介观四（对磺基苯基）卟啉对半胱氨酸包覆的 CdSe/ZnS 量子点发光的刺激

背景

胶体半导体纳米晶体或量子点 (QD) 由于其特殊的特性、强烈的宽吸收和窄的发光光谱，具有与尺寸相关的最大位置以及高的热和光稳定性 [1, 2]，在现代技术的各个领域中得到应用，例如如医学成像和诊​​断、现代计算纳米设备、用于生物分析应用的荧光探针、光电化学制氢等（[3,4,5,6,7] 和其中的参考文献）。用有机分子对 QD 表面进行功能化可以增加它们在水中的溶解度，降低它们的毒性，并增加它们的生物相容性，制备对生物体所需结构具有选择性亲和力的 QD [8]。因此，QD 在生物学 [5] 和医学 [6] 中的应用引起了特别的兴趣，它们可以成功地用作荧光诊断 (FD) [9] 的荧光探针 (FP) 和光化学疗法 (PCT) 的光敏剂 (PS) [10]。宽光谱区域的强烈吸收使 QD 成为光能积累的有效天线，而强烈的窄发光带有利于能量转移到相应的 PS，从而提高光能利用效率，从而提高 PS 效率 [7, 11] .这使得(QD+PS)对有望应用于FD和PCT，并促进了QD和FS相互作用的研究，特别是它们之间的能量和电荷转移。

其中，半胱氨酸涂层 (CdSe/ZnS) QD ((CdSe/ZnS)-Cys QD) 和 meso -tetrakis (p-sulfonato-phenyl) porphyrin (TPPS4) 由于以下原因引起了特别的兴趣：小尺寸的半胱氨酸包被的 QD (QD-Cys) 增加了它的流动性和穿透细胞膜的可能性，它的高化学稳定性、低非特异性吸附和高发光量子产率 [12, 13]。另一方面，合成的 TPPS4 卟啉是一种很有前景的 PS，因为它具有光活性、水溶性和无毒特性，并且已经在临床上在光动力疗法 (PDT) 中的应用中进行了测试，显示出有希望的特性 [14, 15]。

TPPS4 和 QD 之间通过能量和/或电荷转移的相互作用已经被记录[16]。通常，这些过程伴随着 QD 发光强度和寿命的降低。导致量子点发光自淬灭的另一个过程是通过静电相互作用或氢键形成的自聚集，在许多情况下，使聚集过程可逆[17]。

在这项工作中，我们首次以(CdSe/ZnS)-Cys QD和TPPS4卟啉为例，通过与卟啉的相互作用来刺激QD发光。

实验

(CdSe/ZnS)-Cys 量子点的制备

(CdSe/ZnS)-Cys QD 根据改编自 [18] 的方法合成。该方法包括以下内容：(1) 胶体疏水性 CdSe 核纳米晶体的合成和 (2) 在 CdSe 核周围生长外延 ZnS 壳。为了用半胱氨酸功能化量子点，通过三重分散在氯仿 (500 毫升) 中并用甲醇 (800 毫升) 沉淀，从 TOPO 中纯化得到的 CdSe/ZnS 核-壳量子点 (~ 3.0 毫克)。将纯化的 QD 重新分散在氯仿 (1.0 mL) 中。 DL-半胱氨酸的甲醇溶液（30 mg mL ^{− 1} , 200 mL) 滴加到 QD 分散体中并剧烈混合，然后离心（10,000 rpm，5 分钟），除去氯仿。在用甲醇洗涤以通过离心（16,000 rpm，10 分钟，3 次）去除过量的 DL-半胱氨酸后，QD 沉淀在真空下干燥并重新分散在含有 1 M NaOH (20 mL) 的 Milli-Q 水中添加并用注射器过滤器 Anotop 25 Plus（0.02 μm，Whatman）过滤。

