适配体-金纳米颗粒偶联修饰的pH敏感性脂质体递送木犀草素用于靶向癌症治疗

摘要

本研究构建了一种具有靶向特性的抗癌纳米材料——适配体和金纳米颗粒（Apt-Au）修饰的木犀草素pH敏感性脂质体（MSL）。肿瘤微环境pH值低于正常组织，这通常阻碍药物疗效，因此pH响应型药物备受关注。金纳米颗粒（AuNPs）因尺寸小、生物相容性好、易于表面修饰和细胞穿透性强而显示出作为药物载体的潜力。Apt-Au@MSL表现出优异的单分散性和肿瘤靶向性，并能在弱酸性环境中通过透析释放药物。通过MTT实验筛选模型癌细胞，发现该制剂能有效抑制SGC-7901细胞增殖。体内实证表明，Apt-Au@MSL给药可抑制异种移植小鼠模型的肿瘤生长。H&E染色和TUNEL实验进一步证实Apt-Au@MSL可促进肿瘤细胞凋亡。其机制可能通过触发活性氧（ROS）过量产生并调节多信号通路串扰诱导凋亡。血液生化检测和H&E染色均提示该材料在体内具有可忽略的急性毒性和良好的生物相容性。凭借其强大功能，Apt-Au@MSL可作为基于靶向的抗癌材料用于未来临床癌症治疗。

引言

癌症是主要死因之一，给人类带来巨大经济损失和健康危害。开发智能抗癌药物势在必行。聚合物纳米颗粒能保护药物至靶点，有望改善治疗药物递送。为确保治疗剂到达活性部位，需利用高反应性纳米颗粒，其材料性质可在不同生物刺激下变化。响应性纳米颗粒设计刺激源包括外部刺激（温度、光）和生物刺激（pH、氧化还原）。pH响应型纳米颗粒因内吞后pH变化而受关注，pH响应功能易整合进聚合物结构，设计出一系列pH响应纳米颗粒。纳米颗粒可通过改变表面化学、粒径形状、崩解或释放物质来响应pH，这种性质变化可调控细胞摄取和控制释放，为治疗递送系统设计提供强有力策略。

木犀草素水合物（3,5,7,2′,4′-五羟基黄酮）是从中草药或植物中分离的天然活性物质，属黄酮类化合物和植物酚类次级代谢产物。木犀草素广泛分布于自然界，具有良好的抗氧化、抗癌和显著抗炎作用，但其潜力受限于极低的水溶性和生物利用度。

由卵磷脂和神经酰胺等组成的脂质体（空心）具有两亲性脂质分子双层结构，具备生物相容性、功能性、减少副作用、包裹大量药物等优势。脂质体能高效载运亲水和疏水药物，保护其免受外界条件影响，成功运输至靶组织区域。为提高疗效，设计引入pH触发释放抗癌物质于肿瘤间质的pH敏感性脂质体。这类特殊脂质体在组织环境中释放药物，在癌组织内体体等酸性环境中快速失稳。

为增强肿瘤治疗的选择性和疗效，pH敏感性脂质体应修饰成肿瘤靶向纳米颗粒。DNA适配体近期作为高选择性、高灵敏度的生物传感和成像传感器，以及潜在的癌症靶向治疗剂被开发。单链DNA适配体AS1411因高亲和力结合癌细胞核而显示化疗药物功能。该适配体（Apt）与AuNPs结合制备成双组分纳米构建体Apt负载AuNPs，可与癌细胞核相互作用。研究还表明脂质体-纳米颗粒杂化体系设计为多功能模态提供丰富工具箱。由阳离子脂质体和AuNPs组成的杂化脂质体-AuNPs囊泡系统旨在改善药物在肿瘤间质渗透并增强抗癌活性。

