创新甲氨蝶呤-叶酸纳米颗粒疗法结合激光辅助光热法增强乳腺癌治疗

摘要

低水平激光治疗（LLLT）被认为是靶向肿瘤组织/细胞的安全光疗法。此外，靶向纳米颗粒可提高癌症治疗成功率。本研究旨在探讨叶酸（FA）/甲氨蝶呤（MTX）负载的二氧化硅包覆金（Au@SiO₂）纳米颗粒（NPs）与LLLT联合对抗乳腺癌的效果。

NPs经FTIR、TEM和DLS-Zeta表征。NPs呈球形，平均直径约25 nm，带正电荷（+13.3 mV）；经FA和MTX偶联后净电荷降至约-19.7 mV。

细胞摄取研究显示，FA和MTX负载NPs在两种乳腺癌细胞系中均增强细胞摄取，尤其在MDA-MB-231细胞中因叶酸受体高表达更显著。结果表明LLLT对两乳腺癌细胞系有增殖作用，但存在工程化靶向NPs时，化疗-光热联合疗法疗效显著提升（MTT实验p<0.05、DAPI染色、细胞周期结果）。乳腺癌细胞系最高凋亡效应出现在MTX-FA负载Au@SiO₂ NP联合LLLT组，DAPI染色和细胞周期（subG0/G1期细胞停滞增加）证实。综上，化疗联合LLLT以最小副作用提升乳腺癌治疗潜力。

引言

乳腺癌（BC）作为最常见女性癌症，近年全球新发病例达170万。因病因复杂、治疗反应差，常是女性癌症相关死亡主要原因。2014年美国预计4万女性死于BC。全球52.2万死亡病例中，BC居癌症死亡第五位，欠发达和发达地区各约80万病例。亚洲国家发病高峰在40-50岁，西方国家为60-70岁。主要风险因素包括女性、家族史、年龄、生育倾向差异（如初产年龄>30岁、早初潮晚绝经、未生育）。

抗癌主要目标是制定低毒、高特异性消除肿瘤（特别是转移灶）并预防复发的有效治疗方案。但现用手术、化疗、放疗均有副作用，均无法达成此目标。

过去几十年癌症治疗取得重大进展。热疗作为有前景治疗方法崭露头角。近期光热治疗（PTT）作为潜在有效、无创癌症疗法受广泛关注。基于光吸收纳米结构的PTT成为常规方法替代方案。典型PTT利用PTT剂在激光照射（近红外NIR光，700-1100 nm）下产生足够高温（42°C）破坏肿瘤，被研究为高精度、微创癌症治疗方法。

多种纳米颗粒被广泛研究作为成像对比剂、药物递送载体、激光/无线电波/超声等能量模式向热现象转换器以产生治疗效果。

金纳米颗粒因高局域表面等离激元共振（LSPR）和易与生物分子表面偶联受关注。其在NIR区显示高性能光热转换能力，生物系统中无有害副作用。

尽管金纳米颗粒被认可为有前景光合成剂，但重复NIR照射下光热稳定性差，逐渐失去光热转换能力，限制临床应用。此外，金纳米颗粒药物载载量差、控释特性差，非良好药物载体。替代地，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）因高药物载载能力、降解无毒成分、大比表面积、可控尺寸、高孔隙率、可修饰表面特性，被公认为适宜药物、DNA、蛋白载体。

纳米颗粒偶联化疗药物和癌症靶向配体可克服常规化疗非特异性递送、水溶性差、治疗指数低等劣势。

显化疗特性药物如阿霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、多西他赛单用或联用作为核心治疗，或辅助PTT等。多数癌症患者因化疗药物非精准分布影响全身器官而经历不良反应。这些药物损害快速生长正常细胞，如血细胞、内脏黏膜上皮细胞、毛囊。

甲氨蝶呤（MTX）是治疗类风湿关节炎和皮肤、肺、头颈、乳腺等多种肿瘤最常用药物。其抑制二氢叶酸还原酶（DHFR），阻断四氢叶酸及其副产物生成，而后者对胸苷酸和嘌呤合成必需，二者对细胞生长增殖至关重要。因此阻断DHFR可阻止DNA、RNA、胸苷酸、蛋白四大基础大分子合成。

