高生物相容性金纳米笼@PEG纳米颗粒：一种用于增强体内成像的新型CT造影剂

摘要

近年来，造影剂已广泛应用于成像技术以提高图像质量。与传统分子级造影剂相比，纳米颗粒具有更好的体内检测能力。本研究合成了一种具有强X射线吸收系数的新型金纳米笼@PEG纳米颗粒（AuNC@PEGs），作为计算机断层扫描（CT）成像的造影剂。结果显示，AuNC@PEGs具有良好的水分散性、低细胞毒性和强X射线吸收能力。此外，体内研究表明，合成的AuNC@PEGs具有显著的造影增强效果、较长的血液循环时间和可忽略的体内毒性。因此，本研究合成的功能化AuNC@PEGs在CT扫描成像的临床应用方面具有巨大潜力。

引言

近年来，计算机断层扫描（CT）已成为临床环境中最常用的诊断成像技术，广泛应用于各种人体组织的研究。由于CT扫描具有强穿透力、高对比度和相对简单的图像处理特点，被认为是现代医疗系统中最强大的无创成像诊断技术[1, 2]。然而，在成像过程中，病变与某些周围结构之间缺乏天然对比度。因此，必须使用造影剂——一种具有相对较高或较低密度的物质——来区分目标结构、组织和器官。此外，这种物质在不同组织中具有不同的吸收能力，可通过X射线照射在软组织中观察到。分子和微粒造影剂在CT成像中的应用已有评估[3,4,5]。

目前，CT扫描最常用的造影剂是含碘的有机分子。碘化分子（如碘离子或非离子制剂）在临床上广泛用作CT扫描造影剂。虽然碘化分子能提供良好的CT造影增强，但它们具有肾清除率快、体内循环时间短和致敏性等特点，严重限制了进一步应用[6, 7]。由于碘造影剂快速清除，血池成像的有效时间窗口受到严重限制，难以获得高对比度图像。此外，大剂量药物的快速清除可能对肾脏产生潜在副作用[8, 9]。

过去十年间，纳米颗粒在生物医学特别是诊断成像领域的应用受到广泛关注[10]。与碘基造影剂相比，纳米颗粒具有小分子不具备的造影特性载荷，同时具有特定的尺寸、形状和表面[11, 12]。通常，大原子序数的纳米颗粒（如金、银等金属纳米颗粒）具有优异的X射线吸收系数，因此具有显著的造影增强能力[13, 14]。在这些纳米颗粒中，金纳米颗粒因其显著的生物惰性和易于合成及表面修饰，在生物医学领域快速发展，被视为碘基成像剂的替代品[15,16,17]。金纳米颗粒比碘化合物具有更长的血液循环时间、更低的肾毒性风险和更强的X射线吸收系数。因此，可降低给药剂量，副作用风险也较低[18]。包括纳米球、纳米棒和纳米星在内的多种金纳米颗粒已广泛用作CT扫描成像的造影剂[19, 20]，效果良好。在各种金纳米结构中，金纳米笼具有中空内部和薄多孔壁，因此比其他形态的金纳米颗粒具有更大的表面积和更有效的CT成像能力[21, 22]。近年来，金纳米笼已被用作光学相干断层扫描和光声断层扫描的造影增强剂，表现良好。同时，由于金纳米笼的大吸收面积，它们也是有效的光热转换器[23, 24]。据我们所知，仅有少数研究评估了金纳米笼作为CT扫描造影剂的应用。基于上述研究，我们进一步探索了金纳米笼作为CT扫描造影剂的应用。纳米颗粒在CT成像中的应用要求表面具有生物相容性和生物活性。聚乙二醇（PEG）是一种可生物降解和生物相容的聚合物，也是一种隐形材料，可防止被网状内皮系统（RES）捕获，改善生物相容性、肾脏清除能力和血液循环时间；因此，PEG化纳米颗粒可在血液中长期滞留[15, 25,26,27,28]。