金纳米颗粒（AuNPs）被视为良好的药物载体，可通过生物相关分子修饰增强癌症靶向特异性。利用AuNPs表面修饰，巯基适配体可通过Au-S共价键修饰AuNPs表面，适当巯基附着于纳米金表面。从工程应用角度看，配体结合的金纳米材料为靶向识别、检测和治疗提供强大平台。

本研究采用包裹木犀草素的pH敏感性脂质体，并在其表面组装修饰的Au-Apt（Apt-Au@MSL，图3a）。将水溶性差、生物利用度低的木犀草素转化表征。新纳米颗粒的形态、尺寸等性质经表征，显示肿瘤靶向性和高抗癌活性。Apt-Au@MSL的抗癌活性在体外和体内探索（图2）。

材料与方法

材料

L-α-磷脂酰胆碱（PC）、胆固醇（Chol）、胆固醇琥珀酸单酯（CHEMS）、木犀草素（≥99.99%）、柠檬酸钠（99.9%）、HAuCl₄·3H₂O（≥99.9%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，分子量40,000）、NaOH（≥98.0%）和HCl（37%）购自Sigma-Aldrich（美国）。带二硫键修饰的AS1411适配体由TaKaRa（中国大连）合成，序列：5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′。噻唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）、钙黄绿素和Alexa Fluor 488 Annexin V购自Sigma-Aldrich。所有水溶液用双蒸水配制，其他试剂均为市售最佳级别。

AuNPs合成

1 mL HAuCl₄·4H₂O（1%）溶于25 mL Milli-Q水（pH=5.5），加入50 mg PVP，倒入三口烧瓶（150 mL），微波（MW）辐照5 min并机械搅拌。随后快速加入1.5 mL柠檬酸钠溶液（1%），再MW辐照3 min。10,000 rpm离心5 min收集溶液。

Apt-AuNPs合成

用三(2-羧乙基)膦裂解适配体二硫键。30 min后，加入适配体溶液（100 μL，100 μM）至10 mL 5 nM AuNPs溶液，孵育24 h形成Au-Apt NPs。1天后，用2.5 mL 500 mM NaCl溶液两次加盐，间隔4 h。

pH敏感性脂质体制备

卵黄PC:CHEMS:Chol摩尔比33:13:5，含5%木犀草素的脂质体采用薄膜水化法制备。将卵黄PC、CHEMS、Chol和2 mg木犀草素溶于8 mL CHCl₃，40°C旋转蒸发除去有机溶剂。木犀草素-脂质体用2%（w/v）PBS水化所得薄膜，冰浴探针超声15 min。最终脂质体在胶体系统中合成稳定。Apt-Au@木犀草素pH敏感性脂质体（Apt-Au@MSL）用5%葡萄糖中475 μg/mL Au-Apt NPs水化脂质膜后超声制得。

表征

紫外-可见光谱（UV-Vis，S-3100光电二极管阵列，Scinco，韩国）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR，Nicolet iS50，Thermo Fisher，美国）表征。透射电镜（TEM，HT7700，日立，日本）观察Apt-Au@MSL形态。木犀草素释放率用UV-Vis检测。扫描电镜（SEM，S-4800，日立，日本）观察木犀草素-脂质体和Apt-Au@MSL形态。动态光散射（DLS）和Zeta电位用Brookhaven ZetaPALS电位分析仪表征光学性质和尺寸。

细胞培养

人癌细胞系SGC-7901、BGC-823、A549、HeLa、MCF-7、Hs68购自ATCC，RPMI-1640含10% FBS，37°C、5% CO₂培养。

体外抗癌活性研究

各细胞系接种96孔板（2.0×10³ cells/well），用不同浓度Apt-Au@MSL（0, 5, 10, 15, 20, 30 μg/mL）培养。AuNPs和木犀草素为对照，未处理细胞为空白组。湿箱孵育后，每孔加9.6 mL MTT溶液（5 mg/mL）再孵育2 h。三重复测，IC₅₀由平均OD值与药物浓度曲线导出。共聚焦荧光显微镜获取各组亮度。

