硫酸软骨素-甲氨蝶呤纳米凝胶的抗肿瘤研究

背景

甲氨蝶呤（4-氨基-10-甲基叶酸，MTX）是一种叶酸类似物，属于抗叶酸抗代谢物家族[1]。 MTX是1950年代第一个用于肿瘤治疗的药物[2]，它是一种致突变和致畸的抗肿瘤药物，通过阻断酶活性和干扰DNA合成发挥作用[3]。既往研究表明，仅将化疗药物递送至靶细胞不足以诱导细胞死亡，大剂量MTX可显着提高治愈率和患者预后[4]。 MTX的水溶性低、渗透性低、半衰期短，限制了其临床应用[5, 6]。 MTX的化疗效果很大程度上受其低肿瘤细胞摄取、组织生物分布和严重副作用的影响[7]。然而，由于 MTX 的生物利用度较差，较高浓度的 MTX 会增加不良反应的风险 [8]。迫切需要开发一种新的给药系统来提高MTX的生物利用度并减少其副作用。

纳米技术在药物递送系统方面具有优势，包括提高药物稳定性、延长血液循环、减少副作用和控制药物释放[9,10,11,12,13,14,15]。自组装技术已广泛应用于药物递送领域，以提高药物的疗效和降低药物的不良反应[16,17,18,19,20]。我们的研究旨在设计一种用于 MTX 的纳米凝胶药物递送系统，以提高其溶解度和生物分布并减少其副作用。硫酸软骨素 (CS) 是一种酸性糖胺聚糖 (GAG)，是软骨、血管壁、皮肤、肌腱和其他结缔组织的重要组成部分 [21]。以前曾研究过基于硫酸软骨素的纳米凝胶 [22, 23]。研究发现 CD44 结合 CS 蛋白聚糖 [24,25,26]。 CD44 是一种具有细胞外结构域的跨膜糖蛋白，参与介导细胞-细胞和细胞-ECM 相互作用，并在细胞迁移中发挥作用 [27]。 CD44 在转移性癌症中高表达，而在正常组织中表达水平低 [28]。据报道，基于 CS 的纳米颗粒可用于肿瘤靶向和抗肿瘤药物递送 [29, 30]。在这里，我们制造了一种新型的自组装 CS-MTX 纳米凝胶，旨在通过 CS-CD44 相互作用增强 MTX 药物分子向癌细胞的靶向递送。

方法

材料和样品

硫酸软骨素购自大连美伦生物科技有限公司（大连，辽宁，中国）。 4-甲基吗啉、四氢呋喃、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪购自太阳化学科技（中国上海）有限公司，胎牛血清（FBS）购于来自 HyClone（美国犹他州）。所有其他化学品均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。 Lewis大鼠购自上海西普博克实验动物有限公司（中国上海）。

DMT-MM的合成

4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物 (DMT-MM) 用于羧酸活化的脱水缩合反应，可用于水性或质子溶剂系统。将 25 克 2-氯-4, 6-二甲氧基-1, 3, 5-三嗪 (CDMT) 溶解在 200 毫升四氢呋喃 (THF) 中。然后，在搅拌下将18.79ml 4-甲基吗啉(NMM)滴加到CDMT溶液中。为了确保完全响应，应保持搅拌 30 分钟。然后，过滤后的产物用四氢呋喃洗涤 3 次，真空干燥 24 小时。 DMT-MM 为白色粉末（方案 1）。

DMT-MM形成的合成途径

MTX-CS的合成

MTX 结合的 CS 被 DMT-MM 激活。对于 CS 活化，将 CS (1.0 g) 溶解在 20 ml 超纯水中并通过添加 DMT-MM (0.769 g) 进行活化。反应在室温下进行 30 分钟。然后，活化的 CS 在室温下与 MTX 进一步反应 24 小时。将溶液透析 48 小时，每 4 小时换一次水并冻干。获得黄色粉末的 MTX-CS。通过傅里叶变换红外光谱法（ALPHA，BRUKER，USA）检测黄色粉末。 FTIR 光谱记录在 400 到 4000 cm ^-1 . ¹ H NMR 用于确定 MTX 是否与 CS 偶联（方案 2）。

