磁赤铁矿纳米颗粒作为纳米酶，改善甘蓝型油菜的生长和非生物胁迫耐受性

背景

粮食安全至关重要，也是我们不断变化的世界面临的紧迫问题。不断变化的气候和不断增长的人口正在引导植物科学家和农业工程师创新改进工具，以确保对环境影响较小的粮食生产。纳米技术就是这样一种新颖的工具，可以探索解决这个长期存在的问题 [1,2,3]。预计纳米技术将成为食品生​​产链的重要组成部分，例如在作物保护 [4,5,6]、肥料 [7, 8]、生物传感器和精准农业 [9]、以及食品包装和安全 [10]。纳米粒子在自然界中无处不在，植物已经进化到暴露于各种纳米粒子 [11]。氧化铁纳米粒子 (ION) 是天然存在的纳米粒子的重要组成部分 [12]。有证据表明植物和土壤微生物会产生离子 [11, 13, 14]。虽然一些研究人员一直关注工程化离子对植物的毒性 [15, 16]，但其他人则关注使用离子作为肥料的可能性 [17,18,19,20,21,22]。磁铁矿 Fe3O4 和磁赤铁矿 γ-Fe2O3 结构的磁性纳米粒子已被认为是具有过氧化物酶模拟能力（低 pH 值）和过氧化氢酶模拟能力（中性 pH 值）的有效纳米酶 [23,24,25]。已经表明，在某些浓度下，与添加等量的螯合形式的亚铁离子相比，纳米氧化铁可促进植物生长 [17]。我们假设纳米氧化铁的酶促能力可以刺激植物的生长，而不仅仅是铁施肥。此外，我们建议这应该有助于植物在干旱等常见非生物胁迫下，其中过氧化氢酶和过氧化物酶对于清除释放的活性氧 (ROS) 变得重要。在这里，我们对生长在土壤和受控环境中的 γ-Fe2O3 和油菜进行了研究以检验这一假设。

结果

粒子对植物性状的影响

通过添加离子，与仅添加足量螯合铁相比，我们提高了油菜的生长速度。与对照相比，叶片长度在统计学上显着增加，表明细胞分裂或细胞伸长增加（图 1a）。在植物遭受干旱之前，通过 SPAD-meter 测量的叶绿素含量在统计学上显着增加，表明与对照相比，这些植物的适应性增加（图 1b）。

在用养分或含有离子的养分灌溉的土壤中生长的植物的不同生理参数。 一 从离子处理前到 5 天后，单叶长度增加 (n =16, p 值 =0.053）。 b 叶片中的叶绿素含量，用 SPAD 测量 (n =16, p 值 =0.000）。不同字母表示差异有统计学意义

失水没有显示出统计学上的显着差异，但在离子处理中存在更大的保水趋势（图 2a）。鲜重，也考虑到植物的生长，总是显示出更高的离子处理值（图 2b），并且在某些情况下具有统计学意义。例如，可以在图 3 中看到一项延长干旱的实验。

干旱胁迫后的植物参数。 一 构成水的植物重量的百分比。 b 干旱 5 天后的植物生物量 (n =8, p 值 =0.127）。不同字母表示差异有统计学意义

植物的鲜重，在干旱 5 天后测量。 15 个生物学重复和 p 的统计学显着差异 值 0.01

考虑到对照组也有足够的铁，鲜重的巨大差异将是例外。观察到用离子处理的植物在干旱期间比对照更好地应对并且在再浇水后恢复更好（图 4）。

干旱胁迫 5 天后重新浇水的植物照片。 一 对照植物用营养液灌溉。 b 用含有 0.8 毫克/毫升离子的营养液灌溉植物。 c 用含有 2 mg/ml 离子的营养液灌溉的植物

离子对叶片过氧化氢浓度的影响

将离子添加到用于浇水的营养液中时，干旱后叶片中过氧化氢的含量显着减少。 0.8 mg ml ⁻¹ 的变化很大 治疗;因此，与其他处理的差异在统计上不显着。然而，对照和最高浓度 2 mg ml ^-1 之间的差异 具有 p 的统计显着性 0.004 的值，对照处理的平均值高 84%（图 5）。

