加载阿霉素的 PEG-CdTe 量子点作为髓外多发性骨髓瘤治疗的智能给药系统

介绍

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是仅次于淋巴瘤的第二大血液肿瘤[1]，是一种浆细胞积聚在骨髓中的恶性肿瘤，可导致骨破坏和骨髓衰竭。在过去的 10-20 年中，由于开发了更有效的具有高抗肿瘤活性的化疗药物和方案，骨髓瘤患者的预期寿命显着延长 [2, 3]。髓外多发性骨髓瘤 (EMM)，定义为多发性骨髓瘤患者骨髓外存在浆细胞，在整个病程中可能占多发性骨髓瘤的 30% [4]。除了预后不良外，髓外复发的 EMM 患者的中位总生存期 <6 个月 [4]。关于新药的使用，据报道，11 名 EMM 患者中没有一人对沙利度胺单药有反应，而 27 名没有髓外受累的患者中有 16 名有反应 [5]。此外，即使是基于新药的治疗，如硼替佐米，也不能提高 EMM 患者的生存率 [6]。但也有研究表明大剂量化疗可促进EMM患者的预后[7, 8]。然而，高剂量的化疗药物患者耐受性差，对正常组织器官产生显着的副作用。

多柔比星 (DOX) 是治疗多发性骨髓瘤最有效的化疗药物之一 [6, 9]。然而，其在老年或EMM患者中的大剂量临床应用受到其毒副作用的严重限制，主要包括心脏毒性和骨髓抑制。此外，骨髓瘤最常在 65 至 74 岁的人群中被诊断出来，中位数为 69 岁 [9]。的确，化疗仍是多发性骨髓瘤的主要治疗方法，但化疗药物往往在杀死肿瘤细胞、降低机体免疫能力的同时，对正常组织或器官造成不可逆的损伤。因此，传统的化疗无法达到预期的效果。尽量减少化疗的副作用仍然具有挑战性。统计显示，近十年来，新发骨髓瘤的年均发病率增加了0.8%[9]。同时，EMM患者没有标准的治疗方案。因此，急需针对EMM患者的新疗法。

为了克服常规化疗的局限性，研究人员主要使用脂质体卡非佐米纳米颗粒可以有效靶向多发性骨髓瘤细胞 [10]。载有 DOX 的血小板可以增强淋巴瘤的治疗效果 [11]。纳米颗粒（例如碲化镉量子点或 CdTe QD）可以以 pH 控制的方式延长循环时间和药物释放，提高疗效并降低药物毒性 [12,13,14,15,16]。聚乙二醇（PEG）具有亲水性、高生物相容性、安全性、无毒、低免疫原性等特点，可与CdTe QDs（PEG-CdTe QDs）结合产生“免疫忽略”效应，减少甚至避免血浆网状内皮系统的调理作用和吸收作用 [14]。这种特性有助于通过最大限度地减少或消除血浆蛋白在这些颗粒上的吸附来延长 PEG 的血液循环时间 [17]。 PEG-CdTe QD 通过液相内吞作用和质膜表面的脂质双层亲和力被细胞有效内化 [18]。作为纳米药物载体，载有药物的 CdTe QDs 能够以 pH 控制和 pH 触发的模式释放药物，这些纳米颗粒复合物可以在与肿瘤微环境相似的低 pH 条件下释放药物 [13]。

在这项研究中，合成了一种纳米颗粒给药系统（PEG-CdTe-DOX）以提高化疗疗效。该系统促进了 DOX 优先递送到 PRMI 8226 细胞中。系统合成及功能示意图如图1所示。对给药系统进行表征，并在体外测试了其抗肿瘤作用和系统毒性。本研究可能为EMM治疗提供新思路。

PEG-CdTe-DOX体外抗肿瘤活性提高的可能机制示意图。注意：当通过 PEG 的高组织相容性靶向肿瘤细胞时，它们可以被内化。 DOX通过调节凋亡相关基因的表达诱导肿瘤细胞凋亡