卟啉 + (CdSe/ZnS)-Cys QD 样品的制备

TPPS4 卟啉是从 Mid Century Chemicals (USA) 获得的，无需额外纯化即可使用。实验溶液是在磷酸盐缓冲液（pH 7.3；7.5 mM）中制备的，使用 Milli-Q 质量的水。对于在 (CdSe/ZnS)-Cys QD 中保持在 276 K 3 个月（老化 QD）中的发光测量，将等分试样的浓缩 TPPS4 储备溶液（[TPPS4]stock =140 μM）添加到（CdSe/ZnS）- Cys QD 初始溶液，避免稀释效应。对于老化的 QD 稀释实验，初始溶液的等分试样被等量的磷酸盐缓冲液代替。所有实验均在室温 (297 K) 下进行。

TPPS4的浓度使用ε515nm =1.3 × 10 ⁴ 通过分光光度法控制 M ^{− 1} cm ^{− 1} [19]。使用 ε 使用 520 nm 处的第一个激子吸收峰计算老化 (CdSe/ZnS)-Cys 量子点的浓度 =5857(D ) ^2.65 根据 Yu 的经验计算 [20]，其中 D (nm) 是给定纳米晶体的直径。 D 值由曲线的经验拟合函数确定，如 [20] 中所示。对于 CdSe 纳米晶体，该函数为：

在我们的例子中，λ =520 纳米，D =2.6 纳米，并且 ε =7.4 × 10 ⁴ M ^{− 1} cm ^{− 1} .

仪器

吸收光谱用贝克曼库尔特 DU640 分光光度计监测。在 Hitachi F-7000 分光光度计上在 λ 处进行稳态发光测量 ex =480 nm 和 λ em =558 nm。老化的 QD 发光量子产率 (QY) 是通过相对方法 [21] 用单点测量确定的，λ ex =480 nm 和 λ em =558 nm，使用 1-棕榈酰基，2-(12-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]dodecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine ( C12-NBD-PC) 作为标准品（QY =0.34 在乙醇中）[22, 23] 根据下式：

其中我 fl 和 I fl0 是 QD 和 C12-NBD-PC 的积分荧光强度，A 和 A 0 是它们在 λ 处的吸光度 ex =480 nm，并且 n 和 n 0 分别为所用溶剂的折射率。

使用基于时间相关单光子计数法的装置进行时间分辨实验。激发源是Tsunami 3950 Spectra Physics 钛蓝宝石激光器，由Millenia X Spectra Physics 固态激光器泵浦。使用 3980 Spectra Physics 脉冲选择器的激光脉冲重复频率为 8.0 MHz。调整激光器，使二次谐波发生器 BBO 晶体（GWN-23PL Spectra Physics）提供 480 nm 激发脉冲，该脉冲被引导至爱丁堡 FL900 光谱仪。光谱仪为L型配置，发射波长由单色仪选择，发射光子由冷藏滨松R3809U微通道板光电倍增管检测。仪器响应函数的半峰全宽 (FWHM) 通常为 100 ps，时间分辨率为每通道 12 ps。采用爱丁堡仪器公司提供的软件和商业“OriginPro9”软件拟合实验发光衰减曲线。

拟合的质量通过统计参数reduced-χ的分析来评价 ² 并通过残差分布的检验。

使用 NanoBrook 90Plus Zeta 粒度分析仪在 640 nm 激发下使用 40 mW HeNe 激光器（Brookhaven Instruments Corporation）测量动态光散射。

结果与讨论

正如 Liu 等人先前报道的那样，新鲜制备的 (CdSe/ZnS)-Cys QD 在 558 nm 处具有最大的发光光谱（图 1，黑线）。 [13] 和量子产率 (QY) 0.75 [2, 24, 25]。 TPPS4加入新鲜溶液后，QD发光强度和发光光谱分布均未发生变化。

