原位制备壳聚糖-银纳米颗粒溶液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的疗效

摘要

背景: 开发针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 的新型治疗药物是紧迫的医学挑战。抗菌剂不同于抗生素，可靶向耐药菌株同时保护正常菌群。

材料与方法: 我们评估了原位制备的不同壳聚糖/银比例壳聚糖-银纳米颗粒 (Ag NP) 溶液的抗菌效力。Ag NPs 通过姜根提取物和抗坏血酸的绿色化学路线合成；亦探索了十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 表面修饰以增强分散性。所得纳米颗粒和壳聚糖-Ag NP 混合物经 X 射线衍射 (XRD)、透射电镜 (TEM)、傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 和 UV-Vis 光谱表征。

结果与结论: XRD、FTIR、UV-Vis 和 TEM 确认了壳聚糖和 Ag NPs 的高纯度和预期组成。壳聚糖-Ag NP 溶液展现出优于单一组分的抗菌功效。相反，原位制备的壳聚糖-Ag NP/CTAB 溶液发生沉淀无法评估。这些发现表明壳聚糖-Ag NP 混合物是对抗耐药细菌的有前景策略。

研究背景

感染仍是全球发病率和死亡率的主要原因，部分源于广泛抗生素使用筛选出 MRSA 等耐药菌。MRSA 感染范围从浅表皮肤病变到危及生命的肺炎、心内膜炎和败血症，造成巨大经济负担 (约 30-40 亿美元/年)。急需新的抗菌策略。抗菌剂对耐药菌株提供持久活性且不破坏宿主菌群。通过混合纳米材料结合不同抗菌机制——如金属和天然聚合物——为击败耐药细菌提供新思路。

银的抗菌特性早已为人所知，银纳米颗粒 (Ag NPs) 展现出强效抗菌和抗真菌作用。它们可与常规抗生素协同，但也可能因团聚、离子失控释放和细胞毒性而受限。将 Ag NPs 掺入壳聚糖等生物聚合物可增强稳定性和抗菌活性。壳聚糖源自几丁质，生物相容、抑菌且适合医疗应用。Ag NPs 经 CTAB 表面修饰可改善分散稳定性，但其对抗菌功效的影响尚未完全明确。

本研究旨在确定产生对临床 MRSA 分离株最大活性的最佳壳聚糖-Ag NP 比例。

方法

材料

硝酸银、L-抗坏血酸和 CTAB (C₁₆H₃₃N(CH₃)₃Br) 购自 Sigma-Aldrich。姜根本地采购。壳聚糖 (200 kDa, 82% 脱乙酰) 来自 Bioprogress。全程使用超纯水 (电阻率 > 17 MΩ·cm) 和标准微生物培养基。

壳聚糖/Ag NP 溶液原位制备

Ag NPs 首先通过姜提取物和抗坏血酸在 60 °C 回流 1.5 h 还原硝酸银合成。所得颗粒离心洗涤至中性 pH。对于 CTAB 修饰 Ag NPs (Ag/CTAB NPs)，将 3 mL 76.4 mg mL⁻¹ Ag NP 分散液与 20 mL 6.7 mg mL⁻¹ CTAB 溶液混合，超声 3 h。CTAB 负载量通过 190 nm UV-Vis 定量。

壳聚糖溶液 (1% w/v) 通过在 100 mL 2% 醋酸中溶解 1 g 壳聚糖、室温搅拌 24 h 制备。随后向 Ag NP 分散液中加入不同体积壳聚糖溶液形成壳聚糖/Ag NP 溶液，生成一系列壳聚糖和 Ag NP 浓度组合 (表 1)。

理化表征

XRD 在 Empyrean 衍射仪 (Cu Kα, 1.54 Å) 上进行。TEM 成像用 JEM-ARM-200F (200 kV)。FTIR 谱图在 Tensor 27 光谱仪上用 KBr 压片 (1 mg 样品/200 mg KBr) 记录。UV-Vis 吸收在 Lambda 950 光谱仪 (200–800 nm) 测量。所有测量至少重复三次。

微生物学测试

70 份患者拭子 (鼻和咽) 接种血琼脂。分离 50 株金黄色葡萄球菌并经标准生化测试确认。在 Mueller-Hinton 琼脂上用 Kirby-Bauer 纸片扩散法测定阿奇霉素、左氧氟沙星、克拉霉素、环丙沙星和甲氧西林的抗生素敏感性。按 CLSI 指南定义 MRSA 菌株。

壳聚糖、Ag NPs 和壳聚糖-Ag NP 溶液的最小抑菌浓度 (MIC) 通过肉汤大稀释法测定。每种纳米颗粒制备七个两倍连续稀释于营养肉汤中，每管加入 1、2 或 3 mL 1% 壳聚糖。接种 100 µL 标准化菌悬液 (≈1.5 × 10⁸ CFU mL⁻¹)，37 °C 培养 24 h，记录防止可见生长的最低浓度为 MIC。

结果

Ag NPs 和壳聚糖表征

CTAB 吸附于 Ag NPs 得吸附量 70.0 mg g⁻¹，对应 CTAB 含量 ~6.5%。XRD 图谱显示银特征峰 38.15°、44.33°、64.48°、77.47° 和 81.54° 2Θ，确认结晶 Ag。宽峰 (12.00–21.06°) 指示残留有机物。壳聚糖在 9° 和 20° 2Θ 附近显示半结晶峰。FTIR 谱图揭示壳聚糖 (宽 O-H/N-H 伸缩 3450–3200 cm⁻¹、酰胺 I 1652 cm⁻¹) 和 Ag NPs (CO/CH 弯曲、C=C/C=O 伸缩) 的预期官能团。Ag NPs UV-Vis 显示表面等离子共振峰 ~387 nm，CTAB 修饰后移至 ~417 nm，表明分散稳定性改善。TEM 图像显示以 10–12 nm 球形 Ag NPs 为主。

抗菌活性

纯 Ag NPs 和 Ag/CTAB NPs 对所有 10 株 MRSA 均显示 9.6 µg mL⁻¹ MIC。单独壳聚糖 MIC 为 6 µg mL⁻¹，60% 菌株在 3.3–5 µg mL⁻¹ 被抑制。壳聚糖-Ag NP 混合物实现 Ag NPs 低至 1.2 µg mL⁻¹ 和壳聚糖 3.3 µg mL⁻¹ 的 MIC，较单一组分降低 2-4 倍。尝试制备壳聚糖-Ag/CTAB 混合物导致沉淀无法评估。

讨论

我们的发现证实原位混合壳聚糖与 Ag NPs 对 MRSA 协同增强抗菌活性。降低的 MIC 提示与细菌细胞相互作用改善，潜在机制为：银离子释放和壳聚糖多阳离子表面破坏膜的联合作用。CTAB 虽稳定纳米颗粒，却降低抗菌功效并诱发沉淀，表明表面化学关键影响治疗潜力。未来研究应评估壳聚糖-Ag NP 制剂的细胞毒性以确定安全临床剂量。

结论

原位制备的壳聚糖-Ag NP 溶液对 MRSA 展现显著优越活性，所需浓度较单一组分降低达四倍。该策略为对抗抗生素耐药感染提供了有前景、潜在个性化的方法。进一步毒性评估将明确临床适用性。

缩略语

Ag NPs

银纳米颗粒

CTAB

十六烷基三甲基溴化铵

FTIR

傅里叶变换红外光谱

MRSA

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

TEM

透射电镜

UV-Vis

紫外-可见光谱

XRD

X 射线衍射