使用高度生物相容性 Au Nanocages@PEG 纳米粒子作为新的对比剂用于体内计算机断层扫描成像

介绍

近年来，计算机断层扫描 (CT) 扫描已成为临床环境中最常用的诊断成像技术，并且在各种人体组织的研究中有着广泛的应用。由于CT扫描具有较强的穿透力和高对比能力以及相对简单的图像处理，被认为是现代医疗系统中最强大的无创影像诊断技术[1, 2]。然而，在成像过程中，病灶与周围一些结构之间没有自然的对比。因此，必须使用具有相对较高或较低密度的物质的造影剂来区分目标结构或组织和器官。此外，这种物质在不同组织中具有不同的吸收能力，可以通过软组织中的 X 射线照射观察到。已经评估了一些分子和几种微粒造影剂在 CT 扫描成像中的应用[3,4,5]。

目前，CT扫描最常用的造影剂是含有碘的有机分子。碘化分子，例如碘离子或非离子制剂，在临床环境中被广泛用作 CT 扫描的造影剂。尽管碘化分子可以提供良好的 CT 扫描对比度增强，但它们具有快速的肾脏清除率、较短的体内循环时间和过敏特性，这极大地限制了进一步的应用 [6, 7]。由于碘显色剂的快速去除，血池成像的有效时间窗口受到严重限制，难以获得高对比度图像。此外，大剂量药物的快速清除可能对肾脏产生潜在的副作用[8, 9]。

在过去的十年中，纳米粒子在生物医学中的应用，特别是在诊断成像中，受到了相当多的关注 [10]。与碘基造影剂相比，纳米粒子具有小分子所不具备的对比特性，并且它们还具有特定的尺寸、形状和表面 [11, 12]。通常，原子序数较大的纳米粒子，如金、银等金属纳米粒子，具有优良的X射线吸收系数；因此，它们具有显着的对比度增强能力 [13, 14]。在这些纳米粒子中，金纳米粒子在生物医学领域得到了迅速发展，由于其显着的生物惰性和易于合成和表面改性而被认为是碘基显像剂的替代品 [15,16,17]。与碘化合物相比，金纳米粒子具有更长的血液循环时间、更低的肾毒性风险和更强的 X 射线吸收系数。因此，可以提供减少的剂量，并且副作用的风险低[18]。几种金纳米粒子，包括纳米球、纳米棒和纳米星，已被广泛用作 CT 扫描成像的造影剂 [19, 20]，并且具有良好的效果。在各种金纳米结构中，Au纳米笼内部中空，多孔壁薄；因此，与其他不同形态的金纳米粒子相比，它们具有更高的表面积和更有效的 CT 扫描成像能力 [21, 22]。近年来，金纳米笼已被用作光学相干断层扫描和光声断层扫描的对比度增强剂，并被发现具有良好的性能。同时，由于 Au 纳米笼的大吸收面积，它们也是有效的光热换能器 [23, 24]。据我们所知，只有少数研究评估了 Au 纳米笼作为 CT 扫描成像造影剂的使用。基于上述研究，我们进一步探索了 Au 纳米笼作为 CT 扫描造影剂的用途。纳米粒子在 CT 扫描成像中的应用需要具有生物相容性和生物活性的表面。聚乙二醇 (PEG) 是一种可生物降解和生物相容性聚合物，也是用于防止被 RES 捕获并提高生物相容性、肾脏清除能力和血液循环时间的隐身材料；因此，聚乙二醇化纳米颗粒可以在血液中长期保留[15, 25,26,27,28]。

在这项研究中，新的 AuNC@PEG 被制备和表征。然后，通过MTT比色法、乳酸脱氢酶（LDH）渗漏法、细胞内活性氧（ROS）浓度测定、钙黄绿素-AM/PI等实验技术评估AuNC@PEGs的体外生物相容性。此外，还进行了血液学和组织学分析以确定 AuNC@PEG 的体内毒性。结果表明，AuNC@PEGs 具有良好的体外和体内生物相容性。此外，发现AuNC@PEGs具有更强的体外和体内CT扫描成像能力。这些实验结果表明，合成的AuNC@PEGs具有对比度强、血液循环时间长、肾毒性风险低等明显优势。因此，本研究合成的功能化AuNC@PEGs在CT扫描成像中具有巨大的临床应用潜力。