材料和方法

材料

PEG-CdTe QD 和 Pierce™ 二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质测定试剂盒购自 Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。 DOX 购自大连美伦生物科技有限公司（中华人民共和国大连）。 PRMI-1640 购自 Gibco Chemical Co. (Carlsbad, CA, USA)。胎牛血清 (FBS) 购自 Wisent Inc. (Montreal, Canada)。 Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）细胞凋亡检测试剂盒和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试剂盒购自Beyotime Biotechnology Co., Ltd.（中华人民共和国南通），Bax、Caspase- 3、Bcl2、β-肌动蛋白购自 Cell Signaling Technology, plc。 （美国波士顿）。日本电子光学实验室有限公司（东京，HT700，日本）接受了透射电子显微镜（TEM）。 PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的流体动力学直径和尺寸分布由 Zetasizer sizer NanoZs 尺寸分析仪（Malvern，Zetasizer Ultra，UK）测量。 DOX的浓度通过HPLC（Jasco，LC-2000，日本）检测。激光扫描共聚焦显微镜（尼康，C 2，日本）发现了 DOX 交付。流式细胞仪（BD，Biosciences Accuri C6，USA）检测PRMI 8226细胞的凋亡和荧光强度。使用ECL检测系统（Tanon，5200 Multi，China）检测蛋白质印迹。

制备 PEG-CdTe-DOX

DOX 通过静电相互作用被有效地吸附到 PEG-CdTe QD 上。简而言之，将 100 μl PEG-CdTe (1 mg/ml) 和 100 μl DOX (1 mg/ml) 在 800 μl 蒸馏水中混合，在 100 rpm 搅拌下在 37 °C 黑暗中搅拌 24 小时。收集 PEG-CdTe-DOX 并离心 30 分钟（4°C，30,000 rpm）。 PEG-CdTe-DOX在上述条件下混合并离心两次。未反应的 DOX 通过高效液相色谱 (HPLC) [19] 进行测试。包封率（EE）和载药量（DL）计算如下：

PEG-CdTe QD 的形态通过 TEM 表征。 PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的流体动力学直径通过 PBS 中的动态光散射 (DLS) 测量。简而言之，将 20 毫升 PEG-CdTe-DOX（DOX，1 毫克/毫升）转移到透析袋中（截留分子量为 3500 Da），然后将其浸入 180 毫升 pH 为 5.0、6.0、7.4 或8.0，在 37°C 下恒定转动（以 100 rpm）。然后，每 2 小时收集 0.1 毫升 PBS，并用等量体积的 PBS 替换。 DOX 浓度通过 450 nm 分光光度法定量，并根据随时间的释放率绘制 DOX 从 PEG-CdTe 中的累积释放。

共聚焦荧光显微镜

在共聚焦显微镜下目视确认 DOX 进入 PRMI 8226 细胞（多发性骨髓瘤系）。 PRMI 8226 细胞用 PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX 处理 4 小时。然后，收集 PRMI 8226 细胞，离心并悬浮在 70 μl PBS 中。然后，将细胞转移到载玻片上。 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 10 分钟后，用共焦倒置显微镜拍摄共焦荧光图像。 DAPI和DOX的发射波长分别为450和585 nm。

细胞培养

PRMI 8226（多发性骨髓瘤细胞）和 293 t（人胚肾细胞）细胞系购自上海细胞研究所（中国科学院，上海，中国）。 PRMI 8226 细胞在添加了 10% FBS 的 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 培养基中培养，293 t 细胞在添加了 10% FBS 和 100 U/ml 青霉素的 Dulbecco 改良伊格尔培养基 (DMEM) 培养基中培养和 100 μg/ml 链霉素，温度为 37°C，在含 5% 二氧化碳 (CO2) 的潮湿环境中。

细胞活力测定

通过CCK-8测定评估细胞活力。首先，将 PRMI 8226 细胞接种在 96 孔板中，每孔板含有 100 μl 2 × 10 ⁴ 细胞并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（对照组）、PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX 处理。在含有 5% CO2 的潮湿环境中，在 37°C 下孵育 24、48 或 72 小时后，DOX 浓度为 1.76 μg/ml。将 293 t 细胞接种在 96 孔板中，每孔板含有 100 μl 8 × 10 ⁴ 细胞并用 PEG-CdTe（0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 或 51.2 μg/ml）处理 24 小时。然后，将 CCK-8 (10 μl) 添加到 96 孔板中并再孵育 3 小时。 PRMI 8226细胞和293t的细胞活力(%)计算为(1 - OD处理/OD对照) × 100。

细胞摄取

通过流式细胞术 (FCM) 定量测量细胞摄取，以确定 PEG-CdTe-DOX 处理的细胞中的细胞内 DOX 浓度是否增加（图 3）。简而言之，将 PRMI 8226 细胞与 PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX 在 24 孔板中培养并孵育 24 小时。将细胞离心并以 1000 rmp 洗涤两次，每次 5 分钟。将沉淀物分散在 200 μl PBS 中并通过 FCM 进行分析。 DOX的抗荧光为红色，相对荧光强度（FI）计算为FI处理的细胞/FI PEG-CdTe细胞。