不幸的是，与大多数常规PTT剂相同，主要挑战是全身注射后实现GNPs在靶组织选择性富集。靶向癌症治疗允许化疗药物递送特定癌细胞同时降低正常健康细胞暴露，从而以较低全身毒性向癌细胞递送更高药物剂量。配体靶向纳米颗粒精准识别癌细胞表面高表达标志物。

叶酸（维生素B9）是细胞生长代谢关键物质。因叶酸对叶酸受体蛋白高亲和力，被用作癌症靶向元件。叶酸受体作为肿瘤生物标志物，在乳腺、卵巢、肺、肾、脑、结肠等特定恶性细胞过表达。叶酸偶联药物递送系统通过内吞作用增强药物细胞摄取。

材料与方法

试剂与材料

使用双蒸水（Ghazi公司，伊朗大不里士）和分析纯化学试剂。Sigma-Aldrich购买：正硅酸乙酯（TEOS，98%）、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPTES，95%纯度）、叶酸、罗丹明B。Merck购买：盐酸（HCl，37%）、氨水（25%）、甲苯、氢氧化钠（NaOH，98%）及其他溶剂。MTX购自Zahravi Farma公司（伊朗大不里士）。

仪器

透射电镜（TEM，LEO 906，德国）分析颗粒尺寸形貌。约100 μL纳米颗粒水悬液室温转移至碳膜铜网，冻干后80 kV观察。动态光散射（DLS，25°C，Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国）测定颗粒尺寸。Zeta电位用光子相关光谱（Zetasizer-ZS，Malvern，英国）测定。双光束UV-Vis分光光度计（UV-1601 PC，SHIMADZU，日本）用10 mm光程700 μL石英比色皿测吸光度。傅里叶变换红外光谱（FTIR，Bruker Tensor 27，德国）用KBr压片法。pH用Metrohm 713 pH计（瑞士）测定。机械搅拌器Heidolph RZR 2102用于搅拌。FA和MTX包封效率用HPLC系统（Waters 2690分离模块配UV-Vis检测器Waters 2500泵1000检测器）计算。室温下C18键合硅胶柱（250 mm×4.6 mm，10 μm，125 Å，Waters，爱尔兰）色谱分离。

Au@SiO₂纳米颗粒制备

SiO₂ NPs基于溶胶-凝胶法合成。下一步按前文研究制备巯基功能化二氧化硅包覆纳米颗粒（TFSNPs）。Au纳米颗粒采用柠檬酸还原法（Turkevich法）制备。最后，TFSNPs表面覆盖AuNPs。首先TFSNPs水中分散，浴式超声至少1 h加入AuNPs溶液再超声30 min。黑暗条件下25°C动态搅拌反应2天。10,000 rpm离心10 min收集紫色Au@SiO₂纳米颗粒，真空烘箱干燥。

MTX和FA负载

MTX和FA负载入Au@SiO₂纳米载体：MTX（10 mg）加入10 mL分散良好纳米载体PBS悬液（5 mg/mL，pH 7.4），室温黑暗中中等搅拌1天。离心收集MTX负载Au@SiO₂纳米载体。上清收集测未负载MTX。MTX负载纳米载体分散于PBS（5 mg/mL，pH 7.4）加入FA（10 mg），室温黑暗中搅拌1天。离心收集FA-MTX负载Au@SiO₂纳米载体，上清分离测未结合FA。冻干保存供下一步实验。HPLC法按前文方案计算未结合MTX和FA量。叶酸溶于氢氧化铵（10 wt%）稀释流动相。MTX和叶酸保留时间分别为10.5和5.95 min。三重复测。药物负载效率（DLE）按公式(1)计算：ee(%)=(初始总药物-未吸收药物)/初始总药物×100。

细胞系选择与培养

选用报道叶酸受体（FR）表面表达水平的两乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231（Pasteur细胞库，伊朗德黑兰）进行细胞毒性研究。完全培养基：RPMI1640（Thermoscientific）、10% FBS、1% Penstrep（Thermoscientific），37°C、5% CO₂、95%湿度培养。

细胞毒性实验

无激光照射下不同NPs处理后细胞增殖用细胞活力实验测定。MCF-7或MDA-MB-231细胞接种96孔板（1.5×10⁴密度）24 h，处理MTX、Au@SiO₂、FA-MTX负载Au@SiO₂ NPs。未处理细胞为对照。加终浓度5 μg/mL MTT（Sigma）孵育37°C 4 h。移除MTT溶液，DMSO（BioIdea，伊朗）轻震10 min溶解沉淀甲瓒晶体。ELISA读数仪570 nm测吸光度。细胞活力归一化对照组，扣除空白背景。

