使用载有甲氨蝶呤的叶酸共轭 Au@SiO2 纳米粒子的新型化学光热疗法治疗乳腺癌

介绍

乳腺癌 (BC) 作为最常见的女性癌症，最近在全球报告了 170 万新病例 [1]。由于其病因复杂且对治疗反应不佳，通常被认为是普遍导致女性癌症相关死亡的主要原因 [2,3,4,5]。 2014 年，美国约有 40,000 名女性死于 BC [2, 6, 7] “(www.cancer.org)”。总死亡人数为 522,000 人，是第五位癌症死亡原因，欠发达地区约有 800,000 例，发达地区的发病率大致相同 [1]。在亚洲国家，最大的开始年龄是 40 或 50 岁，而西方国家则为 60-70 岁[8]。 BC 的主要危险因素是女性、家族史、年龄和不同的生育倾向，如 30 岁以上首次生育、初潮早绝经晚、未生育[9]。

与癌症作斗争的主要目标是制定低毒性和高特异性的有效治疗计划，以消除肿瘤，主要是其转移，并进一步预防其复发。但目前使用的癌症治疗方法，如手术、化疗和放疗等，都出现了各种副作用[10,11,12]，均未能达到这一目的[13, 14]

在过去的几十年里，我们观察到了癌症治疗方面的重大斗争 [15, 16]。在当前流行的治疗方法中，热疗法已发展成为一种前瞻性治疗方法 [17]。最近，光热疗法（PTT）作为一种潜在有效的非侵入性癌症疗法，引起了极大的关注[18, 19]。基于光吸收纳米结构的 PTT 已成为一种不同于一般方法的方法 [20, 21]。在典型的 PTT 中，使用 PTT 剂通过在激光照射（700-1100 nm 范围内的近红外 (NIR) 光）下获得足够的高温（42°C）来破坏肿瘤，已被研究为一种非常精确和微创的癌症治疗方法 [22,23,24,25,26,27,28].

许多纳米粒子已被广泛研究为成像造影剂、药物输送载体和能量模式（如激光、无线电波和超声波）的变压器，以及产生治疗效果的热现象 [29,30,31,32,33 ,34,35,36,37,38,39]。

在过去的十年中，金纳米粒子因其高局域表面等离子体共振 (LSPR) 和容易与生物分子的表面共轭而引起了极大的关注 [40]。他们在近红外区域显示出高性能的光热转换能力[41,42,43]，对生物系统没有有害的副作用[44]。

虽然金纳米粒子已被公认为一种很有前途的光合作用剂，但由于其在重复近红外辐射下的光热稳定性较差，金纳米粒子逐渐失去其光热转换能力，限制了其在临床实践中的应用。此外，金纳米颗粒也不是很好的药物载体，因为它们的载药能力和药物释放可控性较差 [45, 46]。或者，介孔二氧化硅纳米颗粒 (MSN) 被认为是合适的药物、DNA 和蛋白质载体，因为它具有更高的载药能力并且没有降解产生的毒性成分。它们还具有大的表面积、可控的尺寸、高可用的孔体积和所需的表面特征，可申请改性[47]。

与化疗药物和癌症靶向配体结合后的纳米颗粒可以抑制常规化疗的缺点，如非特异性递送、水溶性差和治疗指数低[48, 49]。

显示化疗特性的药物，如阿霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶和多西紫杉醇，可单独使用或联合使用作为主要的核心治疗，或辅助其他治疗，如 PTT。大多数癌症患者由于化疗药物在患者体内的不精确分布影响所有器官而遭受化疗药物的不良反应。这些药物会伤害一些快速生长的正常细胞，例如血细胞、覆盖内脏的粘膜细胞和毛囊[50,51,52,53]。

甲氨蝶呤 (MTX) 一直是治疗类风湿性关节炎和皮肤、肺、头颈部和乳腺等多种类型肿瘤最常用的药物 [54, 55]。它抑制二氢叶酸还原酶 (DHFR)，这种酶有助于产生四氢叶酸及其副产物，这些副产物是胸苷酸和嘌呤合成所必需的，两者对细胞生长和细胞增殖都至关重要。因此，阻断DHFR甲氨蝶呤会阻止4种基本大分子DNA、RNA、胸苷酸和蛋白质的合成[56]。