细胞凋亡研究测试

PRMI 8226细胞以3 × 10 ⁵ 的密度接种于24孔板中 细胞。与 PBS、PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX 孵育 24 小时后，通过 1000 rpm 离心收集这些细胞，并用 PBS 洗涤 3 次。不同组的细胞在结合缓冲液 (100 μl) 中用 Annexin V-FITC (5 μl) 标记 15 分钟，然后在暗室中加入 5 μl PI 5 分钟。 FCM法检测细胞凋亡率。

蛋白质印迹

在不同处理（PBS、PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX）后收获 PRMI8226 细胞并进行蛋白质印迹。收集各组总蛋白，采用Braford法检测蛋白浓度。总蛋白质 (40 μg) 通过 10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS/PAGE) 进行大小分级并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后，在室温下使用 5% 脱脂牛奶作为封闭剂 1 小时。使用单克隆抗体进行蛋白质印迹：β-肌动蛋白（内部对照）、Bax、Bcl2、Caspase-3。 ECL检测系统检测蛋白印迹，Image J定量蛋白条带。

统计分析

所有值均以平均值 ± 标准偏差给出。通过Student’t分析的两组之间的差异 测试。 P 的值 <0.05 被认为具有统计学意义。所有实验至少进行3次重复。

结果

PEG-CdTe-DOX 的表征

PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 表现出晶体结构并在 PBS 中分散良好，如通过 TEM 检测到的（图 2a、b）。 PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的纳米粒度分布是通过动态光散射 (DLS) 确定的（图 2c）。 PEG-CdTe-DOX 中 DOX 的 DL 和 EE 通过 HPLC 测定（图 2e）。 DOX 释放在 pH 5.0 和 6.0 时最大化，因为大约 92.5% 和 88% 的负载 DOX 在 24 小时内释放到 PBS 中，并且在 pH 7.4 和 8.0 时释放速率较慢，这表明是 pH 触发的释放模式（图 2d）。 DOX 的 pH 敏感释放能力是有效的，因为在肿瘤微环境中形成了酸性环境，其中 DOX 从 PEG-CdTe-DOX 复合物快速释放。平均流体动力学直径分别为 8.20 和 78.31 nm； EE和DL分别为77.20% ± 1.12%和42.12% ± 0.98%； PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的 Zeta 电位分别为 - 20.12 ± 2.45 和 - 10.50 ± 1.26 mV。这些发现表明 DOX 对 PEG-CdTe 的有利负载以及 PEG-CdTe-DOX 的成功合成。因此，可以实现肿瘤微环境中更高的DOX浓度和正常组织中更低的DOX浓度。

PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的特性。注释：a , b PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的 TEM 图像。 c PEG-CdTe 和 PEG-CdTe-DOX 的 DLS 分析。 e 优化的 PEG-CdTe-DOX 给药系统由不同孵育浓度的 DOX 合成为 PEG-CdTe。 d DOX 在 PBS 中的 PEG-CdTe-DOX 在 37°C、pH 5.0、6.0、7.4 或 8.0 下释放。 f 不同浓度PEG-CdTe处理后293t细胞的存活率

共聚焦显微镜荧光图像显示 PEG-CdTe-DOX 可以将 DOX 递送到 PRMI 8226 细胞中。此外，与DOX组相比，PEG-CdTe-DOX组在PRMI 8226细胞中显着储存红色荧光，表明PEG-CdTe可以通过靶向RPMI 8226细胞增强PEG-CdTe-DOX的细胞摄取和细胞内递送。