MTX-CS形成的合成途径

MTX-CS 纳米凝胶的细胞毒性

通过使用A549T和Hela肿瘤细胞以及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养物分析纳米凝胶的细胞毒性。 A549T和Hela细胞以5×10 ³ 的密度接种在96孔板中 1640 中每孔细胞，补充 10% FBS 并在 37°C 下在 5% CO2 下孵育 24 小时。 A549T 之后用不同浓度的 MTX-CS NGs（0、5、10、20、30、40、50、100、200、400 μM）处理，Hela 之后用不同浓度的 MTX- CS NGs（0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 μM）再过 48 小时。 MTX-CS NGs 的浓度基于每个样品中 MTX 的含量。 CS 的浓度基于每个样品中 MTX-CS NGs 的含量。将 HUVEC 以 5 × 10 ³ 的密度接种在 96 孔板中 DMEM 中每孔细胞，补充有 10% FBS，并在 37°C 下在 5% CO2 下孵育 24 小时。然后向 HUVEC 添加不同浓度的 MTX-CS NG（0、5、10、20、30、40、50、100、200、400 μM）。 MTX-CS NGs 的浓度基于每个样品中 MTX 的含量。 CS 的浓度基于每个样品中 MTX-CS NGs 的含量。 MTT测定是细胞活性的测量。将 20 微升 CCK-8 缓冲液添加到每个孔中，并在 37°C 下在 5% CO2 下再孵育 4 小时。去除培养基，并在每个孔中加入 200 μL DMSO。在 MULTISKAN GO 酶标仪（Thermo Scientific，美国）上在 490 nm（570 nm 作为参考）波长下测量吸光度。

动物和实验设计

为了分析MTX-CS NGs的体内毒性，从浙江医学科学院实验动物中心（中国浙江杭州）购买了第18只雄性Sprague-Dawley大鼠。这些大鼠被关在 12 小时光照、12 小时黑暗循环下，可以自由获取水和食物。 8周龄（200±10g）大鼠随机分为三组：对照组（注射等体积生理盐水）、MTX组（注射1.25 μmol kg ^-1 天 ⁻¹ )，和 MTX-CS NG 组（注射 25 mg kg ⁻¹ 天 ⁻¹ MTX-CS NG）。 MTX-CS NG组的MTX剂量等于MTX组的游离剂量（1.25 μmol kg ^-1 天 ⁻¹ ）。隔天分别腹腔注射给药。治疗 2 周后（共注射 7 次），所有大鼠均被斩首处死以供进一步研究。

组织学研究

断头后，迅速解剖所有大鼠的脾脏，用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗两次，并固定在 4% (w /v ) 多聚甲醛 (pH =7.4) (Sigma-Aldrich, MO, USA) 24 小时。然后，使用标准程序制备用于苏木精和伊红（H＆E）染色的组织，并在高质量光学显微镜下获得。

结果与讨论

MTX-CS的合成

为了确定 MTX 是否与 CS 结合，我们使用了 FTIR 和 ¹ H NMR 分析 MTX、CS 和 MTX-CS 生物偶联物样品。图 1 显示了 CS（图 1a）、MTX（图 1b）和 MTX-CS 生物偶联物（图 1c）的 FTIR 光谱。如图 1b 所示，MTX 在 3355、2951、1646、1600、1540、1493、1403 和 1207 cm ^-1 处具有特征透射率 . FTIR 峰值在 1600 和 1540 cm ^-1 可以归因于对苯的拉伸，这可以在 MTX（图 1b）和 MTX-CS 生物偶联物（图 1c）的 FTIR 光谱中找到。 FTIR结果表明MTX与CS成功偶联。

一 CS 的 FTIR 光谱。 b MTX 的 FTIR 光谱。 c MTX-CS的FTIR光谱

图 2 显示了 ¹ CS、MTX 和 MTX-CS 生物偶联物的 H NMR 光谱。在 6.93 (2H, d, J =10.1 Hz) 和 7.84 (2H, d, J =10.1 Hz) 可以分配给 MTX 的苯甲酰基。 4.90 (2H, s) 处的峰可归于 2, 4-二氨基-6-蝶啶基旁边的亚甲基，8.69 (1H, s) 处的峰可归于 2, 4-二氨基- MTX 的 6-蝶啶基如图 2b 所示。 ¹ CS-MTX 的 H NMR（图 2c）表明 CS（二糖部分 δ H 信号在 3.20 和 5.40 之间，其中 5.39 被指定为异头碳）成功连接到 MTX（苯甲酰基的化学位移为 8.00 和 6.88，甲基在 3.20）。 NMR也证明MTX与CS结合。

¹ CS、MTX 和 CS-MTX 的 H NMR 光谱。 一 ¹ CS的H NMR谱； CS溶解在D2O中。 b ¹ MTX的H NMR谱； MTX溶解在二甲亚砜-d6中。 c ¹ CS-MTX的H NMR谱； CS-MTX溶解在D2O中