不幸的是，与大多数传统 PTT 药物一样，主要挑战是在全身注射后在目标组织中实现 GNP 的选择性积累 [57,58,59]。靶向癌症治疗允许将化疗药物递送至特定癌细胞，同时减少正常健康细胞的暴露。这使我们能够以更低的全身毒性向癌细胞输送更大剂量的药物。配体靶向纳米粒子是精确识别的癌细胞标志物，在癌细胞表面高度表达[40]。

叶酸（叶酸或维生素 B9）是细胞生长和代谢的关键物质。由于叶酸对叶酸受体蛋白的亲和力很大，因此它被用作癌症靶向的元素。叶酸受体作为肿瘤生物标志物，在确定的恶性细胞中过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、脑癌和结肠癌 [60]。叶酸偶联药物递送系统通过内吞作用增强细胞对药物的摄取[61]。

材料和方法

试剂和材料

我们在实验中使用了双蒸水（Ghazi Company，Tabriz，Iran）和分析级化学试剂。多种试剂购自Sigma-Aldrich公司，包括：原硅酸四乙酯（TEOS，98%）、（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPTES，纯度95%）、叶酸和罗丹明B。一组材料购自默克Co：盐酸（HCl，37%）、氨溶液（25%）、甲苯氢氧化钠（NaOH，98%）和其他溶剂。 MTX购自伊朗大不里士的Zahravi Farma Company。

仪器

在这项研究中，为了分析粒径和形态，采用透射电子显微镜 (TEM) (LEO 906，德国)。我们在室温下制备了大约 100μL 的纳米颗粒悬浮在水溶液中。将溶液转移到涂覆在 TEM 铜网格上的碳膜上，随后冷冻干燥并在 80KV 下观察。使用英国马尔文马尔文仪器公司的 Zetasizer Nano ZS90，在 25 °C 下通过 DLS（动态光散射）测量来确定粒径。通过光子相关光谱（Zetasizer-ZS，Malvern Instrument，UK）对制备的 NP 进行 Zeta 电位测量。双光束紫外-可见分光光度计（UV-1601 PC 型号 SHIMADZU，Kyoto，Japan）用于通过具有 10 毫米路径长度的 700μL 石英比色皿测量吸光度。来自德国布鲁克 Tensor 27 光谱仪的傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱用于 KBr 压片法的执行。 pH 测量使用万通 713 pH 计（瑞士赫里绍）进行。机械搅拌器 Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Germany) 用于搅拌。使用 HPLC 系统计算 FA 和 MTX 的包封效率，该系统由配备 UV-vis 检测器的 Waters 2690 分离模块和 Waters 2500 Pump 1000 检测器（Waters, Milford, MA）组成。使用 C18 m Bondapak (250 mm 4.6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Ireland) 色谱柱在室温下进行色谱分离。

Au@SiO2 纳米颗粒的制备

SiO2 NPs 是基于先前报道的溶胶-凝胶法合成的 [62, 63]。在下一步中，根据我们之前的研究[64]中提到的方法制备了硫醇官能化的二氧化硅包覆纳米粒子（TFSNP）。 Au纳米颗粒是通过柠檬酸盐还原法（Turkevich法）生产的[65]。最后，TFSNPs 的表面被 AuNPs 覆盖。起初，TFSNPs 在浴缸超声仪的帮助下分散在水中至少一小时，然后加入 AuNPs 溶液中，然后再超声 30 分钟。反应在黑暗条件下在 25°C 动态搅拌下进行两天。通过离心（10000 rpm，10 min）收集外观呈紫色的Au@SiO2纳米颗粒，并在真空烘箱中干燥。

MTX 和 FA 加载

MTX 和 FA 按如下方式加载到 Au@SiO2 纳米载体中：将 MTX（10 毫克）加入到 10 毫升纳米载体在 PBS（5 毫克/毫升，pH 7.4）中的分散良好的悬浮液中，并在室温下适度搅拌在黑暗条件下一天。通过离心收集负载 MTX 的 Au@SiO2 纳米载体。收集上清液用于测定卸载的 MTX。然后将负载 MTX 的 Au@SiO2 纳米载体分散在 PBS（5 毫克/毫升，pH 7.4）中，将 FA（10 毫克）加入溶液中，并在室温下在黑暗条件下适度搅拌另一天。通过离心收集负载 FA-MTX 的 Au@SiO2 纳米载体，并在最后一步分离上清液用于计算未结合的 FA。 FA-MTX 负载的 Au@SiO2 纳米载体被冷冻干燥并储存用于下一个实验。未结合的 MTX 和 FA 的量是使用 HPLC 方法根据之前报道的方案计算的 [66]。将叶酸溶解在氢氧化铵 (10 wt%) 中并用流动相稀释。 MTX 和叶酸的保留时间分别为 10.5 和 5.95 分钟。应用一式三份样品。载药效率（DLE）由下式计算：

