–3200 cm ^{− 1} 处显示出宽而密集的谱带 （氢键 OH 伸缩振动）与 NH 伸缩带、CH 伸缩带在 2783 cm ^{− 1} 重叠 ，以及 1652 cm ^{− 1} 处的酰胺 I 谱带 （图 1b）。在 ν 处也可以看到亚甲基和甲基的弯曲振动 =1375 cm ^{− 1} 和 ν =1426 cm ^{− 1} ， 分别。 1160 至 1000 cm ^{− 1} 范围内的吸收 已归因于 CO 组的振动。位于 ν 附近的波段 =1150 cm ^{− 1} 与脱乙酰壳聚糖引起的氧桥中 CO 的不对称振动有关。 1080–1025 cm ^{− 1} 附近的波段 归因于 ν 环的 CO 的 COH、COC 和 CH2OH。 ~ 890 cm ^{− 1} 处的小峰 对应于壳聚糖糖结构的摆动[11, 13]。

Ag NPs 的 FTIR 光谱显示在 1226、1366、1636、1714、2851、2924 和 3438 cm ^{− 1} 处有几个强峰 .后者归因于 H 键合的 OH 基团。 1226 和 1366 cm ^{− 1} 处的峰值 是由于 CO 和 CH 弯曲振动；在 1636 和 1714 cm ^{− 1} 处出现双峰 指向存在 C=C 和 C=O 基团（拉伸振动）。 2851 和 2924 cm ^{− 1} 处的峰值 与 CH 伸缩振动有关 [13]。 Ag NPs 表面上有机基团的存在是由于用于其合成的有机化合物，L-抗坏血酸和姜，其 FTIR 光谱是已知的 [10]。如果我们将后者的光谱与 Ag NPs 的光谱进行比较，您可能会注意到 1636 和 1714 cm ^{− 1} 处的双峰 是 L-抗坏血酸光谱所固有的并且发生蓝移。最密集的姜峰位于 1000–1200 cm ^{− 1} （COC 振动）在 Ag NPs 光谱中没有强烈表达。因此，L-抗坏血酸在银离子的还原、转移两个电子和转化为脱氢抗坏血酸中起主要作用[29]。 L-抗坏血酸峰位置的蓝移为该分子在Ag NPs表面的化学键合提供了证据。

分散在水中的 Ag NPs 的 UV-Vis 吸收光谱（图 1c）揭示了大约 387 nm 处的不对称峰。 387-420 nm 范围内的峰被称为 Ag NPs 的特征峰，通常归因于表面等离子体共振效应 [30]。该峰（平台）的不对称性可能归因于 Ag NPs 的快速沉淀。 Ag NPs 也已知大约 264 nm 处的峰值，并且通常与电子跃迁到 Ag NPs 中运行的更高能态有关 [38]。另一方面，L-抗坏血酸的紫外-可见光谱也在 255 nm [4] 处显示出一个峰值。因此，Ag NPs 光谱中 264 nm 处的峰可以被认为是 L-抗坏血酸的红移峰，证实了这些化学键合分子存在于 Ag NPs 表面。

有趣的是，Ag/CTAB NPs 的 UV-Vis 光谱（图 1c，蓝线）在 417 nm 处显示了一个对称峰。这证实了由于CTAB分子的表面改性，Ag NPs在水中的稳定性得到提高。

TEM 测量显示，Ag NPs 呈圆形，其中大部分尺寸为 10-12 nm（图 1d）。

原位制备的壳聚糖/Ag NPs 溶液对金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林菌株的抗菌活性

纯银纳米颗粒和银/CTAB 纳米颗粒对 100% MRSA 的 MIC 为 9.6 μg/ml。最低浓度显示出较低的活性（表 2）。壳聚糖溶液对 100% 临床 MRSA 菌株表现出抗菌活性，MIC 为 6 μg/ml。其中，60%的菌株MIC为3.3，壳聚糖溶液为5 μg/ml。

壳聚糖-Ag NPs 溶液对 MRSA 的抑制作用如图 2a 所示。发现壳聚糖-Ag NPs 溶液与其纯形式相比显示出优异的抗菌功效。同时，由于组分沉淀：形成灰黑色环凝集和分离组件分为两个阶段。在这种情况下无法评估抗菌活性。考虑到壳聚糖和 CTAB 混合的意外结果以及 Ag NPs-CTAB 的最低抗菌活性（见图 2b），我们得出结论，CTAB 对 Ag NPs 的表面改性效果不佳。 Ag NPs表面CTAB分子的存在提高了水分散体的稳定性，但显着降低了抗菌活性并导致溶液沉淀。