用含有 ION 的营养液处理并在干旱条件下挑战 5 天的油菜每克叶组织中可溶性过氧化氢的量 (n =16, p 值 =0.004)

离子对脂质过氧化的影响

以 MDA 水平为代表的脂质过氧化通过添加 ION 降低，添加 200 mg ION 的植物叶片中的 MDA 平均浓度降低了 36%。我们添加了具有相同摩尔浓度的铁 (III) 离子的阳性对照；然而，变化太大，无法得出任何结论。较低离子浓度的平均值也低于对照，表明油菜叶中脂质过氧化减少的趋势（图 6）。

含 IONs 营养液和干旱 5 天的油菜叶片中脂质过氧化产物 MDA 的浓度 (n =8, p 值 =0.052)

植物颗粒吸收

为了研究叶片组织对颗粒的吸收，我们使用电感耦合等离子体原子发射光谱 (ICP-AES) 测量了叶片的铁含量。事实上，在磁赤铁矿纳米颗粒处理中观察到铁的统计学显着增加。有趣的是，在用多余的铁 (III) 离子灌溉的叶子中，铁的浓度降低了（图 7）。

与使用相同营养液或具有 1:1 M 铁 (III) 离子比例的相同营养液的对照相比，用磁赤铁矿纳米颗粒处理后芸苔属植物叶片中的铁浓度。不同的字母表示统计学上的显着差异（n =15)

为了进一步证实铁含量增加作为颗粒吸收的证据，我们测量了相同叶片的低温磁化强度。在强磁场下对照观察到更大的磁化强度，但在没有磁场的情况下，磁赤铁矿纳米颗粒处理的叶子的剩余磁化强度更大（图 8 和 9）。由于样本量小且变异大，差异在统计上并不显着，但趋势清楚地表明存在超顺磁性离子，因为在高磁场下控制磁化强度较高，但在没有磁场时较低。它因变化而变得模糊，但在某些样品中，离子的存在清晰可见（附加文件 1：图 S2）。一方面，在足够低的温度和足够高的磁场下，铁离子的磁化强度将大于亚铁磁性离子的磁化强度。另一方面，在相同低温但零磁场的情况下，由于纳米粒子磁矩受阻，离子的剩磁会更大。

与对照植物相比，用磁赤铁矿纳米粒子处理的植物灰化叶的低温 (2 K) 磁化。误差条显示平均值的标准误差 (n =6)

不同磁场下灰化叶的低温 (2 K) 磁化。上图在 10000 Oe 处有 p 值为 0.8，下面的零场图具有 p 值 0.08 (n =6)

材料特性

通过崔等人的方法产生的离子。 (2013) 形成了凝胶，表明成功生产了约 1-10 s nm 的纳米颗粒。将干燥的凝胶研磨成粉末。低分辨率扫描电镜无法显示单个颗粒，但粉末的层次结构明显；样品的 EDS 没有检测到任何 Y，只有铁（图 7）。

当分散在水中时，颗粒形成聚集体，流体动力学尺寸高达 500 纳米，但 84% 的聚集颗粒小于 300 纳米，至少 11% 小于 50 纳米。在绝对值上，根据 Nanosight 测量，有 4.28 × 10 ⁶ 小于 20 纳米的粒子 ml ⁻¹ ，在测量所需的 50 倍稀释分散体中（图 8）。反过来计算，这意味着大约有 2 × 10 ⁸ 小于 20 纳米的粒子 ml ⁻¹ 在治疗中。

由 AFM 制作的图像显示出与 NTA 结合 XRD 类似的图案，粒度从几纳米到几百纳米不等（图 9）。

颗粒的 XRD 在生产后 1 年获得，仍然显示出清晰的磁赤铁矿结构模式，这是成功稳定磁赤铁矿的证据（图 10）。使用谢勒方程计算出微晶尺寸为 3.8 纳米。尽管结构是守恒的，但按重量计引入 13% 的 Y 当然会影响原子的振动状态（附加文件 1：图 S3）。

