通过无机酸掺杂控制表面形貌增强聚苯胺/聚乳酸纳米纤维支架生物相容性

摘要

导电可降解纳米纤维支架在外部电场下促进细胞生长、增殖和分化具有巨大潜力。尽管体液中电导率下降问题仍存在，但聚苯胺（PANI）基可降解纳米纤维仍能促进细胞粘附、生长和增殖。为探究该效应是否由PANI形态引起，我们在PANI原位氧化聚合过程中选用盐酸、硫酸、高氯酸三种无机酸作为掺杂剂。通过SEM、FTIR、XPS表征确认PLA纳米纤维成功被PANI包覆，且未改变PLA纳米纤维多孔结构。体外力学性能和降解性实验表明应考虑酸掺杂剂氧化性，其可能对PLA纳米纤维产生更高氧化降解效应。接触角测试显示不同表面形貌PANI/PLA复合纳米纤维具有良好润湿性，符合骨组织工程支架要求。表面粗糙度和细胞活力实验表明不同PANI表面形态促进细胞增殖，PANI表面粗糙度越高，生物相容性越好。因此，通过不同酸掺杂调控PANI/PLA复合纳米纤维表面形貌对组织工程生物相容性有积极影响。

引言

细胞外基质（ECM）是细胞分泌到细胞外基质中的大分子网络，为细胞、组织和器官提供基础，具有复杂网格结构。此外，它为细胞生存和活动提供适宜场所，决定细胞形状，控制分化，参与迁移和代谢，最终影响细胞生存、生长和死亡。静电纺丝纳米纤维因其高比表面积、适宜力学性能和可降解性，可模拟ECM作用调控细胞行为。此外，在保持多孔结构基础上可通过表面修饰实现多功能化。因此静电纺丝纳米纤维成为组织工程极具前景的候选材料，广泛应用于药物递送、骨再生、神经再生和修复。

导电聚合物（如聚吡咯PPy、聚噻吩PTH、聚苯胺PANI）具有良好体内外生物相容性，能显著影响细胞粘附、增殖、分化及组织再生。其中PANI因良好工艺性、优异导电性、良好氧化还原稳定性和生物相容性，被视为组织工程和再生医学潜在材料。电刺激下PANI可调控细胞粘附、增殖、迁移和分化。大量报道表明PANI基导电可降解复合纳米纤维在电场下促进细胞行为。然而存在关键问题：PANI在生理环境（pH=7.4）中因去掺杂导致电导率减弱，削弱其促进细胞增殖分化的电活性优势。尽管这明显限制了PANI基导电可降解纳米纤维在外部电刺激下骨组织工程应用，但仍能显著促进细胞增殖生长。我们推测PANI表面形态增加复合纳米纤维粗糙度，有利于细胞粘附、生长增殖。

无机酸掺杂聚苯胺一般具有良好导电性。但不同无机酸掺杂剂引入的阴离子会影响聚苯胺导电性和结构。本文选用盐酸（HCl, HA）、硫酸（H₂SO₄, SA）、高氯酸（HClO₄, PA）三种常见无机酸作为PANI原位氧化聚合掺杂剂。随后研究不同酸掺杂下PANI/聚乳酸（PLA）纳米纤维力学性能、润湿性、表面形貌、生物相容性和细胞粘附。结果表明PANI表面粗糙度越高，细胞增殖越好，生物相容性越佳。

实验方法

化学试剂

苯胺（AN）购自Sigma，PLA（Mw=60,000）购自Solarbio，二氯甲烷（DCM）购自天津富宇精细化工有限公司，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）购自Macklin。过硫酸铵（APS）购自Aladdin，HCl和H₂SO₄购自广州化学试剂有限公司，HClO₄购自Macklin。

聚苯胺/聚乳酸纳米纤维制备

静电纺丝聚乳酸纳米纤维制备

将定量PLA颗粒加入DCM和DMF混合溶液（体积比7:3）搅拌溶解，得10% PLA溶液。注入注射器连接高压电源。静电纺丝机（DP-30，天津云帆科技有限公司）设定电压15 kV，收集距离15 cm。所得PLA纳米纤维40°C真空干燥过夜。

