靶向碳纳米管光热疗法联合检查点抑制：转移性乳腺癌新策略

摘要

癌症死亡的最大原因是转移及其治疗后果。本文提出转移性乳腺癌新疗法：靶向单壁碳纳米管(SWCNTs)光热疗法联合检查点抑制剂免疫刺激。研究发现，选择性近红外光热消融原位同种异移BALB/cJ小鼠EMT6乳腺肿瘤，使用退黏素A5(ANXA5)功能化SWCNT生物偶联物，协同增强抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗CTLA-4)依赖的旁观效应，肿瘤接种100天后生存率达55%。对比单独光热疗法或单独免疫刺激，100天生存率均为0。光热疗法前静脉注射低剂量1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5生物偶联物，经ANXA5依赖性结合富集于肿瘤血管。光热疗法中肿瘤平均最高温度达54°C(持续175 s)。通过流式细胞术定量脾脏抗肿瘤免疫效应细胞和血清细胞因子定量评估联合光热消融和免疫刺激延长生存的机制。

引言

转移及其治疗后果是癌症死亡单一最大原因[1]。例如乳腺癌转移时患者5年生存率降至25%以下。尽管过去60年200余种新抗肿瘤药物改善患者预后，转移性疾病总生存率仍差[2]。本研究在原位小鼠模型中探讨肿瘤靶向单壁碳纳米管(SWCNT)生物偶联物促进的光热疗法(PTT)联合抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗CTLA-4)检查点抑制治疗转移性乳腺癌。

SWCNTs作为纳米材料的独特性质引发其抗癌潜力工具的浓厚兴趣。SWCNTs虽有多种生物学效应，但癌症治疗应用主要聚焦其与近红外(NIR)光相互作用产生的光热效应，即光热疗法(PTT)中SWCNTs快速加热肿瘤。多组别在多种乳腺癌模型研究SWCNTs用于PTT治疗策略潜力[3-10]，主要关注PTT治疗深度不超数mm原发肿瘤(NIR光衰减几乎完全)。

我们早前证明原位同种异移小鼠原发乳腺肿瘤可用温和NIR激光配合光热增强SWCNT生物偶联物近乎完全消除[11]。该生物偶联物中SWCNTs功能化退黏素A5(ANXA5)，高亲和力结合肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞外表达阴离子磷脂酰丝氨酸，不结合血管正常细胞[12,13,14]。原子力显微镜(AFM)观察显示偶联物高度2.5–5.0 nm，与其他SWCNT-蛋白偶联物相似[11]。虽能在转移模型中根除原发肿瘤，单独PTT仅适度延长生存。但初步证据提示联合免疫调节剂如环磷酰胺可增加生存率。

近年免疫调节剂如环磷酰胺协同增强SWCNT定向PTT受广泛关注。检查点抑制剂是一类有前景免疫调节药物。检查点抑制剂为抗体如抗CTLA-4、抗PD-1、抗PDL-1，结合调节机体抗癌反应关键细胞蛋白。这些抗体阻断免疫系统下调抗癌反应的关键"检查点"。这些蛋白正常控制机体免疫反应。阻断其作用，检查点抑制剂移除免疫系统抑制自然抗肿瘤反应的机制。近期多组别观察到抗CTLA-4检查点抑制联合SWCNT增强PTT有潜力促进乳腺癌强免疫反应[15,16]。