细胞系选择和培养

从巴斯德细胞库（伊朗德黑兰）选择并购买了两种具有报告的表面表达水平的叶酸受体（FR）[67] 的乳腺癌细胞系，包括 MCF-7 和 MDA-MB-231，用于细胞毒性研究。所选细胞系在含有 RPMI1640（Thermoscientific）、10% 胎牛血清（FBS）和 1% Penstrep（Thermoscientific）的完全培养基中在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度的热和大气条件下生长。

细胞毒性试验

在没有激光照射的不同 NPs 处理后, 进行细胞活力测定以测量细胞增殖。简而言之：将MCF-7或MDA-MB-231细胞接种于96个微孔板中，细胞密度为1.5×10 ⁴ 24 小时，然后用 MTX、Au@SiO2 和 FA-MTX 负载的 Au@SiO2 NPs 处理细胞。未经处理的细胞被视为对照。在下一步中，将终浓度为 5 μg/ml 的四唑鎓染料 MTT（Sigma）加入细胞中，并在 37°C 下孵育 4 小时。然后，除去 MTT 溶液，将沉淀的 Furmazan 晶体溶解在二甲基亚砜（DMSO）（BioIdea，伊朗）中，轻轻摇动 10 分钟。最后，通过 ELISA 读数器在 570 nm 处测量吸光度。将细胞活力标准化为对照细胞，并通过减去空白测量值去除背景。

体外激光治疗

对于低强度激光治疗 (LLLT)，810 nm 波长 NIR 激光（二极管激光 Mustang 2000，俄罗斯）具有 185 mW 输出功率剂量用于破坏癌细胞。起初MCF-7和MDA-MB 231细胞，细胞密度为1.5×10 ⁴ 用 Au@SiO2 和 FA-MTX 负载的 Au@SiO2 NPs 处理，然后暴露于不同激光剂量（30、60、75、90 和 105 J/cm ² ) 和固定曝光时间（139 秒）。仅暴露于激光照射（无 NPs）的细胞和没有任何 NPs 和激光处理的细胞分别被视为阳性和阴性对照。激光照射24 h后用MTT法测定细胞活力[64]。

纳米颗粒细胞摄取分析

NPs 细胞内化的详细检查对于确认表面改性纳米载体对每个细胞系的具体影响至关重要。在目前的工作中，我们使用流式细胞术作为定量和荧光显微镜来定性检查 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞系对 NPs 的吸收。

对于 NPs 的悬浮液，加入 PBS 中的罗丹明 B (RhoD) 溶液，同时在环境温度和暗室（防止漂白）下搅拌 24 小时。然后，加载了 RhoD 的 NP 通过 Amicon 过滤器分离，标称分子量限制 (NMWL) 为 30 kDa，并在 5000 rpm 下离心 15 分钟，并用 PBS 缓冲液洗涤以消除未结合的 RhoD。将细胞以5×10 ⁵ 的密度接种于平板上 每口井，让达到汇合。细胞用负载罗丹明 B 的 NPs 处理 30、90 和 180 分钟，未处理的细胞用作对照。然后，将细胞用胰蛋白酶消化并用 PBS 洗涤，然后用流式细胞术分析（BD Biosciences FCASCalibur 流式细胞仪；BD Biosciences, San Jose, CA, USA）定量荧光。荧光显微镜进一步证实了罗丹明 B 标记的 NP 或 NPD 的细胞内摄取。 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞在盖玻片上生长，24 小时后用游离的 Au@SiO2 NPs 和负载 MTX-FA 的 Au@SiO2 NPs 处理细胞。孵育30、90和180分钟后，用PBS洗涤细胞，并使用荧光显微镜（Olympus显微镜Bh2-FCA，日本）观察罗丹明B标记的纳米载体的摄取。