不同无机酸掺杂聚苯胺/聚乳酸纳米纤维制备

PLA纳米纤维置于等离子清洗机腔室（PCE-6，MTI Corporation，USA），30 W射频功率放电2分钟。本文选用HCl、H₂SO₄、HClO₄三种常见无机酸作为PANI原位氧化聚合掺杂剂，相应PANI纳米纤维标记为PANI-HA、PANI-SA、PANI-PA，PANI/PLA纳米复合纤维标记为PANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PA。PLA和PANI/PLA复合纳米纤维制备工艺如图1所示。

PANI/PLA纳米复合纤维在冰浴条件下制备。按1:1摩尔比将APS和AN加入1 M酸溶液。以HCl为例说明制备过程：冰浴条件下，将AN（930 mg，0.01 mol）滴加至溶解于50 mL 1 M HCl中的APS（2280 mg，0.01 mol）中。立即将等离子处理过的PLA纳米纤维膜浸入溶液中，0°C搅拌反应2小时。反应后用HCl和乙醇多次清洗去除未附着PANI，40°C干燥过夜得PANI/PLA-HA纳米纤维备用。PANI/PLA-SA和PANI/PLA-PA复合纳米纤维采用类似方法制得。

表征

PLA纳米纤维和PANI/PLA复合纳米纤维单轴拉伸试验通过应力-应变测试仪（Shimadzu AGX-PLUS，日本）进行。试样切成哑铃状，拉伸速度恒定3 mm/min。杨氏模量从应力-应变曲线0-15%应变线性区计算，拉伸强度和断裂伸长率从纳米纤维膜断裂点确定。

纳米纤维支架形貌通过场发射扫描电镜（FE-SEM，Hitachi-SU8220，日本）观察不同无机酸掺杂PANI形态。SEM观察前纳米纤维样品喷金60秒以清晰观察形态。同时用原子力显微镜（AFM，Bruker Dimension Edge）测量PANI/PLA复合纳米纤维表面粗糙度。为确认PANI完全负载于PLA纳米纤维，用傅里叶变换红外光谱（FTIR，Thermo Nicolet iS50）测量2000-500 cm⁻¹波数变化。X射线光电子能谱（XPS；Thermo ESCALAB 250）用Al-Kα作为X射线源进一步确定PANI/PLA纳米纤维表面组成。润湿性通过接触角分析仪（OCA 15 plus，德国）在室温下测量水滴接触角评价。纳米纤维降解采用质量损失法评价。将纳米纤维膜切成16 mm圆盘置于20 mL pH 7.4磷酸缓冲液（PBS）中，37°C培养7、14、21天并干燥至恒重。

PANI/PLA复合纳米纤维支架生物相容性

生物相容性

本文通过人骨肉瘤（HOS）细胞活性实验表征PANI/PLA复合纳米纤维支架生物相容性。HOS细胞购自中国科学院上海细胞库。HOS细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，37°C、5% CO₂孵育。细胞融合度达90%时按1:3传代。

细胞增殖测试前将HOS细胞接种于PANI/PLA纳米纤维上。纳米纤维放入96孔板完全覆盖孔底，经紫外线消毒30分钟和75%乙醇溶液消毒30分钟，再用PBS洗涤。接种密度1×10⁴细胞/孔，同时设空白组和对照组。细胞在37°C细胞培养箱培养1、3、5天，每两天换液一次。

用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴盐（MTT）法评价PANI/PLA纳米纤维细胞活力。培养1、3、5天后移除96孔板培养液，PBS洗涤三次，加入含10% 5 mg/mL MTT的1 mL DMEM，37°C孵育4小时，移除培养液加入DMSO溶解甲基强的松龙，振荡10分钟，用酶标仪（BioTek Synergy HTX，USA）测定吸光度。

荧光免疫染色

HOS细胞在PANI/PLA纳米纤维培养箱培养24小时，PBS洗涤三次。用4%多聚甲醛室温固定10分钟。固定细胞PBS洗涤三次（每次10分钟），加入10 μL 100 nM FITC标记肽，室温孵育30分钟，PBS洗涤三次（每次5分钟）。HOS细胞细胞外肌动蛋白染色，共聚焦显微镜（Type A1，Nikon，日本）20×放大倍数观察细胞染色。