(CdSe/ZnS)-Cys 558 量子点在 pH 7.3 的磷酸盐缓冲液 (7.5 mM) 中的归一化发光光谱：新鲜制备（黑线，λ max =558 nm），在没有 TPPS4 的情况下在 276 K（老化 QD）的冰箱中放置 3 个月后（红线，λ max =556 nm），并且将 [TPPS4] =5.0 μM 添加到老化的 QD（蓝线，λ max =559 nm), λ ex =480 nm

对于溶解在水中并在 276 K 冰箱中保存 3 个月（老化 QD）的 (CdSe/ZnS)-Cys QD，在 pH 7.3 的磷酸盐缓冲液 (7.5 mM) 中测量的发光光谱最大值的位置，蓝移了 2 nm (λ 与新鲜 QD 相比，max =556 nm)。发射带出现加宽且略微不对称（图 1，红线）。由上述方法测定的老化QD发光量子产率为0.23 ± 0.03。

在老化的 QD 溶液中添加 TPPS4 导致发光强度显着增加（图 2a），QY 值达到 0.75 ± 0.08（图 2a，插图），该值接近新鲜 QD 的值 [2, 24, 25 ].

一 老化 (CdSe/ZnS)-Cys 558 QD（[QD] =570 nM，黑色曲线）溶液的发光光谱和量子产率（插图）作为 TPPS4 卟啉浓度的函数。 b QD 发光的衰减动力学和 \( {I}_{0_3}/\left({I}_{0_2}+{I}_{0_3}\right) \) 比率（插图，参见方程（3） ) 作为 TPPS4 卟啉浓度的函数

此外，在TPPS4存在下，观察到老化QD发光带的对称化及其带宽的减少，伴随着最大红移至λ max =559 nm，接近新鲜 QD 光谱的最大值（图 1，蓝线。）。

在 480 nm 激发下获得的新鲜和老化 QD 溶液的发光衰减曲线依次拟合为三个指数的总和：

$$ I={I}_{0_1}{e}^{-t/{\tau}_1}+{I}_{0_2}{e}^{-t/{\tau}_2}+{I }_{0_3}{e}^{-t/{\tau}_3} $$ (3)

其中 \( {I}_{0_i} \) 和 τ 我 是 i 的指数前因子（幅度）和寿命 -th 衰变分量。

新鲜和老化 QD 的组件寿命与卟啉的存在无关（表 1）。新鲜 QD 溶液的发光寿命对于 (CdSe/ZnS)-Cys QD 来说是典型的 [26, 27]。对于老化的 QD，组件寿命要短得多（表 1）。

<图>

τ 的值 1 在所有情况下，在存在和不存在卟啉的情况下，新鲜和老化的 QD 接近本研究中使用的单光子计数设备 (≈ 100 ps) 的时间分辨率。因此，它应该与激发脉冲的散射光有关。

众所周知 [28,29,30] 短寿命 (τ 2）和长寿命（τ 3) 分量与 QD 核中电子-空穴湮灭产生的发光有关 (τ 2) 和壳 (τ 3) 分别。这两个分量的总强度表征了 QD 中的整个湮灭过程。在这种情况下，τ 的相对强度（幅度） 3 分量应该证明电子空穴湮灭在 QD 壳中的贡献。相对贡献I 衰减曲线的第 3 个分量的 3 计算为：

$$ {I}_3=\frac{I_{0_3}}{I_{0_2}+{I}_{0_3}} $$ (4)

将 TPPS4 添加到新鲜 QD 溶液中不会显着改变组分的相对含量（数据未显示），而对于老化的 QD 溶液，τ 的相对含量 3 组件 I 3 随 TPPS4 浓度增加（图 2b，插图）。 QY对老化量子点发光对TPPS4浓度的依赖性与I相似 3（图 2a，b，插图），两者都在大约 2.0 μM TPPS4 处达到最大值。这意味着与老化的 QD 相互作用的 TPPS4 对 QD 壳的发光影响比其核的发光更强。然而，新鲜 QD 溶液中的 TPPS4 对 QD 发光没有影响。因此，我们得出结论，在老化的 QD 溶液中观察到的 TPPS4 效应不能用卟啉与 QD 表面的结合来解释。