荧光显微镜下的细胞凋亡研究

细胞凋亡核定性研究的一种方法是荧光染料 DAPI，它与 DNA 结合并可通过适当的显微镜检测。我们使用了先前报道的 DAPI 染色方案 [68]，不久：MCF-7 或 MDA-MB-231 细胞以 5 ×10 ⁵ 的密度接种在 6 孔格式的容器中 并让它们附着并生长 24 小时。用MTX、Au@SiO2 NPs和MTX-FA负载的Au@SiO2 NPs处理后，用和不用激光处理，用PBS（Sigma）洗涤细胞，然后用10%甲醛（Merck）固定，下一步：细胞透化用 Triton X-100 (Sigma) 15 分钟。适当洗涤后，细胞用 DAPI (sigma) 染色 5 分钟。最后，通过荧光显微镜（Olympus）观察凋亡细胞核（碎裂或起皱）。未经处理的细胞为阴性对照，仅接受激光照射的细胞为阳性对照。

细胞周期紊乱的调查

MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞周期分布通过流式细胞术分析确定。以这种方式，细胞以 5 × 10 ⁵ 的起始群体接种 并允许达到80%汇合。随后，进行了用 MTX、Au@SiO2 NPs 和负载 MTX-FA 的 Au@SiO2 NPs 处理的细胞，有和没有激光照射。未经任何处理的细胞被视为阴性对照，仅接受激光照射的细胞作为阳性对照。然后，在适当的 PBS 洗涤后通过胰蛋白酶消化收获细胞。接下来，将细胞用乙醇（默克）固定 48 小时。在下一步中，洗涤固定的细胞，然后用核糖核酸酶 A (Cinaclone) 处理，随后在黑暗中加入碘化丙啶 (PI) (Sigma)。荧光信号由Beckton Dicinson公司的FACS装置检测。

研究统计

每个步骤的实验都进行了三次重复，结果报告为平均值±SD。方差分析用于比较组间的显着性。 SPSS软件计算概率值<0.05时，差异反映显着性。

结果与讨论

合成 NP 的表征

Au@SiO2 NPs 的制备分为四个步骤：1-SiO2 纳米颗粒的合成，2-将含硫醇的连接基添加到 SiO2 NPs，3-金纳米颗粒的合成，以及 4-将金纳米颗粒连接到 SiO2-连接基的表面复合物（图 1）。 FTIR 证实了 Au@SiO2 的成功合成（图 2a）。 Si-O-Si 峰出现在 1088 cm ^-1 . 3000–3700 和 803 cm ^–1 处的宽峰 分别归因于游离硅烷醇 O-H 基团的拉伸和平面外弯曲。脂肪族C-H伸缩振动在2950 cm ^-1 处表现为强峰 .三个甲氧基硅烷基团的 C–O 在 1191 cm ^–1 .

叶酸和甲氨蝶呤负载生物相容性Au@SiO2纳米颗粒的逐步合成方案

一 ) Au@SiO2 纳米粒子的 FTIR 光谱，b ) 通过动态光散射 (DLS) 测量的 FA-MTX 共轭 Au@SiO2 NPs 的尺寸分布 c ) 动态光散射 (DLS) 在 pH=7.4 和 T=25 °C 下测量的 Au@SiO2 和 FA-MTX 共轭 Au@SiO2 NPs 的 zeta 电位，d ) HPLC 法同时测定未负载 MTX 和 FA 与 FA-MTX 共轭 Au@SiO2 NP 分离的色谱图

动态光散射（DLS）测量表明，FA-MTX共轭的Au@SiO2纳米颗粒尺寸在纳米范围内（105±2.3 nm），尺寸分布较窄（图2b）。

Zeta 电位是影响纳米悬浮液稳定性的重要物理化学参数。极正或极负的 zeta 电位值会导致更大的排斥力。另一方面，粒子的高电荷，无论是正电荷还是负电荷，都会导致 NPs 被肝脏的吞噬细胞吸收并排出体外。在结合静电和空间稳定的情况下，± 20 mV 的最小 zeta 电位是可取的 [69,70,71]。在pH =7.4和T =25°C下，在加载MTX-FA之前和之后比较NP的zeta电位数据（图2c）。获得的Au@SiO2 NPs的zeta电位为+13.3 mV，在双载药后降低至-19.7 mV，处于理想范围内。由于其结构中两个羧酸基团的去质子化，MTX 和 FA 在高于其 pka（3.8 和 4.8、3.5 和 4.3）的 pH（7.4）下具有负净电荷（[72]，https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.）。因此，MTX和FA同时负载在Au@SiO2 NPs上后，净电荷变为负。