本研究制备并表征了新型AuNC@PEGs。然后通过MTT比色法、乳酸脱氢酶（LDH）泄漏法、细胞内活性氧（ROS）浓度测定、Calcein-AM/PI染色等实验技术评估了AuNC@PEGs的体外生物相容性。此外，通过血液学和组织学分析确定了AuNC@PEGs的体内毒性。结果显示，AuNC@PEGs具有良好的体外和体内生物相容性。而且，AuNC@PEGs被发现具有更强的体外和体内CT成像能力。这些实验结果表明，合成的AuNC@PEGs具有造影强、血液循环时间长、肾毒性风险低等显著优势。因此，本研究合成的功能化AuNC@PEGs在CT扫描成像的临床应用方面具有巨大潜力。

材料与方法

所有实验方案（包括相关细节）均经中国辽宁省锦州医科大学区域伦理委员会批准。

材料与仪器

LDH和ROS检测试剂盒购自中国南京建工生物工程研究所，Calcein-AM/PI染色试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司。其他化学试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich。所有切片均使用荧光显微镜（DMI4000B，Leica，德国韦茨拉尔）评估。合成纳米颗粒的特性通过透射电子显微镜（TEM）评价。使用256排512层螺旋CT扫描仪（飞利浦，德国），成像参数如下：层厚0.625 mm；管电压100 kVp；管电流100 mA。

AuNC@PEGs的合成

根据前文[29, 30]，通过Ag纳米立方体与HAuCl₄溶液之间的简单置换反应制备金纳米笼。典型地，在二乙二醇中制备25 nm Ag纳米立方体，作为合成30 nm金纳米笼的模板。然后，将SH-PEG（分子量≈2000，10 mg溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS））加入AuNC溶液（pH 8.0，6.55 nM，6 mL）中，在氮气保护下避光过夜搅拌。将AuNC@PEGs再洗涤三次后，分散于水溶液中。

体外毒性评价

本研究采用MTT比色法、LDH泄漏法、细胞内ROS浓度测定和Calcein-AM/PI染色检测合成AuNC@PEGs的体外毒性。将HUVEC细胞以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板中。使用含10%胎牛血清和青霉素（100 μg/mL）及链霉素的RPMI-1640培养基。随后在37℃、5% CO₂培养箱中培养12 h。然后加入不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）AuNC@PEGs的培养基继续培养。24 h后进行MTT测定。每组以不含纳米颗粒的培养基作为对照。

随后，测定经不同浓度AuNC@PEGs处理的HUVEC细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）含量，以评估体外毒性。细胞接种方式同MTT实验，随后用不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）AuNC@PEGs处理24 h。然后分离上清液，离心并转移至干净的96孔板。根据制造商说明书测定培养基中LDH活性，使用酶标仪（450 nm）测定吸光度。

基于ROS试剂盒测量细胞内ROS浓度的原理，在2',7'-二氯荧光素（DCFH-DA）存在下，DCFH被氧化为二氯荧光素（DCF），这是一种强绿色荧光物质。将HUVEC细胞在24孔板中培养12 h，用不同浓度（50、100、200和500 μg/mL）AuNC@PEGs处理24 h，随后在37℃下用DCFH-DA孵育40 min。用过氧化氢（H₂O₂）处理的细胞作为阳性对照。使用荧光显微镜（λex, 485 nm；λem, 525 nm）观察细胞荧光强度。评估前用无血清和无冰的培养基洗涤三次。

对于活/死染色，将HUVEC细胞接种于24孔板培养12 h。然后用不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）AuNC@PEGs处理24 h。经胰蛋白酶-EDTA消化离心后，用PBS（pH=7.4）洗涤细胞；然后将制备的细胞悬液与预配的Calcein-AM/PI试剂混合，在37℃下培养15 min。通过荧光显微镜评估死细胞数量，以检测AuNC@PEGs的毒性。

