有机磷钙源制备高比表面积卵黄-壳结构磷酸钙微球增强溶菌酶吸附

摘要

卵黄-壳结构磷酸钙微球因优异理化性质和生物相容性在医学应用潜力巨大，但开发高吸附能力此类材料仍具挑战。本研究采用三磷酸腺苷二钠（ATP）作磷源、葡萄糖酸钙一水合物（CG）作钙源，通过自模板法成功合成高比表面积（S_BET=143 m²/g，约为用乳酸钙（CL）替代钙源合成的ATP-CL微球3倍）的多孔卵黄-壳结构磷酸钙微球（ATP-CG）。考察了Ca/P摩尔比、水热温度、时间对ATP-CG微球形貌的影响。发现有机钙源和有机磷源对卵黄-壳结构形成起关键作用。通过溶菌酶（HEL）吸附实验对比两种钙源合成的微球吸附机制：ATP-CG吸附容量（332±36 mg/g）约为ATP-CL（176±33 mg/g）两倍。钙源导致的更高比表面积及ATP-CG独特表面化学性质在提升HEL吸附能力中起重要作用。制备的卵黄-壳微球在药物递送领域应用前景广阔，为提升药物吸附能力提供有效途径。

引言

磷酸钙因优异生物相容性、高载药量和递送效率备受关注。磷酸钙生物材料广泛用于组织工程、骨修复、药物递送等生物医学领域。为拓展应用范围和提升性能，报道了各种形貌微结构的磷酸钙材料：碳酸羟基磷灰石（HAp）微球、HAp微管、中空HAp微球、卵黄@笼壳非晶磷酸钙（ACP）介孔纳米球等。

卵黄-壳结构微球因前沿材料科学地位和独特形貌特征受瞩目。卵黄核与壳层间空隙可作货物储存库，多孔壳层提供客体分子扩散通道，在催化、锂离子电池、光催化、生物医学等领域应用潜力大。传统牺牲模板法是制备主流，虽成功调控结构性能，但工艺繁琐、需表面活性剂或结构导向剂，可能危害健康。自模板法近年广泛用于卵黄-壳微球研究：模板不仅形成空隙，也是微球前驱体，工艺便捷。但将自模板法引入磷酸钙卵黄-壳微球合成仍具挑战。

磷酸钙材料可载运蛋白、DNA、siRNA等货物，但吸附能力差亟待解决。药物分子固定在载体表面依赖表面性质：表面电位、疏/亲水性、氢键、比表面积。改善表面性质和比表面积是增强载体药物吸附能力有效途径。

本研究利用ATP作有机磷源、CG作有机钙源，微波水热法自模板合成多孔卵黄-壳结构磷酸钙微球。无模板剂添加下展现极高比表面积。对比CL作钙源合成的ATP-CL微球，考察HEL吸附行为。结果揭示钙源导致的比表面积差异及表面化学性质在提升HEL吸附能力中起关键作用。

实验方法

材料

三磷酸腺苷二钠（ATP）购自麦克林生化（上海）。葡萄糖酸钙一水合物（CG）、乳酸钙五水合物（CL）购自桑工生物（上海）。鸡蛋清溶菌酶（HEL，~70000 U/mg）购自Sigma-Aldrich（德国）。

ATP-CG与ATP-CL卵黄-壳微球合成与表征

ATP-CG合成：0.9 g CG溶于20 mL超纯水（60℃）成C液；0.11 g ATP溶于5 mL超纯水成P液。C液冷至室温与P液剧烈搅拌混合，2 M NaOH调pH至5。补加超纯水定容30 mL，Ca/P摩尔比3.3。微波消解系统水热反应：120℃，15 min。离心（4500 rpm, 10 min）收集沉淀，超纯水洗涤，冻干48 h。ATP-CL按文献[24]制备。

XRD（Cu Kα, λ=0.154 nm）表征晶相；SEM、TEM、HRTEM观察形貌；FTIR分析成分；BET测比表面积；TGA（10℃/min，N₂）研究热性质。

