正电荷磁性纳米颗粒超低浓度快速捕获大肠杆菌

摘要

快速、无需培养的细菌检测对及时疫情控制至关重要。正电荷磁性纳米颗粒（NP⁺）利用细菌细胞天然负表面电荷，在1小时内高效捕获低至10和100 CFU/mL浓度的大肠杆菌。菌落形成单位（CFU）计数确定捕获效率超90%。透射电镜（TEM）和光学成像证实NP⁺与细菌表面稳健结合，而负电荷颗粒（NP⁻）显示可忽略亲和力。结果表明静电吸引可提供无配体依赖、广谱细菌捕获平台。

背景

传染病仍是全球卫生首要任务，水源细菌污染构成重大风险。大肠杆菌作为常见革兰氏阴性病原体，常在受污染水和食品中以低水平出现，检测困难。传统培养法耗时、可能漏检可培养非存活（VBNC）细胞、延误关键干预。快速磁分离技术提供快速、可规模化、可自动化的细菌去除和检测方案。然而多数磁性系统依赖特异性配体，限制捕获广度且需大量优化。

细菌细胞内在负表面电荷最早由Bechhold于1904年记录，支撑其与正电荷纳米材料的静电相互作用。近期工作（Cohen等，2011）显示单个大肠杆菌细胞呈电脉冲，强化膜电位在细胞-表面相互作用中作用。利用此特性，我们设计聚乙烯亚胺（PEI）功能化磁性纳米颗粒，无配体依赖跨宽浓度范围捕获细菌。

材料与方法

纳米材料

试剂购自上海试剂公司和Sigma-Aldrich（美国）。所有溶液用Milli-Q去离子水（18.2 MΩ·cm）制备。支链PEI（Mw=10,000，99%）购自Alfa Aesar。

NPs合成

Fe₃O₄核经溶剂热法200°C、12 h合成。四乙氧基硅烷（TEOS）水解形成二氧化硅壳，后接枝APTES-TRITC复合物赋予荧光。保留APTES表面得负电荷纳米颗粒（NP⁻）；用PEI包覆NP⁻得正电荷颗粒（NP⁺），提供丰富表面胺基。

NPs表征

TEM（300 kV）确认核壳形貌和~450 nm直径。动态光散射（DLS）测流体动力学直径：NP⁺ 620 nm，NP⁻ 700 nm。Zeta电位分析显示中性缓冲液中NP⁻为-26.6 mV，NP⁺为+28.1 mV，指示稳定分散适合细菌捕获。

细菌制备

大肠杆菌BL21菌株LB培养基37°C、200 rpm培养16 h。系列稀释涂板得CFU计数。细胞离心收集，PBS洗涤，重悬至~1×10³ CFU/mL。所有操作符合生物安全二级规程。

细菌捕获实验

1 mL PBS悬液中混入40 µg NP⁺或NP⁻与细菌，室温孵育10 min。永久磁铁吸引NP-结合细胞至管壁，洗去未结合细胞。移除磁铁释放捕获细菌重悬供后续分析。

不同浓度NPs捕获细菌效率

涂板计数CFU量化捕获效率。实验范围5-100 µg/mL NP⁺或NP⁻，细菌负载2×10² CFU/mL。

NPs超低浓度捕获细菌能力

评估超低水平性能：40 µg NP⁺或NP⁻与含10或100 CFU/mL大肠杆菌的1 mL PBS孵育。CFU计数再次确定捕获效率。

统计分析

数据以均值±SD表示。双因素方差分析配合事后检验（GraphPad Prism）判定显著性p<0.05。

结果

磁性NPs表征

图1示意NP⁻和NP⁺逐步制造。TEM图像确认~450 nm Fe₃O₄核周围均匀~60 nm SiO₂包覆。DLS显示窄尺寸分布；Zeta电位数据确认表面功能化成功（图2）。

纳米颗粒设计示意图。展示表面带电、荧光、超顺磁复合纳米颗粒设计的示意图。

纳米颗粒表征。a NP⁺和NP⁻透射电镜图像。b DLS尺寸分布。c Zeta电位分布。

磁性NPs捕获大肠杆菌能力

图3概述捕获工作流：NP-细菌孵育、磁吸引、洗涤、释放。NP⁺快速富集大肠杆菌，NP⁻显示可忽略结合（图3）。

细菌捕获程序示意。大肠杆菌悬液分别与NP⁺和NP⁻混合，10 min孵育后磁铁吸引"磁化"细菌至瓶壁，洗涤计数。

光学成像（图4）显示NP⁻单分散，NP⁺聚集，反映不同相互作用模式。荧光显微镜确认TRITC标记NP⁺与DAPI染色大肠杆菌共定位（图5a）。TEM显示NP⁺大量聚集于细菌细胞壁（图5b），凸显强静电亲和力。

NP⁺和NP⁻捕获大肠杆菌能力对比。左：相衬显微镜下结合NP⁺的细菌。右：仅NPs对照。

大肠杆菌与NP⁺结合的荧光和透射电镜图像。a 荧光：DAPI（蓝）+TRITC（红）。b 透射电镜：NP⁺聚集于细菌表面。

超低浓度大肠杆菌检测

NP⁺剂量从5增至100 µg/mL产生剂量依赖捕获效率（图6）。40 µg/mL时NP⁺达81%效率（p<0.001），NP⁻即使100 µg/mL仅捕获12%。

不同浓度NP⁺或NP⁻捕获大肠杆菌效率。左：LB-琼脂平板。右：效率图。

超低负载（10和100 CFU/mL）下，NP⁺持续回收>90%细胞（图7），NP⁻回收<4%。结果验证NP⁺优越静电捕获能力。

超低浓度下NP⁺或NP⁻捕获大肠杆菌效率。左：琼脂平板。右：效率图。

讨论

革兰氏阴性和阳性细菌均对正电荷表面显示强静电吸引。PEI功能化NP⁺提供丰富胺基，产生+28.1 mV表面电荷，促进即使<10² CFU/mL下快速结合。本研究展示简单一小时方案在10 CFU/mL捕获大肠杆菌——远低于常规富集法检测限。

电荷依赖捕获效率明显：NP⁺在40 µg/mL达81%效率，NP⁻持续无效。TEM图像确认大量NP⁺聚集于细菌表面，提示尺寸和表面电荷协同增强捕获。

虽然革兰氏阳性和阴性细胞结构不同，但两者在生理pH下因脂多糖或磁壁酸均保持净负表面电荷。较大NP⁺（>600 nm）提供"海绵效应"——更大表面积促进更广泛静电相互作用，而较小颗粒可能受限于表面覆盖减少。因此设计优先捕获效率而非抗菌活性。

结论

PEI包覆磁性纳米颗粒提供快速、无配体依赖方法捕获分析超低浓度大肠杆菌。该法1小时内实现高回收（>90%），捕获细菌可经光学和TEM成像直观观察。平台适用于广泛细菌病原体，助力临床和环境场景快速诊断和净化。