TEM 分析提供了确定的单个颗粒尺寸。金纳米颗粒被视为分散在 SiO2 NPs 上的黑色球体，作为灰色床层。 TEM图像证实Au@SiO2纳米颗粒具有均匀的球形，平均粒径约为25nm（图3）。

Au@SiO2纳米颗粒的TEM图

载药

在此，叶酸介导某些类型的癌细胞中 GNP 的摄取增加，这些癌细胞通过受体介导的内吞作用过度表达叶酸受体，以克服 GNP 内化的低效率，因此叶酸受体被称为肿瘤标志物，叶酸越来越多地用于肿瘤定位 [67, 73]。

MTX 和 FA 分子共轭成 Au@SiO2 NPs 后，zeta 电位从 +13.3 变为 -19.7 mV。 MTX 的两个羧酸部分的估计 pKa 值为 3.8、4.8，FA 为 3.5 和 4.3 [72]，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov。因此，由于 MTX 和 FA 的两个羧酸基团在高于 pka 的 pH 值 7.4 下去质子化，净电荷变为负，表明 MTX 和 FA 在 Au@SiO2 NPs 上成功共轭。 De Ying Tian 等人表明，18 和 30 毫米直径的金纳米粒子上的 MTX 负载分别为 15 ± 0.4% 和 10 ±1.0% [74]。在本研究中，FA 和 MTX 负载在 Au@SiO2 NPs 中，封装效率分别为 22.6% 和 77.5%。同时MTX和FA评估峰的色谱图见图2d。

细胞摄取

由于细胞内光热剂可以提高光热癌症治疗的效率[75]，人们认为光热材料的细胞内化是必要的。 体外 细胞摄取测试是使用人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞进行的，已知高度过度表达叶酸受体 [40]。为了研究 FA 作为靶向剂的作用以及表面涂层对靶细胞吸收 Au@SiO2 NPs 的效率，用 Au@SiO2 NPs 和 MTX-处理 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞FA 负载 Au@SiO2 NPs。细胞摄取的平均荧光强度结果如图 4 所示。 结果表明，所有样品在 MCF-7 和 MDA-MB-231 中的 Au@SiO2 NPs 摄取随着细胞培养时间的推移而增加（图 4 和 5 ）。此外，在用 MTX 和 FA 对 Au@SiO2 NPs 进行表面修饰后，MCF-7 和 MDA-MB-231 作为叶酸受体表达细胞的细胞摄取显着增加。 MTX-FA 负载的 Au@SiO2 NPs 吸收到 MDA-MB-231 细胞中大于 MCF-7。因为 MDA-MB-231 细胞表达更高水平的表面叶酸受体，所以大部分叶酸受体靶向 NPs 通过受体介导的内吞机制进入，导致更高的细胞摄取。在另一项研究中，叶酸偶联 NP 的细胞内化增加仅发生在过度表达 aHFR 的癌细胞中，而不发生在细胞表面表达较少 aHFR 的健康细胞中 [40]。 Au@SiO2 NPs与FA的结合可以促进NPs和甲氨蝶呤的细胞摄取，从而增强对MDA-MB-231细胞的毒性[76]。

罗丹明 B 标记的 Au@SiO2 纳米粒子 (NP) 或罗丹明 B 标记的 MTX-FA 负载 Au@SiO2 纳米粒子 (NPD) 在 MCF-7 (a ) 和 MDA-MB-231(b ) 通过流式细胞术获得的暴露时间为 0.5 小时、1.5 小时和 3 小时的细胞系。两种细胞系的未处理细胞均用作阴性对照。 c 流式细胞术获得的罗丹明 B 标记的 Au@SiO2 纳米粒子 (NP) 或罗丹明 B 标记的 MTX-FA 负载 Au@SiO2 纳米粒子 (NPD) 暴露时间为 0.5 小时、1.5 小时和 3 小时的平均荧光强度比较 <图片>

A 在 MCF7 中使用罗丹明 B 标记的 Au@SiO2 纳米粒子 (NP) 进行定性细胞摄取测定，暴露时间为 30 (a ), 90 (b ) 和 180 (c ) min 或罗丹明 B 标记的 MTX-FA 负载 Au@SiO2 纳米粒子 (NPD)，暴露时间为 30 (d ), 90 (e ) 和 180 (f ) 分钟和 (B ) 在 MDA-MB-231 中使用罗丹明 B 标记的 Au@SiO2 纳米粒子 (NP) 进行定性细胞摄取测定，暴露时间为 30 (a ), 90 (b ) 和 180 (c ) min 或罗丹明 B 标记的 MTX-FA 负载 Au@SiO2 纳米粒子 (NPD)，暴露时间为 30 (d ), 90 (e ) 和 180 (f ) min 荧光显微镜捕获