实时细胞电子感应系统（RT-CES，ACEA Biosciences）每10 min监测细胞粘附达75 h。每孔接种细胞（1.0×10⁴ cells/well），加新鲜培养基至200 μL，用不同浓度Apt-Au@MSL（10, 20, 30 μg/mL）于10 h后孵育12 h。空白组未处理，对照组为木犀草素和木犀草素-脂质体组。

荧光显微镜

SGC-7901细胞48孔板过夜培养。用不同浓度Apt-Au@MSL（10, 30 μg/mL）处理12 h。对照组为木犀草素和木犀草素-脂质体。去除培养基，PBS洗涤三次。活/死细胞双染（LIVE/DEAD实验）后，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像（钙黄绿素-AM：Ex=488 nm, Em=515 nm；PI：Ex=535 nm, Em=615 nm）。

凋亡细胞死亡分析

六孔板接种SGC-7901细胞（1.0×10⁵ cells/well），用不同浓度Apt-Au@MSL（5, 10, 20, 30 μg/mL）孵育12 h。空白组未处理，对照组为木犀草素和木犀草素-脂质体。处理后收集细胞，PBS洗两次。PI和Annexin V-FITC染色后，CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）分析（PI：Ex=535 nm, Em=615 nm；Annexin V-FITC：Ex=488 nm, Em=525 nm）。

细胞壁破坏研究

六孔板培养SGC-7901细胞，无材料组为空白。用不同浓度Apt-Au@MSL（5, 10, 20, 30 μg/mL）培养12 h后，0.25% Trypsin-EDTA处理。所有细胞（含悬浮细胞）2000 r/min离心5 min收集。2.5%戊二醛固定4 h。丙酮梯度脱水20 min。最终经系列处理装铜网，TEM（HT-7700，日立，日本）观察。

Western Blot分析

SGC-7901细胞蛋白表达经Western blot检测。细胞（4.0×10⁵ cells/well）接种9 cm培养皿，20 μg/mL Apt-Au@MSL处理1, 6, 12, 24 h。收集细胞，冰上细胞裂解缓冲液悬浮1 h。11,000g，4°C离心10 min，收集上清总蛋白。BCA法测蛋白浓度。上样缓冲液重悬，100°C煮沸10 min。等量蛋白（40 μg/孔）SDS-PAGE（10%三羟甲基氨基甲烷凝胶）。100 V转移硝酸纤维素（NC）膜1.5 h，5%脱脂奶粉TBST封闭1 h。一抗、二抗孵育。ECL显影。β-actin作内参。Quantity-One软件定量，表达率标注条带下。

动物模型

BALB/c雄性裸鼠（~17 g）购自南京大学模式动物研究中心，SPF环境饲养。皮下注射SGC-7901细胞悬液（100 μL，1×10⁶/mL）于裸鼠肩部建立肿瘤模型。注射15天后获取肿瘤明场图像。所有动物实验遵循安徽农业大学实验动物中心方案（许可号：SYXK 2016-007）。游标卡尺测量肿瘤最大纵径（长）和最大横径（宽），体积=长×宽²×0.5计算。

体内抗癌研究

肿瘤体积达50 mm³时随机分五组：PBS（100 μL）、木犀草素、木犀草素-脂质体、Au-Apt、Apt-Au@MSL。尾静脉注射，剂量2 mg/kg。24天后测肿瘤大小、体重、存活率。处死小鼠，收集肿瘤和器官组织H&E染色。封闭透化后，肿瘤切片PBS洗涤，TUNEL染色，DAPI复染。CLSM成像（DAPI：Ex=358 nm, Em=461 nm；TUNEL：Ex=450-500 nm, Em=515-565 nm）。