本研究评估新型PTT模式联合免疫刺激剂抗CTLA-4检查点抑制，以及PTT联合抗CTLA-4检查点抑制增强抗肿瘤免疫机制，并评价SWCNTs在靶器官长期命运。

材料与方法

材料

编码ANXA5质粒pET-30 Ek/LIC/ANX实验室前期构建[11]。牛血清白蛋白(BSA)、Triton X-100、EDTA、β-巯基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Tris-乙酸-EDTA缓冲液购自Sigma-Aldrich(St Louis, MO)。磷酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)购自Mallinckrodt Chemicals(Phillipsburg, NJ)。HPLC级乙醇购自Acros Organics(Waltham, MA)。His-trap柱购自GE Healthcare(Chicago, IL)。流式细胞染色缓冲液、固定/渗透缓冲液、渗透缓冲液、发色内毒素定量试剂盒、Slide-A-Lyzer透析盒(3.5 kDa)购自Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA)。2和100 kDa透析膜购自Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez, CA)。Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI-1640)和Hank's平衡盐溶液购自ATCC(Manassas, VA)。胎牛血清(FBS)购自Atlanta Biologicals(Lawrenceville, GA)。胰蛋白胨、酵母提取物、硫酸卡那霉素购自Alfa Aesar(Ward Hill, MA)。氢氧化钠、氯化钾、氯化钠购自VWR Inc(Radnor, PA)。HRV-C3蛋白酶购自Sino Biologics(Portland, OR)。抗CTLA-4小鼠单克隆抗体(克隆:9H10)和小鼠细胞因子ELISA试剂盒(TNF-α, IFN-γ, IL-6)购自BioLegend(San Diego, CA)。CoMoCAT SWCNTs(平均直径0.8±nm, 平均长度1.5±0.5 µm)购自CHASM(Boston, MA)。CoMoCAT法可高选择性产出少数(n,m)手性SWCNTs[19]。本研究样品高富集[5,6] SWCNTs，在980 nm处呈强NIR吸收。该吸收对应此类纳米管占据van Hove奇点到对应未占据奇点S₁₁跃迁[20]。为最大化沉积肿瘤SWCNT辐射吸收，本研究激光波长980 nm精确匹配S₁₁光学跃迁。附件Fig.S1显示荧光谱，可见光激发S22跃迁后清晰显示S₁₁ NIR发射。

细胞培养

EMT6乳腺癌细胞(ATCC, Manassas, VA)用Waymouth's MB 752/1培养基含2 mM L-谷氨酰胺、15% FBS培养。所有细胞37°C、100%湿度、5% CO₂培养。0.25%(w/v)胰蛋白酶含0.53 mM EDTA传代。细胞系谱和无支原体状态经STR测试(Charles River)和鲎试剂测定内毒素确认。

ANXA5和SWCNT-ANXA5制备

SWCNT-ANXA5偶联物按前期工艺制备[11]，得2.5 mg ANXA5/mg SWCNT。简述：转染编码ANXA5质粒pET-30 Ek/LIC/ANX大肠杆菌生长纯化，用固定Ni²⁺金属亲和层析分离ANXA5，酶切去除(His)₆标签。冻干CoMoCAT SWCNTs用1% SDS经20 W探针超声2次、29,600 g离心30 min分散。悬浮SWCNTs经NIR荧光表征(附件Fig.S1)，再与1,2-二硬酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-马来酰亚胺)连接子室温反应30 min，允许SWCNTs与DSPE官能团疏水相互作用。随后蒸馏水透析8 h去除多余连接子和SDS。透析后偶联物与含一半胱氨酸ANXA5反应2 h，1.5 mg/mL L-半胱氨酸封端。最终产物SWCNT-ANXA5对20 mM磷酸钠缓冲液透析8 h去除多余ANXA5和L-半胱氨酸。SDS-PAGE表征蛋白重量纯度。UV-Vis-NIR荧光光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)拉曼分析、Bradford法表征生物偶联物SWCNT和ANXA5含量(附件Fig.S2)。

体内实验

所有程序遵守俄克拉荷马大学机构动物护理使用委员会(IACUC)批准方案。用6周龄雌性BALB/cJ小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)，标准饲料饲养。NIR激光光热照射肿瘤时小鼠吸入2%异氟烷+98%氧气麻醉。

正位注射10⁶ EMT6小鼠乳腺癌细胞(100 μL PBS)至第4乳腺脂肪垫诱导肿瘤。肿瘤生长12天达60 mm³(~5 mm直径)时，经侧尾静脉静脉注射1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5(mg SWCNT/kg体重)生物偶联物。3 h后，肿瘤边界外5 mm区域用NIR光(980 nm)照射，能量和功率密度分别175 J/cm²和1 W/cm²(照射175 s; Diodevet-50 NIR激光, B&W Tek Inc., Newark, DE)。检查点抑制通过腹腔连续给药200 μg抗CTLA-4抗体(100 μL PBS)于肿瘤接种后第8、11、16天进行。肿瘤体积用改良椭球公式V = ½ × 长 × 宽²(游标卡尺测最长尺寸和垂直宽度)计算。手持FLIR TG165红外热成像仪(Raymarine ITC, Fareham, UK)自动扫描最大检测温度监测肿瘤温度。靶器官收获固定于10%中性缓冲福尔马林，制备石蜡包埋切片苏木精-伊红染色进行毒性分析。

体外SWCNT检测

小鼠经侧尾静脉注射1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5(mg SWCNT/kg体重)。选定时间点处死小鼠(n=3)，解剖取靶器官分析。组织样品按前文[21]制备。组织裂解液SWCNT相对NIR荧光光谱用NS3 NanoSpectralyzer(Applied NanoFluorescence, Houston, TX)测定。