钇定向溶胶-凝胶合成γ-Fe2O3的扫描电子图像及同种材料的EDS谱

讨论

之前已在其他系统中研究过将 ION 用作铁肥的提议 [17,18,19]。在这项调查中，首次测试了类似肥料是否存在酶促作用，以及向重要作物物种提供微量营养素铁的作用。对照组给予足量的螯合铁。我们还测试了阳性对照，其中向阴性对照补充了等摩尔量的铁 (III) 离子和足量的植物可利用铁。因此，在我们的实验中看到的 ION 的积极影响源于 ION 的特性。我们想表明是 ION 的已知酶促作用起作用 [23, 25, 26]。仍然不能排除其他机制——离子还可以与蛋白质、脂质和其他生物分子相互作用 [27]，或者纳米颗粒可能将天然铁离子吸收到表面上，从而减少有害的芬顿反应。在 ION 处理中叶子的过氧化氢水平降低的事实本身就是纳米颗粒吸收的间接证据。随着铁浓度的增加和磁赤铁矿磁化强度的变化，图片变得更加完整。含铁 (III) 离子的阳性对照叶片中铁含量浓度降低，表明植物具有降低铁离子吸收作为防御机制的能力。这进一步表明，磁赤铁矿处理中叶子中铁浓度的增加确实是纳米颗粒，其对植物的毒性不如铁离子水平升高。磁性测量显示出超顺磁性行为并在低温下阻止纳米颗粒磁矩，这是用磁赤铁矿处理过的叶子中非常小的 γ-Fe2O3 的典型特征 [28]，清楚地证明了纳米颗粒的吸收。施用的微量 Y 不应对植物产生任何影响；关于 Y 对植物的影响知之甚少，但 Fu 等人。 (2014) 确定 2 mg L ⁻¹ Y 是水培系统中的中位致死剂量 (LD50)，Maksimovic 等人。 (2014) 在 10 ⁻⁵ 开始看到毒性作用 mol L ⁻¹ 是 [29, 30]。在我们实验中使用的最高浓度中，大约 50 毫克 (5.6 10 ⁻⁴ 通过灌溉向土壤中每盆添加 mol) Y，预计只能从中吸收一小部分。被吸收的物质不应作为离子容易获得，而是结合在磁赤铁矿颗粒中。在合成中引入 Y 的目的是降低磁赤铁矿纳米颗粒的溶解度，并防止转化为赤铁矿，这是一种酶促形式较低的氧化铁。毫无疑问，在压力条件下增加过氧化氢酶活性是有益的 [31]，因为已知各种压力条件会导致 H2O2 的毒性积累 [32]。此外，越来越明显的是，H2O2 还可以作为压力的信号分子 [32, 33]。生物质产量的增加还有待证实，最好还研究油籽产量和质量。其他特征，例如叶子生长速度的提高，这是在与杂草竞争至关重要的农业环境中的一个非常好的特性，可以很容易地考虑在内。它已在拟南芥中显示 纳米零价铁颗粒可以诱导质子挤出到叶子的质外体中，从而允许膨胀驱动的细胞壁膨胀 [34]。在根中也观察到了同样的效果，这在干旱胁迫期间也可能是有益的 [35]。他们还观察到叶子的气孔开口增加，这可能导致水分流失，但当他们测量时，与对照相比只有微小的差异。一个众所周知的悖论是气孔开放和水分蒸腾之间的关系不是线性的 [36]。这种关系也受到环境的高度影响，例如相对湿度或风 [37]。虽然，零价纳米粒子当然不能被视为与磁赤铁矿相同，但必须研究在我们的实验中看到的叶片伸长机制。加法里扬等人。 (2013) 和我们一样观察到，与完全不含铁的阴性对照相比，添加 ION 后叶子中的叶绿素浓度增加。当它们与螯合铁相比时，没有区别。然而，添加等量的螯合铁作为离子将导致更多的植物可用铁，因为在颗粒的情况下，大部分铁储存在晶体结构中。因此，有可能植物只用离子施肥，而这些植物实际上缺铁。当离子作为螯合铁的辅助添加物时，我们发现叶子中的叶绿素含量更高（根据 SPAD 测量，见图 1）。当我们添加离子时，我们还测量了干旱后叶子中过氧化氢和 MDA 的含量减少。瑞等人。 (2016) 没有测量过氧化氢，而是测量 MDA 和与氧化应激相关的酶。他们认为添加 ION 不会产生氧化应激，事实上，他们确实发现，与螯合铁相比，10 mg kg ^-1 叶片中的 MDA 量减少了 专注。在根部，随着离子浓度的增加，他们发现 MDA 减少。与螯合铁相比，他们还测量了减少的超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性，这表明我们关于 ION 可以在体内作为活性氧清除剂的假设可能是正确的。我们测量的欧洲油菜叶子中过氧化氢的减少进一步证明了活性氧清除 .这解释了在添加离子后观察到的抗旱性增加。