体外激光治疗

LLLT用810 nm波长NIR激光（二极管激光Mustang 2000，俄罗斯），输出功率185 mW破坏癌细胞。MCF-7和MDA-MB-231细胞（1.5×10⁴密度）先用Au@SiO₂和FA-MTX负载Au@SiO₂ NPs处理，再经不同激光剂量（30、60、75、90、105 J/cm²）固定暴露时间（139 s）照射。仅激光照射（无NPs）细胞和无NPs无激光细胞分别为阳性和阴性对照。激光照射24 h后MTT法测细胞活力。

纳米颗粒细胞摄取实验

详细检查NPs细胞内化对于确认表面修饰纳米载体对各细胞系特异性效应至关重要。本工作同时用流式细胞术（定量）和荧光显微镜（定性）检查MCF-7和MDA-MB-231细胞系NPs摄取。

NPs悬液中加入罗丹明B（RhoD）PBS溶液，环境温度黑暗搅拌24 h（防漂白）。Amicon超滤管（NMWL 30 kDa）分离RhoD负载NPs，5000 rpm离心15 min，PBS洗涤除去未结合RhoD。细胞接种密度5×10⁵/孔达汇合。用RhoD负载NPs处理30、90、180 min，未处理细胞为对照。之后胰蛋白酶消化、PBS洗涤，流式细胞仪（BD Biosciences FCASCalibur）荧光定量分析。荧光显微镜进一步确认细胞内化RhoD标记NP或NPD。MCF-7和MDA-MB-231细胞爬片培养24 h后处理游离Au@SiO₂ NPs和MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs。孵育30、90、180 min后PBS洗涤，荧光显微镜（Olympus BH2-FCA，日本）观察罗丹明B标记纳米载体摄取。

荧光显微镜凋亡研究

核定性研究凋亡方法之一是荧光染料DAPI，其结合DNA经适当显微镜检测。按前文DAPI染色方案：MCF-7或MDA-MB-231细胞6孔板接种（5×10⁵密度）贴壁生长24 h。经MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs伴/不伴激光处理后，PBS（Sigma）洗涤，10%甲醛（Merck）固定，Triton X-100（Sigma）渗透15 min。充分洗涤后DAPI（Sigma）染色5 min。倒置荧光显微镜（Olympus）观察凋亡核（碎裂或皱缩）。未处理细胞为阴性对照，仅激光照射细胞为阳性对照。

细胞周期紊乱研究

MCF-7和MDA-MB-231细胞周期分布用流式细胞术测定。起始5×10⁵细胞接种达80%汇合。随后处理MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs伴/不伴LLLT照射。未处理细胞为阴性对照，仅激光照射为阳性对照。胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤。乙醇（Merck）固定48 h。核糖核酸酶A（Cinaclone）处理，随后暗处理加碘化丙啶（PI，Sigma）。Beckton Dickinson FACS检测荧光信号。

统计学分析

各步骤实验三次重复，结果报告为均值±SD。ANOVA比较组间显著性。SPSS软件计算概率值<0.05反映显著性差异。

结果与讨论

合成NPs表征

Au@SiO₂ NPs四步制备：1-合成SiO₂纳米颗粒，2-向SiO₂ NPs添加巯基连接子，3-合成金纳米颗粒，4-将金纳米颗粒连接至SiO₂-连接子复合物表面（图1）。FTIR证实Au@SiO₂成功合成（图2a）。Si-O-Si峰现于1088 cm⁻¹左右。3000-3700和803 cm⁻¹宽峰分别归因于游离硅醇O-H基团伸缩和面外弯曲振动。脂肪族C-H伸缩振动表现为2950 cm⁻¹强峰。三甲氧基硅烷基团C-O在1191 cm⁻¹显示峰。