毒性评价实验

评价Apt-Au@MSL对重要器官毒性，30天后处死四治疗组小鼠。收集肝、脾、肾、心、肺、肿瘤组织H&E染色。采集血样测血糖，并测体重。

结果与讨论

表征

本研究旨在开发兼具纳米颗粒（Apt负载AuNPs）优势且可作为抗癌剂的新型脂质体。新脂质体基本性质对后续研究至关重要。Apt-Au@MSL按前文方法合成（微调）并多法表征（图3）。图3b UV-Vis谱显示特征峰，可监测AuNPs形成。AuNPs在~530 nm处有特征峰。UV-Vis谱显示强吸收，受表面Apt修饰影响。包裹木犀草素的pH敏感性脂质体后特征峰位移。Apt-Au@MSL特征峰位于362和550 nm，表明合成成功。FT-IR进一步验证合成结果。木犀草素-脂质体和Apt-Au@MSL特征峰红移进一步证实木犀草素修饰成功（图3c）。不同pH下PBS中木犀草素释放实验考察Apt-Au@MSL pH敏感性。三个pH值模拟血液中性环境、肿瘤弱酸环境、细胞内酸性环境。UV-Vis检测释放率。pH 5.0时，24 h内释放~54%木犀草素，随后96 h持续释放；pH 7.4时，24 h仅释放~10%。结果显示Apt-Au@MSL在正常生理条件下稳定性好，防止药物泄漏；在细胞核内快速释放，有效改善治疗效果（图3d）。TEM和SEM阐明脂质体和Apt-Au@MSL结构（图3f）。TEM观察AuNPs结构，粒径~10 nm（图3g），与脂质体修饰尺寸一致。SEM显示原始脂质体仅形成单层囊泡，直径~120 nm不均一（图3e），与DLS一致。Apt-Au@MSL显示杂化囊泡形态归因于Au-Apt修饰，直径150 nm与DLS一致（图3i）。值得注意的是，TEM探究pH敏感性脂质体与Au-Apt相互作用，发现AuNPs几乎完全结合于囊泡脂质双层，定位于囊泡边缘（图3h）。Zeta电位见图3j，AuNPs和Au-Apt均带负电。AuNPs（-57.1±0.3 mV）和Au-Apt（-31.7±0.2 mV）均负电。Apt-Au@MSL经正电木犀草素-脂质体修饰后电位变为36.4±0.3 mV。正负电荷吸附是Au-Apt与木犀草素-脂质体结合机制。图3k显示包封率随时间变化，指示颗粒稳定性。24 h内包封率几乎不变，表明颗粒随时间稳定。木犀草素浓度-UV-Vis吸收标准曲线研究包封率。结果显示木犀草素-脂质体和Apt-Au@MSL包封率分别达90.2%和89.6%（表S1和图S1）。

Apt-Au@MSL抗癌活性测试

体外实验

木犀草素虽具优异抗肿瘤活性，但水溶性差导致生物利用度低。经pH敏感性脂质体包裹转化为水溶性材料后，脂质体表面修饰Au-Apt获靶向抗肿瘤效果。图4a MTT实验显示Apt-Au@MSL体外抗癌活性。药物浓度以木犀草素浓度定义。木犀草素组较空白组无明显抗癌活性。但pH敏感性脂质体包裹木犀草素组抗癌活性增强，提示木犀草素-脂质体抗肿瘤活性优于游离木犀草素。同时，Apt修饰脂质体（Apt-Au@MSL）抗肿瘤活性进一步提升。表1列出木犀草素、木犀草素-脂质体、Apt-Au@MSL和顺铂IC₅₀值。三者对肿瘤细胞均显广谱抗癌活性，对SGC-7901细胞有明显偏好，高效力、对正常人细胞低毒性。Apt-Au@MSL对SGC-7901细胞IC₅₀为15.6±1.5 μg/mL。RTCA实验进一步确证。SGC-7901细胞培养不同浓度Apt-Au@MSL；空白组PBS，对照组木犀草素和木犀草素-脂质体。iCELLigence监测粘附铺展（图4b）。结果与MTT基本一致。Apt-Au@MSL抗肿瘤活性显著高于木犀草素和木犀草素-脂质体。随浓度增加，Apt-Au@MSL抑制SGC-7901增殖。荧光显微镜观察Apt-Au@MSL处理后细胞形态变化。图4c显示，无Apt-Au@MSL的SGC-7901细胞保持结构完整；经Apt-Au@MSL不同浓度处理后细胞完整性受损。