HEL吸附与表征

吸附实验：定量卵黄-壳微球（ATP-CG: Ca/P=3.3, 120℃, 15 min; ATP-CL: Ca/P=2.5, 120℃, 30 min）超声分散于水（10 min）配成1.5 mg/mL悬浮液。加入0.5 mL不同浓度HEL水溶液（终浓度1-7.5 mg/mL），200 rpm振荡，37℃，6 h。离心取上清，UV-Vis分光光度计280 nm测HEL含量。吸附前后微球Zeta电位、FTIR、TGA表征。

吸附等温线模型

采用Dubinin-Radushkevic（D-R）模型分析吸附行为。基于微孔填充理论，描述非理想非均匀表面吸附，区分物理/化学吸附。模型方程：Q_eq = Q_m exp(-K_DR ε²)；ε = RT ln(1+1/C_eq)；E = 1/√K_DR。E<8 kJ/mol为物理吸附，8-16 kJ/mol为离子交换，>16 kJ/mol为化学吸附。

药物吸附统计分析

数据以均值±标准差表示。单因素方差分析（one-way ANOVA）计算组间显著差异（p<0.05）。所有实验三重复，DPS软件分析数据。

结果与讨论

微球形貌与化学表征

ATP-CG卵黄-壳微球

图1展示不同反应条件下产物SEM形貌。t=5或15 min均为均匀微球；t延长至30 min形成纳米片自组装微球（图1f,i,l）。Ca/P增加亦促进纳米片自组装微球形成（图1f,i,l）。机制：微波水热下ATP水解生成ADP、AMP、腺苷并释放磷酸根；CG水解生成葡萄糖酸根和钙离子；磷酸根与钙离子反应生成初级ACP核，生长组装成ACP微球。延长水热时间或增加Ca/P加速水解释放更多离子，提高过饱和度和成核率，致形貌转变。水热时间和Ca/P对产物形貌影响显著。

不同Ca/P下120℃ 15 min合成微球FTIR谱（图2）：1620、1383、912 cm⁻¹分别属CG的C=O、C-O和ATP的P-O特征峰，暗示未水解CG、ATP或其衍生物吸附于微球表面。1035 cm⁻¹为HAp PO₄³⁻弱特征峰；1122、567 cm⁻¹为ACP PO₄³⁻吸收峰，表明产物含ACP和HAp。FTIR证实ATP作磷源、CG作钙源成功制备磷酸钙。

不同Ca/P下120℃ 15 min合成微球SEM/TEM（图3）。Ca/P=0.8或1.67为多孔微球（图3b,d）；Ca/P=2.5开始向卵黄-壳转变（图3f）；Ca/P=3.3完全由卵黄-壳微球组成（图3h）。机械破碎观察到破碎球体和暴露卵黄核（图3g插图），证实卵黄与壳间空腔结构。推测形成机制：低Ca/P时，吸附在微球表面的ATP、CG分子或衍生物抑制生长形成多孔ACP微球；增大Ca/P后，高过饱和度驱动亚稳ACP进一步生长；外表面结晶形成HAp（HRTEM证实，图3i晶面间距0.308 nm对应HAp (210)晶面）；HAp与ACP体积/密度差异产生卵黄-壳间空腔。EDS映射显示Ca、P、O元素均匀分布；EDS谱（图3k）和XPS谱（图3l）确认主要元素为Ca、P、O，与FTIR一致。

Ca/P=3.3下水热时间/温度影响形貌（图4）。t=5 min为多孔微球（图4a,b）；t=15 min为卵黄-壳微球（图4c,d）；t=60 min或T=160℃出现片/棒束（图4e-l）。形貌从多孔→卵黄-壳→片/棒转变归因于ATP、CG持续水解促进ACP生长；吸附在ACP表面的ATP、CG衍生物水解亦加速ACP生长。60 min或160℃时片/棒也从ACP纳米粒子发展而来（红框），DTA分析证实（图S1）：650℃放热峰属ACP结晶，随水热时间/温度增加峰减弱，暗示产物向结晶磷酸钙转化。