动态光散射（DLS）测定FA-MTX偶联Au@SiO₂ NPs尺寸纳米级（105±2.3 nm），粒径分布窄（图2b）。

Zeta电位是影响纳米悬浮液稳定性的重要理化参数。极高正/负zeta电位产生较大排斥力。但颗粒高电荷（无论正负）导致NPs被肝脏吞噬细胞吸收清除。静电和空间位阻联合稳定情况下，最小±20 mV zeta电位为宜。pH=7.4、T=25°C下比较负载MTX-FA前后NPs zeta电位（图2c）。Au@SiO₂ NPs得+13.3 mV，双药负载后降至-19.7 mV，处理理想范围。MTX和FA在pH 7.4（高于其pKa 3.8、4.8和3.5、4.3）因结构中两羧基去质子化带负净电荷。因此MTX和FA同时负载Au@SiO₂ NPs后净电荷变负。

TEM分析提供明确单个颗粒尺寸。Au纳米颗粒呈深色球体分散于灰色SiO₂ NP床层上。TEM图像证实Au@SiO₂ NPs合成均匀球形，平均粒径约25 nm（图3）。

药物负载

叶酸介导过表达叶酸受体特定癌细胞通过受体介导内吞增加GNPs摄取，克服GNPs内化效率低，叶酸受体作为肿瘤标志物，叶酸越来越多用于肿瘤靶向。

MTX和FA分子偶联入Au@SiO₂ NPs后zeta电位从+13.3变为-19.7 mV。MTX两羧基估算pKa为3.8、4.8，FA为3.5、4.3。因pH 7.4高于其pKa，MTX和FA两羧基去质子化导致净电荷变负，指示MTX和FA成功偶联Au@SiO₂ NPs。De Ying Tian等报道18和30 mm直径Au纳米颗粒MTX负载量分别为15±0.4%和10±1.0%。本研究FA和MTX在Au@SiO₂ NPs中包封效率分别为22.6%和77.5%。MTX和FA同时评估色谱图见图2d。

细胞摄取

因细胞内光热剂可提高光热癌症治疗效率，认为光热材料细胞内化必要。用已知高过表达叶酸受体的人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行体外细胞摄取测试。为研究FA作为靶向剂作用和表面包覆对靶细胞Au@SiO₂ NPs摄取效率，MCF-7和MDA-MB-231细胞处理Au@SiO₂ NPs和MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs。细胞摄取平均荧光强度结果见图4。结果显示Au@SiO₂ NPs在MCF-7和MDA-MB-231中摄取随培养时间增加而增加（图4、5）。经MTX和FA表面修饰Au@SiO₂ NPs后，两细胞系摄取显著增加（均为叶酸受体表达细胞）。MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs进入MDA-MB-231细胞量大于MCF-7。因MDA-MB-231细胞表达更高水平表面叶酸受体，大部分叶酸受体靶向NPs经受体介导内吞机制进入，导致更高细胞摄取。另一研究显示叶酸偶联NPs增加细胞内化仅发生于过表达aHFR癌细胞，而非低表达aHFR健康细胞。Au@SiO₂ NPs与FA偶联可促进NPs和甲氨蝶呤细胞摄取，增强对MDA-MB-231细胞毒性。

细胞毒性实验

游离MTX、空白Au@SiO₂ NPs、MTX-FA偶联Au@SiO₂ NPs体外细胞毒性经MTT实验评价24、48、72 h（图6）。MTT结果显Au@SiO₂ NPs对MCF-7和MDA-MB-231无细胞毒性。为比较游离MTX和MTX-FA偶联Au@SiO₂ NPs细胞毒性，所有处理时间用相同MTX浓度（25、50、100、200 μg/mL）。细胞毒性结果显游离MTX或MTX-FA偶联Au@SiO₂ NPs在两细胞系24 h后死亡率约10-25%。前研究报道金纳米颗粒在体外条件下对小鼠成骨细胞MC3T3-E1和人牙周韧带干细胞有增殖作用。我方结果与此一致，图6a、b显示游离Au@SiO₂ NPs增殖作用。因此MTX和FA-MTX负载Au@SiO₂ NPs（NPD）细胞毒性相当可能归因此现象。