结论

我们的实验为离子作为纳米酶在植物中的作用机制提供了证据 ，揭示了欧洲油菜叶片中过氧化氢含量降低之间的耦合 和离子的引入。添加离子后观察到的抗旱性增强可能与缓解氧化应激有关。

方法

实验条件和设计

甘蓝型油菜 春季油菜品种 Larissa（斯堪的纳维亚种子 AB，瑞典利德雪平）的种子在琼脂平板上灭菌和发芽 3 天，然后将相似大小的幼苗转移到具有灭菌 S-Soil 的盆（Hasselfors 花园，Örebro，瑞典） .这是一种适合幼苗专业生长的土壤，含有少量的所有宏观和微量营养素、用于通气的珍珠岩、促进生长的腐植酸和 pH 值为 6。让植物在盆中生长 7 天，并用去离子水浇灌水。在开始处理之前，将植物分布在托盘之间，以便植物大小尽可能一致。从第 7 天开始，在转移到盆中后，用营养液、含有额外 FeCl3 的营养液或不同浓度的 γ-Fe2O3 离子的营养液对植物进行灌溉。每个盆每天用 40 毫升灌溉。植物在具有 16 小时光照 (180 μE m ^-2 s ⁻¹ ) 和 8 小时的黑暗。照射期间温度设置为 25°C，黑暗期间设置为 22°，相对湿度为 65%。植物生长在 8 × 8 cm 的盆中，每个盆中装有八个盆。每个处理有两个托盘和 16 个生物学重复。托盘每天以轮换顺序移动，以补偿腔室中的任何变化。治疗持续 5 天，添加总共 200 毫升的 0.5、0.8、1 或 2 毫克毫升 ^-1 ，分别为每株植物 100、160、200 或 400 毫克。在添加 ION 5 天后，所有处理都用营养液浇水（附加文件 1：表 S1），在开始干旱 4 天之前再浇水 5 天。干旱 4 天后，进行过氧化氢和脂质过氧化测量，并再次用相同的营养液浇灌植物 3 天以研究恢复情况。实验重复四次。

纳米粒子合成与表征

磁赤铁矿颗粒是根据 [38] 的方法生产的，含有约 13% 重量的钇 (Y)，并通过 X 射线衍射 (XRD)、扫描电子显微镜 (SEM)、纳米颗粒跟踪分析 (NTA)、红外光谱表征(FTIR)、热重分析 (TGA) 和原子力显微镜 (AFM)。 SEM 图像使用 Hitachi TM1000 和 Oxford μDeX 电子色散 X 射线光谱仪 (EDS) 采集。在 Nanosight 300 上通过纳米跟踪分析 (NTA) 测量流体动力学尺寸（图 11）。使用 Perkin-Elmer Spectrum 100 对溴化钾 (KBr) 丸粒进行傅里叶变换红外光谱 (FTIR)。对于热重分析 (TGA)，使用 Perkin-Elmer Pyris 1，对于原子力显微镜 (AFM)，使用 Bruker FastScan（图 12）。 XRD 在配备钼源的 Bruker Smart ApexII 多用途衍射仪上进行；使用 2θ° 角 16,197 处的最大峰和 Origin 软件峰值查找器功能计算的半峰全宽 (FWHM) 为 1.01358489355378，使用谢勒方程计算微晶尺寸（图 13）。干燥的离子悬浮在营养液中，含 3.4 mg L ^-1 螯合铁，与对照相同。有关所有营养素的完整列表，请参阅附加文件 1：表 S1。