凋亡细胞死亡分析

流式细胞术Annexin-FITC染色定量分析凋亡。PI和Annexin V-FITC染色后，CytoFLEX流式细胞仪（Beckman Coulter）分析。Annexin V检测磷脂酰丝氨酸外翻的早期凋亡细胞，PI染色晚期凋亡细胞。空白组凋亡率1.57%。木犀草素处理组凋亡率3.51%。Apt-Au@MSL不同浓度诱导凋亡能力更强，凋亡率分别为7.44%、10.75%、15.53%、40.77%（图5）。增强凋亡进一步证实Apt-Au@MSL卓越抗癌活性。SGC-7901细胞凋亡率随Apt-Au@MSL浓度升高而增加。

荧光实验抗癌活性研究

LIVE/DEAD荧光实验直观评价Apt-Au@MSL诱导SGC-7901抗肿瘤效果。细胞经木犀草素、木犀草素-脂质体、Apt-Au@MSL不同浓度孵育后，避光共染LIVE/DEAD试剂盒30 min。图6显示，空白组全为绿色荧光活细胞。对照组（木犀草素、木犀草素-脂质体）显示红色荧光死细胞。但Apt-Au@MSL不同浓度处理组明显呈现大量凋亡细胞。随浓度增加，活细胞逐渐减少，死细胞比例显著上升，细胞密度下降。结果证实Apt-Au@MSL能有效促进肿瘤凋亡。

细胞完整性研究

为确认Apt-Au@MSL摄取运输对SGC-7901细胞影响，进行TEM实验。观察细胞形态变化，TEM观察细胞内部结构，为抗癌机制提供参考。图7显示，未处理SGC-7901空白组形态清晰，细胞壁明显。对照组（木犀草素、木犀草素-脂质体）细胞形态部分受损，核区收缩。但Apt-Au@MSL暴露后细胞壁和内部结构显著改变：细胞质泄漏，核结构模糊，空心细胞周围形成大量碎片，细胞壁解体或破坏，整体轮廓不清，细胞受损，细胞质泄漏。红箭头指示AuNPs区域。随Apt-Au@MSL浓度增加，细胞核出现更多AuNPs区域。这提示Apt-Au@MSL进入细胞内部后释放木犀草素，导致大量AuNPs出现。上述结果提示抗肿瘤活性与细胞完整性和核结构受损相关。

Apt-Au@MSL诱导的分子机制

为探究Apt-Au@MSL诱导凋亡分子机制，检测caspases和PARP表达水平。先用特异性底物检测caspase-3、-8、-9激活。图8a显示Apt-Au@MSL处理剂量依赖性激活caspase-3、-8、-9。Caspase-9促进线粒体介导凋亡多于caspase-8，提示线粒体介导凋亡信号通路占主导。Western blot蛋白水平进一步确证Apt-Au@MSL诱导凋亡。图8b、c显示Apt-Au@MSL处理后caspases激活和PARP切割呈时间和剂量依赖性（图8b、c）。图8d、e Western blot定量分析确认结果。结论：Apt-Au@MSL主要通过诱导凋亡抑制SGC-7901细胞生长。