动物模型

所有动物实验程序均按锦州医科大学动物保护与使用委员会制定的标准执行。实验结束后，按人道主义原则处死动物。本研究使用体重250-300 g的成年Sprague Dawley大鼠（购自锦州医科大学动物中心）。实验中所有动物随机分组。腹腔注射氯醛水合物溶液（10 wt%）麻醉，然后通过尾静脉注射所有材料。

体外与体内CT扫描成像

体外CT成像中，将不同浓度的AuNC@PEGs和碘溶液置于EP管中并按适当顺序排列，从前向后进行CT扫描。体内CT扫描中，麻醉后从头到尾扫描大鼠，以腹腔中心为标志。每次扫描动物位置不变。所有原始数据（0.625 mm图像）传输至飞利浦工作站通过CT扫描分析。

体内毒性评价

血液学分析采用标准大隐静脉采血技术。将大鼠的心、肝、脾、肺、肾组织用4%多聚甲醛固定48 h，脱水后包埋于石蜡中。石蜡切片厚5 μm，贴于玻片上。进行苏木精-伊红（H&E）染色，在显微镜下分析。

统计分析

数据采用单因素方差分析，以P值为指标。P值<0.05视为统计学显著，以平均值±标准差表示。

结果与讨论

AuNC@PEGs的合成与表征

表面功能化和尺寸控制是开发高性能纳米造影剂的两个关键因素[15]。通过TEM和DLS确定AuNC@PEGs的结构和特性。图1a显示AuNC@PEGs尺寸约40 nm，均一性高；同时，AuNC@PEGs的水化半径也用于测试其在溶液中的分散性，如图1b所示，水化半径约50 nm，表明AuNC@PEGs非常稳定，无聚集。AuNC@PEGs尺寸较小且具有较好的生物惰性，更适合纳米医学应用。此外，中空笼状结构意味着巨大的内外比表面积和更好的CT成像能力，周围的金属壁在加工、运输和储存过程中为载荷提供额外保护。凭借明显的核壳结构，外层覆盖生物适用性PEG，可有效增强生物相容性并逃避巨噬细胞捕获。

AuNC@PEGs的体外安全性与稳定性

在将AuNC@PEGs用于体内成像前，我们评估了其安全性与稳定性。通过MTT实验（图2a）检测AuNC@PEGs对HUVEC细胞活力的影响。用不同浓度（10、20、50、100、200、500和1000 μg/mL）AuNC@PEGs处理细胞24 h。MTT结果显示，当AuNC@PEGs浓度达到200 μg/mL时，细胞存活率与对照组相似，具有良好的生物相容性。即使在1000 μg/mL浓度下，细胞存活率仍>75%。

此外，LDH实验也用于评估AuNC@PEGs的体外生物相容性。正常细胞中LDH不能通过细胞膜。当细胞膜受损时，LDH会通过细胞膜释放[31]。因此，我们通过测量细胞上清液中LDH含量（图2b）来评估AuNC@PEGs的安全性，用不同浓度AuNC@PEGs处理细胞24 h。结果显示，当AuNC@PEGs浓度<200 μg/mL时，细胞释放的LDH水平比未暴露对照组略有增加，且显著低于阳性对照组（H₂O₂），这与MTT结果一致，发现200 μg/mL AuNC@PEGs为最佳浓度，具有良好的细胞相容性。

此外，还进行了氧化应激测试和活/死细胞免疫荧光染色（Calcein-AM/PI）以检测AuNC@PEGs的体外毒性。氧化应激是对所有生命系统有害的状态，过量的活性氧（ROS）可引起氧化应激[32, 33]。因此，我们测量了细胞中的ROS水平。经不同浓度AuNC@PEGs诱导24 h后，50-200 μg/mL浓度诱导的细胞绿色荧光强度与对照组无显著差异，且显著低于阳性对照组（图2c）。荧光强度与ROS水平成正比。如图3所示，0-200 μg/mL浓度下HUVEC细胞存活率>90%（图3a-f）。上述结果验证了200 μg/mL浓度的AuNC@PEGs稳定且具有良好的细胞相容性，可作为有前景的临床造影剂。