方法

所有实验方案，包括任何相关细节，均经中国辽宁省锦州医科大学区域伦理委员会批准。

材料和仪器

LDH和ROS检测试剂盒购自南京生物工程研究所，Calcein-AM/PI染色试剂盒购自上海东仁化工科技有限公司。其他化学试剂和溶剂购自 Sigma-Aldrich。使用荧光显微镜（DMI4000B，Leica，Wetzlar，Germany）评估所有切片。用透射电子显微镜（TEM）评估合成纳米颗粒的特性。采用256排512层螺旋CT扫描（德国飞利浦），成像参数如下：层厚，0.625 mm；管电压，100 Kvp；和管电流，100 mA。

AuNC@PEGs 的合成

根据先前的研究 [29, 30]，使用 Ag 纳米立方体和 HAuCl4 溶液之间的简单电流置换反应制备 Au 纳米笼。通常，25 纳米银纳米立方体在二甘醇中制备，并用作合成 30 纳米金纳米笼的模板。然后，将 SH-PEG（MW ≈ 2000，10 mg 溶解在 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中）添加到 AuNC 溶液（pH 8.0、6.55 nM、6 mL）中，并在氮气下在黑暗中搅拌过夜保护。 AuNC@PEGs再洗涤3次后分散在水溶液中。

体外毒性评价

本研究采用MTT比色法、LDH渗漏法、细胞内ROS浓度测定和Calcein-AM/PI染色等方法体外检测合成的AuNC@PEGs的毒性。 HUVEC细胞接种于96孔板中，密度为1×10 ⁴ /好。使用补充有10%胎牛血清和青霉素（100 μg/mL）和链霉素的RPMI-1640培养基。然后，将细胞在37 °C和5%二氧化碳的培养箱中培养12 小时。然后，加入不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）的AuNC@PEGs培养基进行进一步培养。 24 h后，获得MTT测定。各组均以不含纳米颗粒的培养基作为对照。

然后，测定用不同浓度 AuNC@PEGs 处理的 HUVEC 细胞释放的乳酸脱氢酶 (LDH) 的含量，以评估体外毒性。细胞以类似于 MTT 的方式接种，然后用不同浓度（10、20、50、100、200、500 和 1000 μg/mL）的 AuNC@PEGs 处理 24 h。然后，分离上清液，离心，并转移到干净的 96 孔板中。培养基中LDH活性按厂家说明书测定，吸光度用酶标仪测定（450 nm）。

基于使用 ROS 试剂盒测量细胞内 ROS 浓度的原理，DCFH 在 2',7'-二氯荧光素 (DCFH-DA) 的存在下被氧化为二氯荧光素 (DCF)，这是一种强绿色荧光物质 DCF。将 HUVEC 细胞在 24 孔板中培养 12 h，用不同浓度（50、100、200 和 500 μg/mL）的 AuNC@PEGs 处理 24 h，并在 37 °C 下与 DCFH-DA 一起孵育40 分钟用过氧化氢 (H2O2) 处理的细胞用作阳性对照。使用荧光显微镜（λex，485 nm；λem，525 nm）观察细胞的荧光强度。评价前用无血清无冰培养基洗涤3次。

对于活/死染色，将 HUVEC 细胞接种到 24 孔板中并培养 12 h。然后，将细胞用不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）的AuNC@PEG处理24 小时。通过离心用胰蛋白酶-EDTA 消化后，用 PBS (pH =7.4) 洗涤细胞；然后，将制备好的细胞悬液与预先配置好的Calcein-AM/PI试剂混合，37 ℃培养15 min。为了检测AuNC@PEGs的毒性，通过荧光显微镜评估死细胞的数量。

动物模型

所有动物实验程序均按照锦州医科大学动物保护和使用委员会制定的标准进行。实验结束后，根据人道主义原则对动物实施安乐死。在本研究中，使用体重为 250-300 g 的成年 Sprague Dawley 大鼠（购自锦州医科大学动物中心）。在本实验中，所有动物随机分组。水合氯醛溶液（10 wt%）经腹腔给药；然后，所有材料均经尾静脉注射。

体外和体内 CT 扫描成像

对于体外 CT 扫描成像，将不同浓度的 AuNC@PEGs 和碘溶液置于 EP 管中并按适当顺序排列，从前到后进行 CT 扫描。在体内CT扫描中，在给予麻醉后，从头到尾扫描动物，以腹腔中心为界标。动物的位置每次都没有变化。所有原始数据（0.625 mm图像）通过CT扫描传输到飞利浦工作站进行分析。

体内毒性评价

使用标准大隐静脉采血技术进行血液学分析。大鼠心、肝、脾、肺、肾组织用4%多聚甲醛固定48 h，脱水后石蜡包埋。石蜡切片厚 5 μm 并固定在载玻片上。苏木精伊红（H&E）染色，显微镜下分析。