体外 PEG-CdTe-DOX 的细胞摄取和细胞毒性

为了确定 PEG-CdTe-DOX 是否可以专门促进 PRMI 8226 细胞中 DOX 的积累，我们通过细胞内荧光强度的流式细胞术 (FCM) 测量了 DOX 的积累。与DOX组相比，PEG-CdTe-DOX组PRMI8226细胞内DOX浓度显着升高（P <0.01，图 4）。 PEG-CdTe-DOX 对 PRMI 8226 细胞的细胞毒性与孵育时间呈正相关，孵育时间也长于 DOX 组（72 小时，图 4）。使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 检测孵育 24、48 和 72 h 后的细胞活力，相应的 PEG-CdTe-DOX 抑制率分别为 58%、70% 和 85% .结果表明，与DOX组相比，PEG-CdTe-DOX组PRMI8226细胞活力显着降低（P <0.05)。此外，在对照组和 PEG-CdTe 组之间没有观察到细胞活力的显着差异。使用 PBS 和 PEG-CdTe（PEG-CdTe 的浓度与 RPMI 8226 实验中的相同），397 t 细胞的细胞活力没有显着差异。这些发现与细胞内 DOX 浓度（图 3 和 4）一致，表明 PEG-CdTe 有助于靶向递送而不干扰治疗效果。因此，PRMI 8226细胞的凋亡显着增强，表明PEG-CdTe-DOX可以作为一种给药系统。

PRMI 8226 细胞在接受 PEG-CdTe、DOX 或 PEG-CdTe-DOX 后的荧光显微镜图像。注释：a , d PEG-CdTe； b , e DOX; c , f PEG-CdTe-DOX。红色荧光用箭头表示 PEG-CdTe-DOX（比例尺：50 μm，× 400；DAPI 和 DOX 的发射波长分别为 450 和 585 nm）

流式细胞术测定的 PRMI8226 中的平均荧光强度和不同处理的 PRMI8266 细胞的生长抑制。注释：a PEG-CdTe； b DOX; c PEG-CdTe-DOX； d DOX 和 PEG-CdTe-DOX 的荧光强度与 PEG-CdTe (**P <0.01)。 e 在 24、48 和 72 小时对用 PBS（对照）、PEG-CdTe、DOX 和 PEG-CdTe-DOX 处理的 PRMI 8226 细胞进行 CCK-8 分析（*P <0.05)

PRMI8226 细胞凋亡

通过 FCM 测量的 PRMI8226 细胞的总凋亡率在对照组、PEG-CdTe、DOX 和 PEG-CdTe-DOX 组中分别为 4.78%、6.95%、34.07% 和 66.5%（图 5）。 PEG-CdTe-DOX组细胞凋亡率较DOX组显着升高(P <0.01)。而对照组与PEG-CdTe组的细胞凋亡率无显着差异，表明PEG-CdTe是安全的，可显着提高DOX的疗效。

不同处理下 PRMI 8226 细胞的凋亡率。注释：a PBS; b PEG-CdTe； c DOX; d PEG-CdTe-DOX。 e 不同组PRMI8226细胞凋亡率比较柱状图(**P 与对照相比<0.01； ^## P <0.01（与DOX相比）

蛋白质印迹

进行蛋白质印迹以测量凋亡相关蛋白 Bax、Caspase-3 和 Bcl-1 的表达水平（图 6）。 Bax 和 Caspase-3 在 DOX 和 PEG-CdTe-DOX 组中逐渐上调。相比之下，Bcl2 的表达发生了相反的变化。在 PEG-CdTe-DOX 组中，与 DOX 组相比，Bax 和 Caspase-3 表达强烈（P <0.05），而Bcl2表达最低。这些发现证实了PEG-CdTe-DOX的抗肿瘤活性是其中最有效的。

不同处理下 PRMI 8226 细胞凋亡相关基因的蛋白表达。注释：a PBS; b PEG-CdTe； c DOX; d PEG-CdTe-DOX (*P <0.05)

讨论

肿瘤化疗失败的主要原因是患者的不耐受。包含硼替佐米、DOX 和地塞米松的 PAD 方案是多发性骨髓瘤的一线治疗 [9]。 DOX在多发性骨髓瘤的治疗中发挥着重要作用。 DOX 通过破坏 DNA 抑制增殖并诱导肿瘤细胞凋亡 [20]。然而，细胞毒性药物如 DOX 会对正常组织和器官产生各种不良反应，尤其是心脏毒性 [21]。骨髓瘤最常在 65 至 74 岁的人群中被诊断出来 [22]，而老年多发性骨髓瘤患者通常患有器官功能障碍，无法接受大剂量化疗来改善预后。耐受性是多发性骨髓瘤持续治疗的保证，从而限制了 DOX 的临床应用。因此，许多EMM患者因无法忍受大剂量化疗而没有机会获得有效治疗。因此，迫切需要开发可以减少不良反应并增强治疗效果的方法。在这项工作中，我们开发了一种使用 PEG-CdTe 纳米颗粒的 DOX 负载递送系统，该系统能够通过体循环将药物选择性地浓缩到肿瘤组织中。