体外CT扫描成像与CT值测定

为评估AuNC@PEGs在CT成像中的可行性，我们比较了不同摩尔浓度AuNC@PEGs与临床用造影剂（碘）的造影增强效果。获取CT扫描图像并测量CT值。在相似浓度（50、100、200、500和1000 μg/mL）下将AuNC@PEGs与碘造影剂比较。结果显示，CT值随浓度增加而增强（图4a），根据AuNC@PEGs和碘造影剂CT值分析（图4b），在相似浓度下AuNC@PEGs的吸收系数优于碘基造影剂，表明AuNC@PEGs用于CT成像效果更好。

体内CT扫描成像

鉴于AuNC@PEGs的高造影能力，我们进一步比较了AuNC@PEGs与碘剂的体内成像质量。通过大鼠尾静脉注射200 μL AuNC@PEGs（200 μg/mL）。通过注射前（0 min）和注射后连续时间点扫描（10、20、30、40、60和90 min）评估AuNC@PEGs的血池造影时间。对照组大鼠注射适当浓度的碘造影剂，注射剂量和扫描时间与AuNC@PEGs相同。注射造影剂后，我们同时观察肾脏（图5）和膀胱（SI图1）的造影增强和充盈情况。结果显示，AuNC@PEGs组肾脏在30 min达到峰值，90 min完全排泄；碘造影剂组肾脏在20 min达到峰值，60 min完全排泄。随后观察到膀胱随时间逐渐被造影剂充盈。这一发现表明AuNC@PEGs的血池造影时间优于碘基造影剂。AuNC@PEGs较长的血液循环时间可提供更好的诊断，具有更好的发展前景。

AuNC@PEGs的体内安全性

如图6a所示，常规血液和肝肾功能的标准参数通过血红蛋白水平、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞体积、血小板计数、红细胞计数、白细胞计数、白蛋白浓度、丙氨酸氨基转移酶水平、天冬氨酸氨基转移酶水平和肌酐水平反映。统计分析显示，AuNC@PEG组、碘造影剂组和对照组之间无显著差异（P>0.05）。此外，大鼠器官（心、肝、脾、肺、肾）经组织学分析，如图6b所示，注射AuNC@PEGs（200 μg/mL）24 h后取材切片并进行H&E染色。与对照组（未注射纳米材料）相比，显微镜下未发现明显的形态学改变和损伤。上述结果进一步证实了AuNC@PEGs在体内的安全性和可靠性。

结论

我们开发了一种新型CT扫描造影剂AuNC@PEG，具有尺寸小、造影强、血液滞留时间长、毒性风险低等特点。体外和体内毒性评价显示AuNC@PEGs具有良好的生物相容性和低副作用风险。体外和体内CT成像性能显示，AuNC@PEGs的X射线吸收系数更高，血池造影时间比传统碘基造影剂更长。此外，AuNC@PEGs优于碘基造影剂，应用实用性强。所有结果表明，AuNC@PEGs的X射线吸收系数高于传统碘基造影剂，成像性能优于传统碘基造影剂。因此，本研究合成的功能化AuNC@PEGs在CT扫描成像的临床应用方面具有巨大潜力。

数据与材料可用性

由于数据也是正在进行的研究和开发的一部分，目前无法共享复制这些发现所需的原始/处理数据。

缩略语

CT：

计算机断层扫描

DCF：

二氯荧光素

DCFH：

二氯荧光素

H₂O₂：

过氧化氢

LDH：

乳酸脱氢酶

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

PBS：

磷酸盐缓冲液

PEG：

聚乙二醇

ROS：

活性氧

TEM：

透射电子显微镜