细胞粘附

HOS细胞在PANI/PLA复合纳米纤维支架上粘附情况通过SEM观察。24小时共培养后移除培养液，PBS洗涤三次，加入4% PFA，4°C固定过夜，PBS洗涤三次，梯度乙醇溶液（30%、50%、70%、85%、90%、100%，各20分钟）脱水，冻干24小时。SEM观察前喷铂120秒以便更好观察。

碱性磷酸酶活性（ALP）

ALP是依赖碱性磷酸酶表达的常用早期成骨细胞分化标志物。本文使用ALP检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，P0321S）。HOS细胞在不同PANI/PLA复合支架上培养7天。用50 μL Tris-HCl（0.1 M，pH 8）含0.1%（v/v）Triton X-100裂解细胞。通过定量p-硝基苯磷酸酯（PNPP）产生的p-硝基酚浓度分析ALP活性，通过记录405 nm吸光度估算。沿PANI/PLA纳米纤维培养细胞ALP活性百分比通过与纯PLA纳米纤维培养细胞ALP活性比较计算。

统计分析

结果统计学显著性通过单因素方差分析（ANOVA）用GraphPad Prism（版本8.02）评估。分析不同PANI/PLA复合纳米纤维支架力学性能、体外可降解性和细胞活力差异。p<0.05（∗）为显著差异，p<0.005（∗∗）为极显著差异。

结果与讨论

组织工程支架力学性能是评价其能否承受流体动力学的重要指标。无机酸存在可能影响PANI/PLA复合纳米纤维中PLA基质在PANI原位化学氧化聚合过程中的理化性质。因此有必要探究无机酸掺杂PANI/PLA复合纳米纤维力学性能。通过拉伸试验评价力学性能，图2展示应力-应变、杨氏模量、拉伸强度、断裂伸长率。图2a显示PLA纳米纤维呈线弹性行为，PANI/PLA-HA和PANI/PLA-SA复合纳米纤维呈明显屈服行为，而PANI/PLA-PA复合纳米纤维弹性变形后即刻断裂。PANI/PLA复合纳米纤维杨氏模量（图2b）高于PLA纳米纤维。与PLA相比，PANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PA弹性模量增量分别为53.5±9.09、60.00±9.47、28.43±8.34 MPa。拉伸强度（图2c）和断裂伸长率（图2d）方面，PANI/PLA-HA和PANI/PLA-PA下降，PANI/PLA-SA略微上升；PANI/PLA-PA拉伸强度和断裂伸长率最低。与PLA纳米纤维相比，PANI/PLA-HA和PANI/PLA-PA拉伸强度分别下降0.15±0.01和0.64±0.03 MPa，PANI/PLA-SA略增0.13±0.05 MPa。PANI/PLA-HA和PANI/PLA-PA断裂伸长率分别下降16.93±1.38%和35.42±3.94%，PANI/PLA-SA增加3.32±0.13%。

如图2所示，选定无机酸通过PANI涂层连接可增加PLA纳米纤维弹性模量。拉伸强度和断裂伸长率方面，与PLA纳米纤维相比，PANI/PLA-HA和PANI/PLA-SA机械性能变化程度不同，而PANI/PLA-PA下降最明显，施加应力测试时5秒内即发生断裂。这可能归因于HClO₄氧化性导致PLA分子链酯键断裂和羧基氧化分解，导致力学性能劣化。同时PANI/PLA-HA和PANI/PLA-SA不同力学性能可能与HCl和H₂SO₄掺杂PANI密度不同有关，反应过程中APS引入也可能对PLA纳米纤维略有影响，这些因素综合作用表现出不同力学性能。

细胞粘附、增殖、分化受形态影响，粗糙表面一般被认为有利于细胞粘附。PLA纳米纤维疏水性意味着均匀PANI聚合形成屏障，而等离子体表面处理可显著改善PLA纳米纤维润湿性。经不同无机酸掺杂PANI原位聚合后，获得表面均匀沉积PANI/PLA复合纳米纤维。