通过钇定向溶胶-凝胶合成合成的 γ-Fe2O3 在水中的流体动力学粒度分布，由 NTA 测量。数值为四次重复测量的平均值，细线内的区域代表平均误差

通过钇定向溶胶-凝胶合成的磁赤铁矿纳米颗粒，分散在硅片上并用 AFM 成像。相同的图像以 3D 和 2D 表示

产生的磁赤铁矿纳米颗粒的粉末衍射图。峰与数据库中标准磁赤铁矿的位置对齐，被视为图底部带有垂线的点。从 16.197 2θ 处的最大峰计算微晶尺寸 度角

植物性状测量

在开始处理之前，测量每株植物上最长叶的长度，即第一片真叶。后来，在用 ION 在营养液或单独的营养液中连续灌溉 5 天后，再次测量同一片叶子。结果报告为百分比增加。在处理之前和之后以及随后在干旱之后，通过使用 Minolta SPAD-meter 的 SPAD 测量评估叶叶绿素。对每株植物的两片叶子进行三次测量，对 16 个生物重复中的每一个进行平均。最后称取所有植物的地上生物量，放入铝箔中，110℃烘干72h。

铁含量和磁性测量

干旱五天后，实验结束，所有地上植物组织在 450°C 下灰化 24 小时。在灰被均质化后，每个样品称取 10 毫克，并在摇床上溶解在 3 毫升 36% 的盐酸中过夜。然后，将样品用 44.74 ml 10% 乙醇的 Milli-Q 水溶液稀释，随后使用 ICP-AES 在 238.204 nm 处测量铁含量。对于磁性测量，将相同的灰分放入样品架中，并用精密天平称出每个样品的准确重量。然后，将样品冷却至 2 K，并在超导量子干涉仪 (SQUID) 磁力计上进行从 10,000 到 0 奥斯特的磁场扫描。在用样品中铁的重量进行归一化之前，从测量的磁矩中减去由样品架引起的磁矩。

过氧化氢测量

叶子中的过氧化氢通过[39]报道的eFOX方法测量。将 16 株植物合并为四个生物重复，每个重复 4 株。从每株植物最年轻且仍然新鲜的叶子中取出 50 毫克。然后，将 200 毫克叶子材料在液氮中的预冷研钵中磨成粉末。我们向粉末中加入 4 毫升 100 mM 磷酸盐缓冲液 (pH 6.9) 并将冰磨成均匀的液体。从这种均质液体中，我们将 1900 微升转移到 2 毫升 Eppendorf 管中，并添加 20 微升 25 mM 硫酸亚铁铵（莫尔盐）、20 微升 10 mM 山梨糖醇、20 微升 10 mM 二甲苯酚橙、290 微升% 乙醇和 20 μl 250 mM 硫酸。每个样品都采集了完整的可见吸收光谱，但使用 550 和 800 nm 之间的差异进行过氧化氢定量。使用 R 制作了 2 到 40 μM 过氧化氢的校准曲线 ² 值 0.9946。

脂质过氧化

根据[40]的方法测量脂质过氧化。以与过氧化氢测量相同的方式收集样品，不同之处在于它们在 4 ml 0.1% w 中均质化 /v 三氯乙酸 (TCA)。在 532 nm 处测量吸光度，并通过减去 600 nm 处的吸光度来校正非特异性浊度。 155 mM cm ⁻¹ 的消光系数 用于计算丙二醛浓度（MDA）。

统计分析

所有统计均在 Minitab 17 软件中进行。所有数据都通过单向方差分析和 Fisher 检验进行分组。学生的t 执行测试以找到特定的 p 发现组间值具有统计学显着差异。