处理后 MRSA 敏感菌株的百分比。壳聚糖-Ag NPs 溶液 (a ) 和壳聚糖-AgNPs-CTAB 溶液 (b ）。 3.3、5 和 6 μg/ml——这些是溶液中壳聚糖的浓度

讨论

毒性是指在暴露于纳米粒子及其盐类过程中对生物体的任何有害影响。如果目的是对特定生物进行灭菌或消毒，则毒性可能被解释为阳性结果（抗菌、抗病毒）[15]。当前纳米技术的基本需求是开发环境友好且可靠的金属纳米粒子合成方法。我们已经确认使用天然、低成本和环保材料的生物还原剂来生产银纳米粒子，以避免存在危险和有毒溶剂 [37]。 Ag NPs 作为治疗剂的使用受到限制，因为它们对哺乳动物细胞具有细胞毒性。多种因素会影响Ag NPs对微生物的作用，例如Ag NPs的大小、形状、稳定性和浓度[4]。

在我们的研究中，我们获得了尺寸为 5-18 nm 的 Ag NP。它是影响 Ag NP [21] 的光学 [39]、抗菌 [27] 和抗病毒特性的最基本参数之一。较小的颗粒显示出更大的抗菌活性。一些研究表明，大于 10 nm 的 NPs 在细胞表面积累并损害细胞渗透性；然而，小于 10 nm 的纳米颗粒会渗透到细菌中，影响 DNA 和酶，导致细胞死亡 [14]。有趣的是，虽然大多数结果证明毒性假设随着粒径的减小而增加，但也有实验数据表明，较小的 NPs 要么毒性较小，要么没有大小依赖性毒性 [15]。许多研究表明，Ag NPs 具有抗菌活性，其尺寸范围为 3 至 100 nm [19]。

如前所述，评估了壳聚糖对合成的 Ag NPs 的稳定性和抗菌性能的影响。在敏感性测试之前，对合成的纳米粒子进行不同的表征方法以确定其纯度。我们的研究表明，浓度为 9.6 μg/ml 的 Ag NPs 对 100% 的 MRSA 菌株有效，而 CTAB 并未提高 Ag NPs 的有效性。

众所周知，壳聚糖对广谱细菌具有显着的抗菌活性[2]。尽管如此，一些报告表明纯壳聚糖不能预防严重感染 [3]。有几篇出版物报道了壳聚糖和银的各种组合具有改进的抗菌性能 [11]。银-壳聚糖纳米复合材料被提议用作生物医学工程和食品包装应用以及伤口敷料应用的涂层 [2, 3]。但关于壳聚糖-Ag NPs 溶液对 MRSA 的抗菌作用的数据有限 [34]。我们的数据表明，在壳聚糖溶液中简单混合 Ag NPs 可以增强两种成分的抗菌活性。我们得到所有被调查物质抗菌活性的增加。壳聚糖的 MIC 为 3.3 μg/ml，纯 Ag NPs MIC 和具有 CTAB MIC 的 Ag NPs 分别为 1.2 和 2.4 μg/ml。考尔等人。 (2013) 还报道了银/壳聚糖纳米复合材料对 S 的抗菌活性 . 金黄色葡萄球菌 ，其中他们显示了类似的结果 [36]，但他们没有确定 MIC。这一发现证明了壳聚糖-Ag NPs 溶液的有效性，但我们没有看到 CTAB 作为抗菌剂的优势。相反，另一项研究表明，用 CTAB 稳定的 Ag NPs 对 S 具有显着的抗菌作用 . 金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌 .可能在我们的实验中，壳聚糖与 CTAB 相关联，从而降低了 Ag NPs 对细菌细胞的影响。

结论

在这项研究中，原位制备的具有不同组分比例的壳聚糖-Ag NPs 溶液对从患者身上分离的 MRSA 的活性进行了测试。我们的结果表明，壳聚糖溶液和 Ag NPs 的简单混合将物质的最小抑制浓度分别降低到 2 倍和 4 倍（3.3 和 1.2 μg/ml）。这一结果是非常有希望的，可能被认为是对抗耐药菌的有效解决方案。这也是个性化医疗方向的一个进步。未来壳聚糖-Ag NPs溶液的细胞毒性研究将为临床使用剂量提供答案。

缩写

Ag NP：

银纳米粒子

ARI：

急性呼吸道感染

CTAB：

溴化西曲铵

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

MRSA：

M 金黄色葡萄球菌耐乙氧西林菌株

TEM：

透射电子显微镜

UV-Vis：

紫外可见光谱

XRD：

X射线衍射