激光照射

本研究MTT实验考察MCF-7和MDA-MB-231细胞经Au@SiO₂ NPs和MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs处理后，30-105 J/cm²剂量范围激光照射细胞活力。MTX浓度100 μg/mL条件下，LLLT剂量75 J/cm²后MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs处理MCF-7和MDA-MB-231细胞死亡率约39%和45.5%。同条件下Au@SiO₂ NPs+激光或单独激光未显示明显细胞死亡。激光剂量增至105 J/cm²时两细胞系死亡率增至60-75%，而同照射剂量Au@SiO₂ NPs+激光或单独激光组无细胞毒性。MTX剂量100 μg/mL联合MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs和LLLT联合疗法下，MCF-7和MDA-MB-231细胞IC₅₀分别在90和75 J/cm²激光剂量获得。另一方面，无激光照射下MTX和MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs在MTX剂量100 μg/mL（激光治疗研究选定剂量）时两细胞系死亡率15-25%。结果表明MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs联合激光治疗在两细胞系显示协同效应，显著降低细胞活力（p<0.001），优于单独激光照射细胞。提示NPs治疗，特别是靶向策略可提高激光治疗乳腺癌细胞破坏疗效（图7）。

DAPI染色凋亡研究

MCF-7和MDA-MB-231细胞经Au@SiO₂ NPs、MTX-FA负载Au@SiO₂ NPs伴/不伴激光处理后研究凋亡，了解激光治疗是否增强化疗疗效。结果汇总见图8。未处理正常MCF-7和MDA-MB-231细胞作对照，单独激光或无激光游离Au@SiO₂ NPs处理细胞核形态典型，无凋亡。但游离MTX、激光照射Au@SiO₂ NPs、无激光MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs处理细胞显示部分凋亡核（图8）。MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs联合激光照射（810 nm、75 J/cm²、139 s）处理细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞群落大幅下降。因此MTX/FA负载Au@SiO₂ NPs摄取后激光照射疗效在MCF-7和MDA-MB-231细胞增强。新开发MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs具备通过高度碎裂细胞核、细胞损失剧增、细胞完全损伤增强光热效应能力。

细胞周期

流式细胞术和PI染色DNA研究MCF-7和MDA-MB-231细胞经MTX、Au@SiO₂ NPs、MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs处理后联合LLLT（75 J/cm²）或无激光照射细胞周期分布。研究显示MDA-MB-231或MCF-7细胞未处理对照组活跃于S期（图9a、b）。75 J/cm²激光处理非显著降低S期细胞百分比。单独LLLT无NP药物处理细胞显著增加G0/G1期细胞群体，指示LLLT单独安全。NPs处理未干扰两细胞系细胞周期。游离MTX无激光或有激光照射处理显示细胞周期扰动，包括S期细胞减少。单独NPD降低S期细胞。有趣的是MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs（NPD）增强sub G0/G1期细胞百分比作为凋亡标志。MDA-MB-231细胞sub G0/G1期百分比（~18%）显著高于MCF-7（12%），因MDA-MB-231细胞NPs摄取更高。

Ramos等显示肿瘤细胞中LLLT增加S和G2/M期细胞百分比，检测到增殖减少和衰老增强。LLLT（15 J/cm²）后细胞周期研究显示G1期阻滞，与照射TK6细胞生长停滞一致。另一组报道PTT主要干扰S期细胞，增加G2/M期细胞群体和阻滞。结果PTT可通过干扰细胞周期诱导细胞放射敏化。其结果与我方研究一致，显示细胞周期紊乱和S期细胞减少。我方研究也显示联合化疗-光热疗法后凋亡细胞群体（sub G0/G1）增加。因此应用LLLT联合MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs（NPD）作为乳腺癌靶向纳米颗粒可增强乳腺癌治疗疗效。

结论

本研究设计MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs用于靶向乳腺癌治疗，联合LLLT作为无创、FDA批准激光治疗。获得球形、平均直径25 nm、表面电荷-19.7 mV MTX和FA负载Au@SiO₂ NPs。此尺寸和表面电荷适宜增加NPs生物分布。两乳腺癌细胞系叶酸受体表达差异下，MDA-MB-231细胞摄取百分比高于MCF-7，验证新开发NPs成功靶向策略。MTT实验、DAPI染色、细胞周期研究结果表明化疗-光热联合疗法显示协同效应，两乳腺癌细胞系细胞毒性和凋亡效应显著增加（p<0.001），特别是MDA-MB-231细胞。因Au@SiO₂ NPs或LLLT单独无细胞毒性，可结论治疗设计在靶向部位有协同效应。本研究发现可为利用生物化疗联合低能量激光设计未来癌症治疗方案提供参考。