工程纳米颗粒暴露下海洋浮游植物的钙介导胞外聚合物释放

摘要

工程纳米颗粒（ENPs）正迅速融入消费品中，但其对海洋生态系统的影响仍知之甚少。本研究考察了四种硅藻——Odontella mobiliensis、Skeletonema grethae、Phaeodactylum tricornutum 和 Thalassiosira pseudonana——以及一种绿藻 Dunaliella tertiolecta 对三种模型 ENPs（25 nm TiO₂、10–20 nm SiO₂ 和 15–30 nm CeO₂）的响应。SiO₂ ENPs 使胞外聚合物（EPS）分泌量放大 200–800%，而 TiO₂ 诱导的 EPS 释放最低。同时，细胞内 Ca²⁺ 浓度在 ENP 暴露后显著升高，表明存在 Ca²⁺ 依赖性分泌途径。阐明这一机制为制定策略以减轻 ENPs 在海洋环境中潜在的生态风险奠定了基础。

研究背景

尺寸在 1–100 nm 范围内的工程纳米颗粒（ENPs）是油墨、涂料、化妆品和药品等产品的重要组成部分。2017 年美国纳米技术资金达 14 亿美元，反映了该领域的快速增长 [1–3]。随着 ENPs 不可避免地进入水体系统，其高表面活性引发了对活性氧（ROS）生成及其他毒理学效应的担忧 [5–6]。作为海洋初级生产者的浮游植物已显示出对 ENPs 的敏感性，并有记录表明其生长和存活受到不利影响 [7–11]。然而，浮游植物对不同 ENPs 的细胞响应尚未完全明确 [12–21]。浮游植物常产生胞外聚合物（EPS），这是一种由多糖和蛋白质组成的复杂阵列，介导生物膜形成、金属螯合及抗环境胁迫 [22–27]。EPS 分泌常为应激响应，钙（Ca²⁺）信号被认为在调控硅藻 EPS 释放中发挥作用 [28–31]。尽管 ENPs 可扰动细胞内 Ca²⁺ 通路 [29,32–34]，但尚无关于 TiO₂、SiO₂ 或 CeO₂ 诱导的 Ca²⁺ 介导 EPS 分泌的系统性评估报道。

结果与讨论

ENPs 表征

动态光散射（DLS）显示 TiO₂ 颗粒主要为 25 nm，SiO₂ 为 10–20 nm，CeO₂ 为 15–30 nm（图 1）。高达 70 nm 的少量亚群可能源于聚集。这些测量结果确认了制造商规格，并保证了实验间的一致性。

ENPs 诱导细胞内 Ca²⁺ 升高

Fluo-4AM 成像显示，1 mg/mL SiO₂ 使细胞内 Ca²⁺ 增加 50–300%，CeO₂ 增加 150–200%，TiO₂ 仅增加约 40%（所有测试物种均如此，图 2）。TiO₂ 仅引起微弱的 Ca²⁺ 变化，可能反映了其显著的细胞毒性和相关的细胞死亡 [37–39]。这些结果确立了不同 ENPs 能引发物种特异性的 Ca²⁺ 信号，这是下游 EPS 分泌的前提条件。

ENPs 诱导的 EPS 释放

采用酶联凝集素测定法（ELLA），以总基因组 DNA 为标准量化 EPS 分泌。SiO₂ 在 Skeletonema grethae 中刺激 EPS 释放高达 1,000%，在 Phaeodactylum tricornutum 中达 900%，其余物种增加 500–800%（图 3）。TiO₂ 仅在 Skeletonema 和 Phaeodactylum 中触发显著的 EPS 分泌，这与其有限的 Ca²⁺ 响应相呼应。CeO₂ 对各分类群的影响较温和。EPS 释放量与观测到的 Ca²⁺ 升高幅度呈强相关，强化了 Ca²⁺ 依赖性分泌模型。

结论

本研究表明，工程纳米颗粒，尤其是 SiO₂，能在海洋浮游植物中诱发显著的、Ca²⁺ 介导的 EPS 分泌。这种响应因物种和纳米颗粒类型而异，凸显了纳米材料-生物相互作用的复杂性。未来研究应将这些发现扩展至天然海水基质，并评估 EPS 动态改变的生态后果，如生物膜形成和污染物固存。

材料与方法

浮游植物培养物（Odontella mobiliensis、Dunaliella tertiolecta、Skeletonema grethae、Phaeodactylum tricornutum、Thalassiosira pseudonana）在 24 °C、14:10 h 光暗循环的 L1 培养基中生长。ENPs（TiO₂、SiO₂、CeO₂）经水中超声分散，重悬于过滤后的 L1 中，并用 DLS（Brookhaven BI-200SM）表征。细胞在 96 孔板中暴露于 ENPs（10 µg/mL–5 mg/mL）48 h；从上清液收获 EPS 并用 Concanavalin A-HRP 偶联物经 ELLA 定量。细胞内 Ca²⁺ 用 Fluo-4AM 染料在 Nikon Eclipse TE2000-U 下测定。DNA 含量经 ZR-96 Quick-gDNA 试剂盒提取后用 NanoDrop 测定。统计分析用 GraphPad Prism，报告至少三次独立重复的均值 ± SD。