为了计算与 CS 结合的 MTX 的量，将样品溶解在超纯水中并在室温下振摇 48 小时。 MTX 的量通过使用紫外-可见分光光度计在 309 nm 处确定。 MTX的量通过UV-vis光谱测量。最后，MTX-CS NGs 上甲氨蝶呤的计算量为 13.65%。通过 CS 亲水侧链的外层包裹疏水性 MTX 分子形成纳米凝胶（图 3a）。纳米凝胶通过动态光散射 (DLS)、原子力显微镜 (AFM) 和透射电子显微镜 (TEM) 进行表征。如图所示，DLS 数据测量了 100-400 nm 范围内所有纳米凝胶的尺寸（图 3b）。纳米颗粒的粒径主要在 200 nm 左右。纳米凝胶的 AFM 图像证实纳米颗粒分布良好，具有类似的约 200 nm 大小和形态（图 3c）。 TEM 图像还显示纳米凝胶的大小是大小在 200-240 nm 范围内的纳米球。纳米颗粒的粒径主要在 200 nm 左右（图 3d、e）。

MTX-CS NG 的示意图。 MTX-CS NG 的动态光散射 (DLS)、原子力显微镜 (AFM) 和透射电子显微镜 (TEM) 表征。 一 MTX-CS NG 的示意图。 b 在代表性实验中由 DLS 测量的 MTX-CS NG 的大小。 c MTX-CS NG 的 AFM 图像。 d , e MTX-CS NGs的TEM图像

为了计算与 CS 结合的 MTX 的量，将样品溶解在超纯水中并在室温下振摇 48 小时。 MTX 的量通过使用 313 nm 的紫外可见分光光度计确定。

MTX的量通过UV-vis光谱测量。首先，建立游离甲氨蝶呤 UV 吸收的标准曲线（图 4）。吸光度与游离MTX浓度的关系为：

甲氨蝶呤紫外吸收标准曲线

然后，将 28.8 mg MTX-CS 溶解在 1000 ml 超纯水中，UV 吸收为 0.2055。最后，MTX-CS NGs上甲氨蝶呤的计算量为13.65%。

MTX-CS 纳米凝胶的细胞毒性

MTX-CS NGs、游离 MTX 和 MTX 与 CS 混合的体外抗肿瘤活性通过使用 A549T 和 Hela 肿瘤细胞培养物进行分析。正如 MTT 测定（图 5）所示，MTX-CS NGs 可以显着降低两种癌细胞的活力，而游离 MTX 在高浓度下没有显示任何影响。 MTX 与高浓度的 CS 混合甚至会促进癌细胞的生长。在 10 μM 药物浓度下，Hela 的存活率从游离 MTX 的 73.81% 降低到 MTX-CS NG 的 60.16%（细胞存活率降低 13.65%）（图 5a）。同样，在 50 μM 药物浓度下，A549T 细胞活力从游离 MTX 的 80.23% 降低到 MTX-CS NG 的 46.04%（细胞活力降低 34.09%）（图 5b）。透明质酸等多糖可作为药物偶联物或纳米颗粒的靶向部分用于癌症治疗，因为它与 CD44 受体特异性结合 [31]。硫酸软骨素还可以作为 CD44 受体的配体 [25, 27] 这意味着 CS 可以促进癌细胞对 MTX-CS NGs 的吸收并增强 MTX 的药效。此外，纳米粒子可以提高药物的稳定性，控制药物的释放[32, 33]。所有结果证明MTX-CS NGs的抗肿瘤活性优于游离MTX以及与CS混合的MTX。随着 MTX 药物分子细胞内递送效率的提高，与相同浓度的游离 MTX 相比，MTX-CS NGs 的靶向选择性也有所提高。这些结果表明MTX-CS NGs比游离MTX具有更好的抗肿瘤作用。

一 在存在游离 MTX、游离 MTX 和 CS 以及 MTX-CS NG 的情况下，A549 T 在 48 小时内的细胞活力。 b 在存在游离 MTX、游离 MTX 和 CS 以及 MTX-CS NG 的情况下，Hela 在 48 小时内的细胞活力。 c 在游离 MTX、CS 和 MTX-CS NGs 存在下，HUVEC 在 48 小时内的细胞活力