不同PANI/PLA纤维表面PANI形态通过FE-SEM观察（图3）。图清晰显示PLA纳米纤维表面被大量不规则纳米颗粒覆盖，无机酸掺杂PANI/PLA复合纳米纤维能保持良好纤维形态和多孔纳米纤维结构。形态观察证实PANI/PLA复合纳米纤维成功负载PANI，为细胞粘附增殖提供基础。同时用AFM测量PANI/PLA复合纳米纤维表面粗糙度（图4）。Ra为各样品三个不同位置表面粗糙度平均值，通常用于评价样品表面粗糙度。PANI/PLA复合纳米纤维Ra大于PLA纳米纤维，PANI/PLA-PA Ra最高。表面粗糙度增加扩大了表面积和极性，潜在提供更多细胞生长位点，促进细胞粘附。

细胞粘附、迁移、增殖显著受支架润湿性影响。通常用支架与水接触角评价润湿性。鉴于PLA疏水，我们在1秒内测量纳米纤维膜水滴接触角（图5）。处理后PANI/PLA纳米纤维接触角显著降低。PLA、PANI/PLA-HA、PANI/PLA-SA、PANI/PLA-PA对应接触角分别为112°、61.6°、36.7°、37.2°。PANI/PLA PANI形态增加体系表面能，初始接触水时接触面积增加，导致接触角降低、润湿性改善。复合纳米纤维接触水5秒后接触角变为0°，展现良好亲水性。这种亲水支架也为细胞粘附和扩散提供有利条件，因等离子处理后含氧官能团（如-OH、-COOH）更多结合纳米纤维表面，PANI形态和含氧官能团协同作用确保PANI/PLA复合纳米纤维最终完全润湿。

纯PANI和不同无机酸掺杂PANI/PLA复合纳米纤维FTIR光谱见图6。纯掺杂PANI光谱（图6a）中1565、1485、1298、1125 cm⁻¹强特征峰分别对应醌环C=C伸缩、苯环C=C伸缩、C-N伸缩、=C-H伸缩振动。纯掺杂PANI光谱（图6b）除PANI特征峰外，还可见PLA峰（1092和1184 cm⁻¹ C-O伸缩振动峰，1757 cm⁻¹ C=O伸缩振动峰）。结果表明PANI成功负载于无机酸掺杂PANI/PLA纳米纤维表面。为进一步研究化学组成，用XPS分析表面组成。XPS谱（图7a）显示PANI/PLA复合纳米纤维~400 eV处有明显N1s峰。PANI/PLA-HA和PANI/PLA-PA~200 eV处可见Cl2p峰，PANI/PLA-PA Cl2p峰强度高于PANI/PLA-HA。PANI/PLA-SA XPS谱~210 eV处出现S2p峰。XPS表明Cl⁻、SO₄²⁻、ClO₄⁻分别掺杂到相应PANI/PLA纳米纤维。此外，PANI亚胺氮原子完全或部分氧化产生一系列氧化态，伴随不同程度质子化。通过N1s核能级谱（图7b-d）测量PANI氧化态和质子化水平变化。每个N1s谱可解卷积为四个主要成分，结合能约398.7、399.6、400.4、401.8 eV，分别归因于醌亚胺（-N=）、苯胺（-NH-）、质子化胺（-N⁺）、质子化亚胺（=N⁺）。参考Kumar研究，N1s谱拟合峰受质子化N原子结合阴离子电荷影响，导致离域化和轻微位移。

作为组织修复再生模板，生物活性支架诱导细胞组织修复后降解排出体外。本文用质量损失法评价纳米纤维支架降解性能（图8）。所有样品质量损失在7、14、21天均增加。PLA纳米纤维质量损失率分别为4.34±0.41%、7.84±1.57%、12.65±0.83%。PANI/PLA-PA复合纳米纤维经原位氧化聚合后质量损失逐渐增加，7、14、21天质量损失率分别为31±2.15%、34±1.86%、40±2.54%，显著高于PANI/PLA-HA和PANI/PLA-SA。PANI原位氧化聚合过程中氧化剂APS可能破坏PLA酯键诱导水解反应，导致PLA纳米纤维微裂纹。随PBS浸泡时间延长，微裂纹逐渐累积PLA基质逐渐降解。表面负载PANI也脱落，导致纳米纤维质量损失率增加。随时间增加质量损失率更明显。HClO₄强氧化性加剧PLA降解，加速PANI/PLA-PA纳米纤维质量损失，与图2力学性能一致。