流式细胞术

治疗后14天处死小鼠，按前文[21]定量脾脏抗肿瘤免疫效应细胞。

细胞因子检测

按上述处理后，小鼠(n=4–5)PTT 7天后处死取血。按供应商方案用ELISA定量稀释血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素6(IL-6)浓度。

统计分析

Graphpad Prism软件分析数据。单因素方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer多重比较检验评估统计显著性。Mantel-Haenszel log-rank检验确定生存曲线统计显著性。单因素ANOVA和Dunnett多重比较检验分析血清细胞因子浓度统计显著性。Bonferroni阈值校正多重比较。误差图形表示为均值标准误，除非误差未超出绘制均值点符号大小，为清晰起见省略误差棒。

结果

热力学动力学

1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5剂量下记录NIR光处理肿瘤最高温度(图1)。注射SWCNT-ANXA5小鼠全程NIR光处理肿瘤温度高于生理盐水组。接受SWCNT-ANXA5小鼠肿瘤平均温度显著高于生理盐水组(54°C vs 37°C, p<0.05)。增强光热疗法仅SWCNT-ANXA5组出现可见肿瘤消融。消融表现为快速变色、皮肤收缩皱褶。48 h内光热消融部位形成明显焦痂。皮肤完全再生需数周。

光热疗法与检查点抑制

图2显示光热疗法联合抗CTLA-4单克隆抗体检查点抑制结果。单独光热疗法虽易根除原发乳腺癌新生物，但NIR激光穿透深度仅数mm限制乳腺癌转移治疗。为克服局部NIR光热抗肿瘤治疗短板，探索该独特治疗模式联合全身检查点抑制(图2)。单独光热疗法虽擅长破坏原发EMT6肿瘤(图2a)，但无法根除转移，仅适度延长移植EMT6原位肿瘤小鼠生存(图2b)。相反抗CTLA-4检查点抑制增强总体生存但仅暂时延缓原发肿瘤生长。单独任一疗法均无总生存提升，但SWCNT-ANXA5增强光热疗法联合抗CTLA-4检查点抑制改善总生存，肿瘤接种100天后达55%生存率。

治疗后流式细胞术分析脾脏效应细胞揭示联合光热疗法和检查点抑制改善生存潜在机制。小鼠接种EMT6按前述处理。治疗2周后处死小鼠，定量多种免疫效应细胞类型百分比和相对数量。评估辅助T细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)单核细胞、FoxP3调节性T细胞、巨噬细胞群体(附件Fig.S3)。分析显示仅接受光热疗法和抗CTLA-4检查点抑制联合治疗组与对照组存在显著差异。联合治疗组观察到辅助T细胞(CD4⁺)和细胞毒性T细胞(CD8⁺)相对数量增加(图2c, d)。CD4⁺和CD8⁺细胞计数增加与解剖观察脾脏体积显著增大相关。

除脾脏效应细胞流式分析，PTT后7天测定血清细胞因子浓度阐明抗肿瘤免疫机制。促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平见图3。单独SWCNT或抗CTLA-4处理均未显著提高细胞因子水平 vs 未处理对照。但单独PTT显著增加TNF-α。进一步添加抗CTLA-4至PTT显著增加TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。

SWCNT-ANXA5生物分布与毒性

光热疗法增强给药后SWCNT-ANXA5各器官生物分布通过组织裂解液SWCNT荧光定量相对标准品监测(附件Fig.S4)。健康小鼠静脉注射1.2 mg/kg SWCNT-ANXA5后4个月靶器官生物分布追踪(图4a, b)。对比按前述注射方案EMT6肿瘤负荷小鼠给药后SWCNT-ANXA5富集情况，于给药后3 h测定(即治疗研究中光热疗法实施时间)。4个月器官收获前监测小鼠身体副作用和异常行为。注射SWCNT-ANXA5小鼠期间未观察副作用。研究结束时苏木精-伊红染色石蜡切片器官病理检查未观组织学毒性(附件Fig.S5)。