统计分析

数据采用单因素方差分析，P 值被用作索引。一个 P 值<0.05被认为具有统计学意义，以SD的平均值表示。

结果与讨论

AuNC@PEGs 的合成和表征

表面功能化和尺寸控制是开发高性能纳米对比剂的两个关键因素[ 15]。 AuNC@PEGs的结构和特性通过TEM和DLS确定。图 1a 表明 AuNC@PEGs 的尺寸在 40 nm 左右，具有较高的均匀性；同时，AuNC@PEGs的水合半径也被用来测试溶液中的分散性，如图1b所示，AuNC@PEGs的水合半径约为50 nm，表明AuNC@PEGs非常稳定，没有任何聚集. AuNC@PEGs具有较小的尺寸和较好的生物惰性，更适合纳米医学应用。此外，空心笼结构显示出较大的内外比表面积和更好的CT扫描成像能力，周围的金属壁在其加工、运输和储存过程中为有效载荷提供了额外的保护。由于其明显的核壳结构，外面覆盖了具有生物适用性的PEG，可有效增强生物相容性，逃避巨噬细胞的捕获。

AuNC@PEGs (a ) 和 AuNC@PEGs (b )

AuNC@PEGs 体外的安全性和稳定性

在使用 AuNC@PEGs 进行体内成像之前，我们评估了它们的安全性和稳定性。使用 MTT 测定检测 AuNC@PEGs 对 HUVEC 细胞活力的影响（图 2a）。细胞用不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）的AuNC@PEG处理24 小时。 MTT检测结果表明，当AuNC@PEGs浓度达到200 μg/mL时，AuNC@PEGs的细胞存活率与对照组相似，具有良好的生物相容性。 1000 μg/mL的细胞存活率仍> 75%。

不同AuNC@PEGs浓度培养24 h的HUVEC细胞活力的MTT评估(a ）。含 LDH 的 AuNC@PEGs 诱导上清液中乳酸脱氢酶的评估 (b ）。用不同浓度（H2O2 (I)、0 μg/mL (II)、50 μg/mL (III)、100 μg/mL (IV)、200 μg/mL) 培养的细胞的 24 h 荧光成像检查(V) 和 500 μg/mL (VI)) 通过 ROS 方法 (c ）。 *P <0.05, ***P <0.001。比例尺为 100 μm

此外，LDH 测定还用于评估 AuNC@PEGs 的体外生物相容性。在正常细胞中，LDH是不允许通过细胞膜的。当细胞膜受损时，LDH通过细胞膜释放[ 31]。因此，我们通过用不同浓度的 AuNC@PEGs 处理细胞 24 h 来测量细胞上清液中的 LDH 含量（图 2b）来评估 AuNC@PEGs 的安全性。结果表明，当AuNC@PEGs浓度<200 μg/mL时，细胞释放的LDH水平较未暴露的对照细胞略有增加，且显着低于阳性对照组（H2O2）。与MTT检测结果一致，发现200 μg/mL的AuNC@PEGs为最佳浓度具有良好的细胞相容性。

此外，还进行了氧化应激测试和活/死细胞免疫荧光染色（Calcein-AM/PI）评估，以检测 AuNC@PEGs 的体外毒性。氧化应激对所有生命系统都是有害的，过量的活性氧 (ROS) 会导致氧化应激 [32, 33]。因此，我们测量了细胞中的 ROS 水平。不同浓度AuNC@PEGs诱导24 h后，50-200 μg/mL浓度诱导的细胞绿色荧光强度与对照组无显着差异，显着低于对照组。阳性对照组（图2c）。荧光强度与ROS水平成正比。如图3所示，浓度为0-200 μg/mL的HUVEC细胞存活率> 90%（图3a-f）。上述结果验证了浓度为200 μg/mL的AuNC@PEGs稳定且具有良好的细胞相容性，是很有前景的临床造影剂。

活染色和死染色的荧光显微镜图像。不同浓度 (0 μg/mL (a ), 10 μg/mL (b ), 20 μg/mL (c ), 50 μg/mL (d ), 100 μg/mL (e ), 200 μg/mL (f ), 500 μg/mL (g ) 和 1000 μg/mL (h )) 24 小时。绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞。比例尺为 100 μm