通过使用 HUVEC 培养分析 MTX-CS NG、游离 MTX 和 CS 的不利影响。如 MTT 分析所示（图 5c），MTX-CS NGs 可以显着降低副作用，而游离 MTX 可以显着降低 HUVEC 的活力。在 10 μM 药物浓度下，HUVEC 的存活率从游离 MTX 的 63.6% 增加到 MTX-CS NG 的 73.5%（细胞存活率增加 9.9%）（图 5c）。 HUVEC 在 400 μM 时的细胞活力仍为 69.95%。结果表明MTX-CS NGs可以减少对正常细胞的副作用。

动物和实验设计

用于治疗癌症患者的 MTX 的主要继发性毒副作用之一是肠道粘膜炎，它会导致体重迅速下降 [34]。然后，我们测试了 MTX-CS NGs 对雄性 Sprague-Dawley 大鼠化疗诱导的体重减轻的保护作用。在注射盐水、游离 MTX 和 MTX-CS NG 后 14 天监测存活率和体重。三组均未发现死亡病例。观察到所有 MTX 组的体重突然下降（1.25 μmol kg ^-1 天 ⁻¹ 14 天），清楚地表明大鼠经历了化疗综合征和化疗引起的损伤，导致疾病和体重减轻，而用 MTX-CS NGs 治疗的大鼠的体重（4.25 mg kg ^-1 天 ⁻¹ 14 天）略有增加（图 6）。结果表明 MTX-CS NGs 没有造成不良影响。这些发现支持MTX通过CD44-CS相互作用靶向递送至肿瘤组织并降低MTX药物的细胞毒性。

MTX 和 MTX-CS NGs 对大鼠体重的影响。第一次注射的那天被认为是第 0 天。盐水，MTX（1.25 μmol kg ⁻¹ 天 ⁻¹ ) 和 MTX-CS NGs (4.25 mg kg ⁻¹ 天 ⁻¹ ) 分别通过腹腔注射给予相应组另一天。结果表示为平均值 ± SEM 并使用 t 进行分析 测试。 *P <0.05 与第 0 天的日期相比

为了进一步研究 MTX-CS NGs 的体内毒性，对大鼠脾脏进行组织学分析以确定 MTX-CS NGs 是否引起组织损伤（图 7）。对照组的切片显示正常脾脏的结构，由白髓（形状）和红髓（RP）组成，纤维小梁（T）延伸到脾髓中。白髓包含动脉周围淋巴鞘和脾滤泡并被边缘区包围，而红髓由脾索组成并被脾窦分隔（图 7a 和 7b）。 MTX 治疗组显示白髓（黑匣子）和 RP 均严重变窄。在 MTX 治疗组中也可以发现含铁血黄素沉积物（图 7c 和 7d）。 MTX-CS NG 治疗组的白髓（形状）和 RP 均轻度变窄，未发现含铁血黄素沉积。与 MTX 组相比，白髓和红髓均表现出轻度变窄（图 7e 和 7f）。以上结果表明MTX-CS NGs对正常组织的副作用很小[35, 36]。

MTX和MTX-CS NGs对大鼠脾脏的毒性作用。在 7 次腹膜内注射后 14 天处理后，H&E 染色从小鼠身上切除的脾脏。 一 , b 对照组的部分。 c , d MTX 治疗组。 e , f MTX-CS NG治疗组

结论

总之，我们成功地制造了自组装纳米凝胶，用于高效的抗肿瘤药物递送。 MTX-CS 偶联的纳米凝胶大小约为 200 nm，显示出良好的稳定性和溶解性。 MTX-CS NGs 显示出比 MTX 更强和更特异的细胞毒性。体内实验表明，MTX-CS NGs 的毒性低于 MTX。 MTX-CS NGs可以提高抗肿瘤作用，同时减少MTX的副作用。由于其CD44结合特性，硫酸软骨素-药物偶联物可以成为提高微溶药物分子溶解度以及主动和选择性靶向递送至癌细胞和肿瘤组织的有前途和有效的平台。

缩写

¹ 核磁共振氢谱：

1H核磁共振

原子力显微镜：

原子力显微镜

CDMT：

2-氯-4, 6-二甲氧基-1, 3, 5-三嗪

CS：

硫酸软骨素

DLS：

动态光散射

DMT-MM：

4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物

FTIR：

傅里叶变换红外

MTT：

3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-溴化四唑

MTX：

甲氨蝶呤

MTX-CS NG：

甲氨蝶呤-硫酸软骨素纳米凝胶

NG：

纳米凝胶

NMM：

4-甲基吗啉

TEM：

透射电子显微镜

THF：

四氢呋喃

UV-vis:

紫外可见光谱