我们的研究表明，PEG-CdTe 纳米颗粒可以加载具有高 DL 和 EE 的 DOX（图 2e），这与其他研究一致 [12, 13]。此外，直径为 8.2 nm (<10 nm) 的 PEG-CdTe 纳米粒子可以被泌尿系统快速代谢 [23]，而 78.31 nm (<200 nm) 的 PEG-CdTe-DOX 纳米粒子可以延长血液循环减少甚至避免了网状内皮系统中的血浆调理作用和吸收 [23]。作为纳米颗粒载体，药物以 pH 触发和 pH 控制的模式从 PEG-CdTe 中释放出来，并延长循环周期，这对于实用的药物递送系统来说很重要，以防止对药物载体产生不必要的免疫反应和组织反应[24]。由于缺氧状态，肿瘤微环境的pH值低于正常组织[25]，从而释放更多的DOX。可以提高酸性微环境（肿瘤组织）中的药物浓度，从而提高化疗药物的疗效[26]。因此，药物在肿瘤细胞周围大量释放，而药物在正常生理环境中大部分留在载体中，较少释放到正常组织。细胞内实验也证实更多的 DOX 被传递到 PRMI 8226 细胞。因此，提高了化疗疗效，诱发了对正常组织的不良反应。

体外实验一致表明 PEG-CdTe-DOX 靶向肿瘤细胞并增加那里的药物积累（图 3）。类似地，在相同浓度下，与单独的 DOX 相比，PEG-CdTe-DOX 增加了 PRMI 8226 细胞的增殖抑制和凋亡（图 4）。因此，需要较低的 DOX 才能达到相同的化疗效率。此外，PEG-CdTe-DOX 可以增加 RPMI 8226 细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导，这是药物杀死骨髓瘤细胞的主要方式（图 5）。此外，PEG-CdTe 组和对照组之间没有发现显着差异，这证实了 PEG-CdTe 在体外没有治疗活性。需要注意的是，我们的结果表明低浓度 PEG-CdTe 具有高安全性和低细胞毒性，这与其他研究一致 [12, 27]。 FCM检测的PMIR 8226细胞凋亡率在PEG-CdTe-DOX组明显高于DOX组(P <0.01)。因此，PEG-CdTe可以通过将药物递送至肿瘤细胞来显着减轻DOX的副作用。

考虑了三种主要的细胞凋亡途径：线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。在线粒体途径中，凋亡因子（如细胞色素C）首先从线粒体释放到细胞质中，然后启动caspase途径诱导的该途径凋亡[28]。 Bcl2 家族由促凋亡蛋白（Bax、Bad 和 Bak）和抗凋亡蛋白（Bcl-xl 和 Bcl2）组成 [29]。在细胞凋亡信号的刺激下，Bax 可以从细胞质迁移到线粒体膜，这是“生或死”细胞机制的顶点。 Bcl2 和 Bax 是一对正负基因调控，因为 Bax 诱导细胞凋亡，而 Bcl2 抑制它 [30]。 Caspase-3不仅可能促进细胞凋亡，而surviving是细胞凋亡的最强抑制剂，还能促进细胞增殖，可直接激活caspase-3和caspase-7，从而阻断细胞凋亡[31, 32]。 Caspase-3 是半胱天冬酶家族中的一个刽子手，在启动时也可以切割和灭活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [12]。本研究通过检测相关凋亡蛋白的表达，探讨PEG-CdTe-DOX增强抗肿瘤活性的分子机制。发现PEG-CdTe-DOX可通过caspase介导的凋亡途径诱导细胞凋亡，从而增强对肿瘤细胞的细胞毒作用。

结论

我们制造了用于 EMM 处理的 PEG-CdTe-DOX，具有高 EE 和 DL。该系统可以有针对性地将DOX递送至RPMI 8226细胞，从而提高治疗效果并降低DOX的副作用。 PEG修饰的CdTe靶向可提高化疗效果并减少副作用，为更好的癌症治疗铺平道路。

缩写

DAPI：

4',6-二脒基-2-苯基吲哚

DL：

载药量

DOX：

阿霉素

EE：

封装效率

EMM：

髓外多发性骨髓瘤

FCM：

流式细胞术

HPLC：

高效液相色谱

MM：

多发性骨髓瘤

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PEG-CdTe-DOX：

聚乙二醇改性碲化镉量子点

SDS/PAGE：

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

TEM：

透射电子显微镜