Apt-Au@MSL抑制肿瘤生长

体内实验

利用SGC-7901肿瘤异种移植模型评价Apt-Au@MSL体内抗肿瘤活性。与对照组（木犀草素、木犀草素-脂质体）肿瘤图像对比，Apt-Au@MSL处理组小鼠肿瘤重量和体积显著减小（图9a）。相对肿瘤体积曲线和小鼠体重曲线显示Apt-Au@MSL体内抗癌效率高于其他治疗组（图9b）。对照组（木犀草素、木犀草素-脂质体）与空白组平均肿瘤体积无显著差异。Apt-Au@MSL组肿瘤体积仅为空白组约1/10，对照组约1/6。结果表明生木犀草素和木犀草素-脂质体40 mg/kg对肿瘤生长速率无效，但Apt-Au@MSL能抑制肿瘤生长。各组小鼠体重（PBS、木犀草素、木犀草素-脂质体、Au-Apt）治疗期无显著波动（图9c），提示治疗耐受良好，无急性副作用。值得注意的是，Apt-Au@MSL处理组小鼠存活期显著延长（图9d）。该组存活小鼠行为正常，无明显不健康迹象。结果证实Apt-Au@MSL给药可抑制异种移植小鼠模型肿瘤生长。

抗癌活性组织学分析

固定处理后进行肿瘤组织和器官样本H&E染色。通过不同组肿瘤组织H&E染色评估治疗疗效。图10a显示，Au-Apt、木犀草素、木犀草素-脂质体处理组肿瘤热损伤程度与空白组相当。空白组未见明显凋亡，肿瘤切片由紧密堆积肿瘤细胞组成。但Apt-Au@MSL处理组肿瘤组织损伤最显著，伴中度细胞凋亡。提示Apt-Au@MSL处理小鼠模型具抗癌活性。为进一步探究体内肿瘤组织凋亡细胞比例，进行TUNEL检测凋亡细胞。图10b显示，肿瘤凋亡细胞绿色荧光染色指示凋亡。合并图像显示空白组和对照组（木犀草素、Au-Apt）绿色荧光区域较少，凋亡细胞少。木犀草素-脂质体组细胞部分凋亡。Apt-Au@MSL组观察到大量绿色荧光区域，指示大量凋亡细胞。结果与H&E染色一致，证实Apt-Au@MSL可在体内促进肿瘤凋亡。

体内毒性评价

潜在体内毒性是抗癌药物临床应用的重要顾虑。为验证Apt-Au@MSL体内适用性，不同治疗（木犀草素、木犀草素-脂质体、Au-Apt、Apt-Au@MSL）评价小鼠。血液生化检测检查治疗后小鼠生化指标变化。图11a显示，Apt-Au@MSL组血糖指数与空白和对照组相似。各组体重无差异，稳步增加，提示药物无毒性（图11b）。器官切片H&E染色（图11c）显示Apt-Au@MSL组无损伤或炎症迹象，与空白和对照组相当。表明PBS、木犀草素、木犀草素-脂质体、Au-Apt、Apt-Au@MSL体内副作用可忽略。这些结果连同H&E染色进一步表明Apt-Au@MSL用于肿瘤治疗的安全性。

结论

本研究合成抗肿瘤纳米材料Apt-Au@MSL。Apt-Au@MSL表现出优异单分散性和肿瘤靶向性。木犀草素极性被修饰，抗肿瘤活性增强。表征实验中pH 5.0溶液下Apt-Au@MSL释放木犀草素速率最大。Apt-Au@MSL显示杂化囊泡形态归因于Au-Apt修饰，直径150 nm与DLS一致。MTT筛选模型癌细胞发现SGC-7901细胞增殖被有效抑制。Apt-Au@MSL对SGC-7901细胞IC₅₀为15.6±1.5 μg/mL。荧光流式细胞实验证实Apt-Au@MSL可作为有效抗癌材料体外诱导凋亡。TEM图像中细胞内Apt-Au@MSL提示其可靶向癌细胞。肿瘤重量测定显示Apt-Au@MSL给药可抑制异种移植小鼠模型肿瘤生长。H&E染色和TUNEL实验进一步证实Apt-Au@MSL可在体内促进肿瘤凋亡。血液生化检测和H&E染色均提示这些材料在体内表现出可忽略的急性毒性和良好生物相容性。