另一方面，在与 TPPS4 相互作用时观察到的老化 QD 发光强度的增加不能通过从 TPPS4 到 QD 的反向能量转移来解释，因为 TPPS4 荧光光谱位于范围 λ> 600 nm，其中 QD 吸收较弱（附加文件 1：图 S3）。因此，通过 Förster 共振能量转移 (FRET) 机制进行能量转移的可能性很小。此外，QD 发光在 460 或 480 nm 处激发，其中 TPPS4 光吸收可以忽略不计。此外，TPPS4 的吸收光谱在混合溶液中保持不变，表明 QD 和 TPPS4 之间没有电荷转移（附加文件 1：图 S4b、c）。

量子点通过在 QD 表面基团之间形成非共价 NH…H 氢键而聚集的能力已被记录 [13, 17]。聚集会降低 QD 发光，最有效地淬灭归因于 QD 壳的成分 [13, 17]。由于 3D 聚集体的形成，观察到固体薄膜中 CdSe-QD 的 QD 发光强度和寿命降低 [31]。作者提出了一个模型，其中这种减少与个体 QD 之间的能量转移有关 [32]。

根据这一证据，我们认为在冰箱中时，QD 会聚集，从而降低发光强度和寿命。因此，我们将在 TPPS4 存在下观察到的 QD 发光强度和寿命的增加与 QD 解聚相关联，由 TPPS4 在其与聚集体结合时刺激。在与氟离子相互作用时聚集 QD 的发射也观察到类似的效果 [17]。

观察到的老化 QD 发光带分布的变化（图 1）也可以通过 QD 聚集来解释，其不对称性与不同类型聚集体的存在有关。与 TPPS4 的相互作用减少了聚集并使发光带轮廓与在新鲜溶液中观察到的非聚集 QD 相似。

在中性 pH 值下，QD-Cys 表面由于其表面末端氨基的去质子化而具有负净电荷 [17, 33, 34]。在此 pH 值下，TPPS4 具有净电荷 (4-)，因为其结构中有四个带负电荷的磺酸盐苯基（[35, 36] 和其中的参考文献）。因此，由于静电排斥，QD 半胱氨酸基团与 TPPS4 分子之间的相互作用的可能性很小。然而，卟啉 π 共轭系统对金属表面的高亲和力已得到充分证明[37]。尽管 QD 和卟啉侧基之间存在静电排斥，但这种亲和力应该是 TPPS4 在量子点表面结合的原因。 QD 表面与结合卟啉的 π 共轭系统之间的相互作用可以解释卟啉荧光光谱的弱展宽（图 1、3 和附加文件 1：图 S3a，插图）和观察到的荧光激发光谱的变化（附加文件 1：图 S5b，插图）[38]。

在存在老化 (CdSe/ZnS)-Cys 558 量子点 (570 nM)、λ 的情况下，不同浓度 TPPS4 在磷酸盐缓冲液（7.5 mM，pH 7.3）中的标准化发光发射光谱 ex =460 nm

一些卟啉分子在 QD 表面的结合增加了 QD 表面的负电荷，从而增加了粒子之间的静电斥力并诱导了它们的解聚（方案 1）[39]。

老化 (CdSe/ZnS)-Cys 558 QD 和 TPPS4 卟啉在中性 pH 值下的相互作用方案。由于卟啉π共轭体系对金属表面的高亲和力，卟啉分子吸附在QD表面，增加了QD表面的净负电荷，从而增加了粒子之间的静电斥力并诱导其解聚

QD表面积A QD ≈ 145 nm ² 足以吸附几个 TPPS4 分子 (A TPPS4 ≈ 1.8 nm ² 每单位）[40]，正如观察到卟啉与磁性和金纳米粒子相互作用[41, 42]。