细胞毒性试验

游离 MTX、空白 Au@SiO2 NPs 和 MTX-FA 偶联的 Au@SiO2 NPs 的体外细胞毒性研究通过 MTT 测定进行了 24、48 和 72 小时的评估（图 6）。 MTT 分析结果表明，Au@SiO2 NPs 对 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞系没有细胞毒作用。此外，为了比较游离 MTX 和 MTX-FA 偶联的 Au@SiO2 NPs 的细胞毒性作用，所有处理时间都使用相同浓度的 MTX（25、50、100 和 200μg/mL）。细胞毒性结果表明，游离 MTX 或 MTX-FA 共轭的 Au@SiO2 NPs 在处理 24 小时后在两种细胞系中均显示出约 10-25% 的死亡率。先前的研究报告了金纳米粒子在体外条件下对不同细胞系如鼠成骨细胞 MC3T3-E1 细胞和人牙周膜干细胞的增殖作用。我们的结果与这些研究一致，图 6a 和 b 显示了游离 Au@SiO2 NPs 的增殖作用。因此，MTX 和 FA-MTX 负载的 Au@SiO2 纳米粒子 (NPD) 具有相同的细胞毒作用可能是由于这种现象 [77, 78]。

一 MCF-7 和 (b ) 不同浓度NP、MTX和FA-MTX负载Au@SiO2纳米颗粒(NPD)处理后MDA-MB-231细胞的生长抑制率分别为24、48和72h

激光照射

在这项研究中，在剂量范围为 30-105 J/cm ^{2 的激光照射后，用 Au@SiO2 NPs 和 MTX-FA 处理的 MCF-7 和 MDA-MB 231 细胞的细胞活力} 通过 MTT 分析进行了研究。负载MTX-FA的Au@SiO2 NPs（MTX浓度为100 μg/mL）处理MCF-7和MDA-MB-231细胞在LLLT剂量为75 J/cm ^{2后的死亡率上> 分别约为 39% 和 45.5%。而在相同条件下，经过激光照射或单独激光照射后，用 Au@SiO2 NPs 处理的细胞没有表现出明显的细胞死亡。同样通过将激光剂量增加到 105 J/cm 2 两种细胞系的死亡率均增加到 60-75%，而用 Au@SiO2 NPs + 激光或单独激光在相同照射剂量下处理的两种细胞系均未显示出细胞毒性作用。在 90 和 75 J/cm 的剂量下获得了 MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞在与负载 MTX-FA 的 Au@SiO2 NPs（MTX 剂量为 100 μg/mL）和 LLLT 联合治疗后的 IC50 值 2 ， 分别。另一方面，在没有激光照射的情况下，MTX 和 MTX-FA 负载的 Au@SiO2NP 在 100 μg/mL 的 MTX 剂量（激光治疗研究的选定剂量）中的死亡率在两种细胞系中都在 15-25% 之间。这些结果表明，负载 MTX-FA 的 Au@SiO2NPs 和激光治疗的组合在两种细胞系中均显示出协同作用，并显着降低细胞活力（p <0.001) 与仅接受激光照射的细胞相比。这些结果表明NPs治疗，特别是靶向策略可以提高激光治疗对乳腺癌细胞破坏的疗效（图7）。}

不同激光功率（30、60、75、90和105 J/cm ² ）对细胞生长抑制率的比较 ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO2 NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO2 NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO2 NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO2 NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm ² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO2 NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO2 NPs and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs either in combination with LLLT (75 J/cm ² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm ² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cells. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO2 nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm ² ) and Au@SiO2 nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO2 nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Conclusions

In this study MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO2 NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO2 nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.

数据和材料的可用性

Not applicable

缩写

Au@SiO2:

Silica coated gold

BC:

Breast cancer

DHFR:

Dihydrofolate reductase

DMSO:

Dimethyl Sulfoxide

FA：

Folate

LLLT:

Low level laser therapy

LSPR：

局域表面等离子体共振

MSN:

Mesoporous silica nanoparticle

MTX:

Methotrexate

NIR:

Near-infrared

NP：

纳米粒子

PTT：

光热疗法

RhoD:

rhodamine B

TFSNPs:

Thiol-functionalized silica-coated nanoparticles