生物活性支架生物相容性是促进细胞粘附、生长增殖基础。本文研究HOS在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维上增殖说明粘附和生物相容性。化学处理和功能化过程中多种潜在影响因素可能影响生物活性支架制备，因此研究生物相容性是评价实际应用关键。

为研究PANI/PLA复合纳米纤维生物相容性，用MTT法评价细胞活力。图9显示HOS在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维上培养1、3、5天细胞活性。随培养时间延长，纳米纤维细胞活性逐渐增加；PANI/PLA-PA细胞活性最好，5天培养细胞活性最高。

PLA可降解但疏水，不利于细胞粘附、生长增殖。等离子处理后PANI/PLA复合纳米纤维表面负载含氧基团，功能化表面展现良好亲水性。上述形态和AFM结果表明不同无机酸掺杂PANI在PLA纳米纤维表面呈现不同形态和粗糙度。同时PANI/PLA复合纳米纤维表现优异润湿性。因此我们认为不同无机酸掺杂PANI形态增强PANI/PLA复合纳米纤维表面能和极性，进而影响细胞生长、迁移增殖，改善细胞活性表现。

为进一步研究PANI/PLA复合纳米纤维细胞行为，通过荧光免疫染色（图10）和SEM（图11）观察纳米纤维上细胞生长粘附。比较不同纳米纤维表面肌动蛋白和细胞形态。细胞在PLA纤维和PANI/PLA纳米纤维生长时，肌动蛋白束呈良好伸展状态。PANI/PLA复合纳米纤维细胞密度高于对照组PLA纳米纤维，细胞生长密度顺序为PANI/PLA-PA > PANI/PLA-SA > PANI/PLA-HA。HOS细胞在PANI/PLA纳米纤维生长呈扁平多极形状粘附。明显许多细胞嵌入PANI/PLA纤维孔隙，而在PLA纳米纤维上伸展差无法充分扩张。结果表明PANI/PLA复合纳米纤维促进HOS细胞粘附增殖。

同时细胞免疫荧光染色和细胞粘附结果表明不同PANI形态影响HOS细胞生长、粘附增殖，与上述结果一致。

作为早期成骨标志物，在PLA和PANI/PLA复合纳米纤维支架上进行7天ALP测试。与纯PLA纳米纤维相比（图12），PANI/PLA复合纳米纤维ALP活性显著提升。显然PANI/PLA-PA复合纳米纤维ALP活性最好。结果证明PANI/PLA复合纳米纤维表现更好生物相容性，与上述细胞粘附、生长增殖结果一致。

结论

本文以三种无机酸为掺杂剂原位聚合制备不同表面形态PANI/PLA复合纳米纤维。确认PANI可成功负载于PLA表面且不改变纳米纤维多孔结构。力学性能和体外降解实验表明氧化性酸能显著削弱聚酯纳米纤维力学性能并加速降解。同时粗糙表面带来更好润湿性，促进细胞粘附、生长增殖，表明生物相容性更好。结论：通过不同酸掺杂调控PANI形态对组织工程生物相容性有积极影响。

数据与材料可用性

作者声明材料和数据可及时向读者提供，无不合理材料转让协议限制。本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

缩略语

PANI:

聚苯胺

PLA:

聚乳酸

ECM:

细胞外基质

PPy:

聚吡咯

PTH:

聚噻吩

AN:

苯胺

DCM:

二氯甲烷

DMF:

N,N-二甲基甲酰胺

APS:

过硫酸铵

HOS:

人骨肉瘤细胞

DMEM:

Dulbecco改良Eagle培养基

PBS:

磷酸缓冲液

MTT:

3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四氮唑溴盐

FITC:

异硫氰酸荧光素

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

FE-SEM:

场发射扫描电镜

XPS:

X射线光电子能谱

ALP:

碱性磷酸酶