讨论

本文数据支持靶向光热疗法联合免疫检查点抑制治疗转移性乳腺癌有效性。此现象称"旁观效应"，描述局部放射引发抗肿瘤反应抑制远离原发靶点肿瘤生长能力。早至1950年代研究者观察到局部肿瘤照射对远处肿瘤显著影响[22]。研究确立旁观效应全身性源于宿主免疫反应[23,24,25]。γ照射是大多数旁观研究焦点，但越来越多工作证明光热疗法也可诱导旁观效应。多研究证实热消融联合检查点抑制剂抗CTLA-4产生增强免疫反应[16,26,27,28,29]。我们在EMT6乳腺癌模型观察到靶向光热消融联合抗CTLA-4阻断类似旁观反应。

图2a, b数据阐释旁观效应。原位EMT6肿瘤生长快、PTT治疗时已转移。故单独PTT处理小鼠虽原发肿瘤完全消融，生存仅略高于未处理对照。单独抗CTLA-4延缓肿瘤生长 vs 对照，生存延至68天但未治愈。Jure-Kunkel等给抗CTLA-4观察到类似EMT6肿瘤生长延缓[30]。PTT联合抗CTLA-4组55%小鼠接种100天后存活，推测治愈。

流式细胞术定量脾脏免疫效应细胞群体评估抗肿瘤免疫机制。vs 单独PTT或抗CTLA-4，联合疗法导致辅助CD4⁺ T细胞7倍增加、细胞毒性CD8⁺ T细胞3倍增加，均高度统计显著(p<0.005)。结果进一步证明光疗联合T细胞共刺激免疫检查点抑制潜在旁观反应。

CD4⁺和CD8⁺细胞计数增加与解剖观察脾脏增大相关。脾脏含多种细胞类型，最常见CD4⁺、CD8⁺、B细胞系[31,32]。虽本工作未探讨，预期B细胞计数随CD4⁺、CD8⁺ T细胞增加[33]。辅助CD4⁺ T细胞通过细胞因子刺激和直接细胞间相互作用协助体液免疫。细胞毒性CD8⁺ T细胞直接杀伤肿瘤细胞。CD4⁺和CD8⁺计数增加提示全身旁观免疫反应。

联合治疗后小鼠血清促炎细胞因子水平增加(图3)进一步支持全身旁观免疫反应存在。TNF-α激活肿瘤相关巨噬细胞呈抗肿瘤效应[34,35]。IFN-γ在肿瘤监视中重要[36,37]。IL-6促进巨噬细胞和淋巴细胞增殖[38]。PTT联合抗CTLA-4后7天小鼠血清这些效应分子显著增加进一步支持抗肿瘤免疫反应存在。

接受SWCNT小鼠照射结束时平均最高肿瘤温度54°C(图1)，足以完全消融肿瘤。此温度在45–60°C酶失活和线粒体损伤范围内[39]。生理盐水对照组肿瘤温度维持40°C以下，治疗获益极小[39,40,41]。

观察SWCNT-ANXA5浓度主要富集于肝、心、脾、肾、肺和肿瘤(图4a)。EMT6肿瘤小鼠SWCNT-ANXA5浓度与肝、肾相似(图4a, b)。脑、大肠、小肠检测微量SWCNT-ANXA5。注：基于注射剂量百分比(ID)SWCNT生物分布与靶组织SWCNT绝对浓度相关性差。主要因器官重量差异。给定ID%在小器官对应高浓度，大器官对应低浓度。按SWCNT浓度比较显示肾脏浓度最高，其次肝、脾(图4a)。

生物分布研究期间器官SWCNTs有降解证据(图4a, b)。基于巨噬细胞降解多壁碳纳米管前期发现[42]，器官SWCNTs降解预期。本研究SWCNTs平均直径0.8 nm、长度1500 µm。Zhu等[43]按长度直径分类碳纳米管脂质双层损伤毒性潜力，此尺寸属"生物学软"类，最小化细胞毒性，与小鼠实验未观副作用或组织病理毒性一致。

结论

本文展示新型组合治疗模式：SWCNT-ANXA5生物偶联物光热疗法联合抗CTLA-4检查点抑制，使侵袭性转移性乳腺癌小鼠获较高生存率。肿瘤血管靶向蛋白ANXA5将根除原发肿瘤所需系统给药SWCNT量最小化为低一次性剂量。有趣的是，尽管仅照射原发肿瘤，联合疗法仍提高转移癌小鼠生存。机制研究定量关键脾脏抗肿瘤效应细胞数显示仅双模联合增加CD4⁺辅助和CD8⁺细胞毒性T细胞。假设T细胞增加反映旁观反应，抗肿瘤效应细胞抑制肿瘤转移。尽管给药4个月后器官仍检测到SWCNTs，实验期间未观察副作用或明显组织毒性。