体外CT扫描成像及CT值测定

为了评估 AuNC@PEGs 在 CT 扫描成像中的可行性，我们比较了不同摩尔浓度 (AuNC@PEGs) 与临床使用对比剂（碘）的对比度增强。获得CT扫描图像，并测量CT值。将 AuNC@PEG 与类似浓度（50、100、200、500 和 1000 μg/mL）的碘显像剂进行了比较。结果表明，CT值随着浓度的增加而增强（图4a），根据AuNC@PEGs和碘造影剂的CT值分析（图4b），AuNC@PEGs的吸收系数为优于类似浓度的碘基造影剂，表明使用AuNC@PEGs进行CT扫描成像效果更好。

AuNC@PEGs 和碘基造影剂的体外计算机断层扫描结果的比较。随着浓度的增加，X射线衰减强度增加（a ）。 AuNC@PEGs 和碘基造影剂之间 Hu 值的比较 (b ）。 ***P <0.001

体内 CT 扫描成像

由于 AuNC@PEGs 的高对比度能力，我们进一步比较了 AuNC@PEGs 与碘剂在体内的成像质量。通过大鼠尾静脉注射 200 微升 AuNC@PEGs (200 μg/mL)。通过注射前（0 min）和注射后连续时间点扫描（10、20、30、40、60和90 min）评估AuNC@PEGs中血池血管造影的时间。然后，对照组大鼠注射适当浓度的碘造影剂。注射剂量和扫描时间与 AuNC@PEGs 相似。注射造影剂后，我们同时观察到肾脏的对比增强（图 5）和膀胱的充盈（SI 图 1）。结果表明，AuNC@PEGs组肾脏在30 min达到峰值，并在90 min时完全排泄；碘基造影剂组在20 min时达到峰值，并在60 min时完全排泄。然后，我们观察到膀胱随着时间的推移逐渐充满造影剂。这一发现表明，AuNC@PEGs 的血池血管造影时间优于碘基造影剂。 AuNC@PEGs较长的血液循环时间可以提供更好的诊断，AuNC@PEG具有更好的发展前景。

AuNC@PEGs注射后不同时间点大鼠体内CT图像

体内 AuNC@PEGs 的安全性

如图6a所示，血常规和肝肾功能分析的标准参数由血红蛋白水平、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞体积、血小板计数、红细胞计数、白细胞计数、白蛋白浓度、丙氨酸氨基转移酶水平、天冬氨酸氨基转移酶水平和肌酐水平。在统计分析中，AuNC@PEG、碘造影剂和对照组之间没有观察到显着差异（P> 0.05）。此外，对大鼠的器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行组织学分析，如图 6b 所示，注射 AuNC@PEGs（200 μg/mL）后 24 h；切片;和染色（H＆E）。与对照组（未注射纳米材料）相比，显微镜下未发现明显的形态变化和损伤。上述结果进一步证实了AuNC@PEGs在体内的安全性和可靠性。

AuNC@PEGs的体内毒性评价。血常规和肝肾功能：血红蛋白水平（I）、平均红细胞血红蛋白浓度（II）、平均红细胞体积（III）、血小板（IV）、红细胞计数（V）、白细胞计数（VI）、白蛋白浓度 (VII)、丙氨酸转氨酶水平 (VIII)、天冬氨酸转氨酶水平 (IX) 和肌酐水平 (X) (a ）。在正常大鼠和注射 AuNC@PEGs 的大鼠的器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中进行 H&E 染色 24 h (b ）。 b 的比例尺 是 100 μm

结论

我们开发了一种新型CT扫描造影剂AuNC@PEG，具有体积小、对比度高、血液滞留时间长、毒性风险低等特点。体外和体内毒性评估表明，AuNC@PEGs 具有良好的生物相容性和较低的副作用风险。体外和体内CT扫描的成像性能表明，与传统的碘基显像剂相比，AuNC@PEGs具有更高的X射线吸收系数和更长的血池血管造影时间。此外，AuNC@PEGs 优于碘基显像剂，使用 AuNC@PEGs 是实用的。所有这些结果表明，AuNC@PEGs 比传统碘基造影剂具有更高的 X 射线吸收系数，并且 AuNC@PEGs 的成像性能高于传统碘基造影剂。因此，本研究合成的功能化AuNC@PEGs在CT扫描成像中具有巨大的临床应用潜力。

数据和材料的可用性

目前无法共享重现这些发现所需的原始/处理过的数据，因为这些数据也是正在进行的研究和开发的一部分。

缩写

CT：

计算机断层扫描

DCF：

二氯荧光素

DCFH：

二氯荧光素

H2O2：

过氧化氢

LDH：

乳酸脱氢酶

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PEG：

聚乙二醇

ROS：

活性氧

TEM：

透射电子显微镜