Ca/P=3.3下不同时间/温度产物FTIR和XRD（图5）。图5a FTIR：HAp PO₄³⁻特征峰1037、603 cm⁻¹；ACP PO₄³⁻峰1122 cm⁻¹；CG的C=O、C-O峰1620、1383 cm⁻¹；ATP不对称P-O伸缩振动峰912 cm⁻¹。延长水热时间/升温，CG/ATP特征峰强度逐渐减弱，表明表面吸附物进一步水解；HAp PO₄³⁻特征峰强度渐增，ACP特征峰减弱，晶相向HAp转变。图5b XRD：5或15 min处2θ≈30°非晶宽峰；60 min或160℃完全转化为HAp（JDCPS 09-0432），(211)、(300)、(002)晶面相对强度增强说明结晶度提高。XRD和FTIR进一步确证晶相随水热温度/时间转变。

ATP-CL卵黄-壳微球

为对比吸附行为，用CL作有机钙源微波水热法制备ATP-CL微球[24]。形貌上仍为卵黄-壳微球，破碎球（图6a插图）和TEM（图6b,c）验证。SAED显示离散斑点（图6d），表明高结晶度。EDS映射（图6e）显示Ca、P、O均匀分布；EDS谱（图6f）确认含Ca、P、O，为磷酸钙。

HEL吸附与吸附机制

图7展示两微球吸附曲线。随HEL初始浓度增加吸附量升高。HEL初始浓度达6.5 mg/mL时ATP-CG吸附量达平台期，最大吸附量~332±36 mg/g（图7a），约为ATP-CL（176±33 mg/g，6 mg/mL，图7b）两倍。

FTIR和TG曲线支持吸附结果（图8）。HEL吸附后微球FTIR（图8a,b）：ACP PO₄³⁻峰1134/1139、563/568 cm⁻¹，HAp PO₄³⁻峰1039/1040 cm⁻¹均存在，HEL引入未显著改变微球结构。HEL酰胺基特征峰1542/1545 cm⁻¹及-CH₃/-CH₂-峰2966,2962,2935,2927 cm⁻¹在吸附后微球检出，证实HEL成功吸附。TGA（图8c,d）：ATP-CG吸附前/后失重11.3%/36.7%，HEL吸附量约340 mg/g；ATP-CL吸附前/后失重21.1%/37%，HEL吸附量189 mg/g。TGA结果与图7吻合。

D-R模型拟合平衡吸附数据探究吸附容量差异原因（图9，表1）。ATP-CG相关系数更高，D-R模型更适用。E值<8 kJ/mol，HEL在ATP-CG上为物理吸附。最大吸附容量Q_m近381 mg/g，接近图7a结果。

因属物理吸附，考察表面电位（图10a）。超纯水中ATP-CG、ATP-CL、HEL Zeta电位分别为-17、-22、+20 mV。吸附后ATP-CG、ATP-CL电位变为+2.7、+1.5 mV，表明静电吸引驱动HEL吸附。但两微球Zeta电位差异不显著（-17 vs -22 mV），静电吸引非吸附容量差异主因。

进一步考察比表面积（图11a）。ATP-CG BET比表面积143 m²/g，约为ATP-CL（55 m²/g，表2）三倍。比表面积差异可解释吸附容量差异。ATP-CG高比表面积主要归因于低结晶度（图11b）。结晶度差异源于合成条件不同：产物结晶度随反应物水解程度增加（定压温下）。葡萄糖酸pKa=3.39高于乳酸pKa=3.86，酸性更强导致水解速率较慢，最终呈现较低结晶度。改变钙源获得高比表面积ATP-CG微球。

结论

本研究采用微波辅助水热法，以ATP作有机磷源、CG作有机钙源制备ATP-CG卵黄-壳微球。微球展现高比表面积和高吸附能力。考察了Ca/P、水热温度、时间对微球形貌结构的影响。结果表明：有机磷源和有机钙源对卵黄-壳结构形成有显著影响；水热条件（Ca/P、温度、时间）决定卵黄-壳微球形成。对比不同钙源微球HEL吸附行为发现：比表面积和表面化学性质（如表面电位）是影响微球吸附容量的两个关键因素。

数据与材料可用性

支持本文结论的所有数据均包含在文中。

缩略语

BET

Brunauer-Emmett-Teller测量

FTIR

傅里叶变换红外光谱

TEM

透射电子显微镜

XRD

X射线衍射

TGA

热重分析

HRTEM

高分辨透射电镜

SAED

选区电子衍射