为了通过卟啉覆盖 QD 的整个区域，每个 QD 需要 80 个卟啉分子。然而，发光的饱和度 QY 和 I 在大约 [TPPS4] =2.0 μM 处观察到 570 nM QD 溶液中的 3 个值（图 2），这表明每个 QD 结合四个卟啉分子足以进行 QD 解聚。这可以通过与 QD（附加文件 1：图 S6）相比，卟啉分子上更大的电荷密度来解释，后者在 QD 与结合的卟啉之间产生更强的静电排斥。事实上，老化 QD (ζQD) 的 Zeta 电位为 - 36.1 mV，而 TPPS4 分子 (ζTPPS4) 的 Zeta 电位为 - 37.6 mV。单个老化 QD 的平均电荷密度，计算为 σ =ζ /AQD，为

σQD =− 36.1 mV/145 nm ² =− 0.25 mV/nm ² .

同时，对于与四个TPPS4分子结合的个体老化QD，平均电荷密度(σQD+TPPS4)为

σQD+TPPS4 =− (36.1 + 37.6 × 4) mV/145 nm ² =− 1.29 mV/nm ² .

因此，四个TPPS4分子与单个老化QD的结合使其σ增加了5倍以上，静电排斥力增加了25倍以上，并诱导了老化QD解聚。

根据 QD 聚合假设，在稀释老化 QD 溶液时应观察到与添加 TPPS4 诱导的效果类似的效果。实际上，我们已经观察到在稀释其缓冲溶液时 QD 发光的 QY 增加（图 4a，插图），这表明老化 QD-Cys 溶液中 QD 发光的自猝灭取决于 QD 浓度 [17] .同时，I QD 发光动力学中的 3 值也随着稀释而增加（图 4b，插图）。

一 老化 (CdSe/ZnS)-Cys 558 QD 溶液的发光光谱和量子产率（插图）与其浓度的函数关系。 b QD发光和I的衰变动力学 3 值（插图，见公式（3））与其浓度的函数关系

此外，动态光散射实验表明，老化后 QD 溶液中散射粒子的 Dhd 为（330±170）nm，远大于新鲜 QD 的 Dhd。稀释将 Dhd 降低到 (25 ± 6) nm，从而直接证明 QD 分解（附加文件 1：表 S1）。

这个问题还有一个更有趣的方面：​​在新鲜 QD 的溶液中加入 TPPS4 是否可以防止它们在低温储存过程中聚集，从而稳定它们的发光特性？然而，这个问题的澄清需要使用各种实验方法和不同的实验条件，如试剂浓度、温度、溶液储存时间（几个月）等进行独立和详细的研究。我们计划在最近的时间内实现这一深刻的研究。未来。

结论

根据获得的数据，我们可以断言，即使在低温下，CdSe/ZnS-Cys QD 在水溶液中的长期储存也会引起它们的聚集，从而降低发光量子产率和寿命。 TPPS4 卟啉的添加刺激了老化的 CdSe/ZnS-Cys QD 的分解，这通过 QD 发光量子产率的增加和 QD 壳中电子-空穴湮灭对总 QD 发光的贡献而显着。由卟啉刺激的分解是由于聚集的 QD 与带负电荷的卟啉分子结合时静电排斥的增加而发生的。在QD溶液稀释时也观察到解聚。

获得的结果证明了通过向溶液中添加一些分子或离子、刺激 QD 解聚并恢复其发光特性来修复老化 QD 的方法，这对于 QD 生物医学应用（如生物成像和荧光诊断）可能很重要。另一方面，解聚对于量子点在生物学和医学中的应用很重要，因为它减小了粒子的大小，促进了它们穿过细胞膜内化到活细胞中。

缩写

C12-NBD-PC：

1-棕榈酰基,2-(12-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]dodecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine

FD：

荧光诊断

FP：

荧光探针

FWHM：

半高全宽

PCT：

光化学疗法

PDT：

光动力疗法

附注：

光敏剂

QD：

量子点

QD-Cys：

半胱氨酸包被的量子点

QY：

量子产率

TOPO：

三辛基氧化膦

TPPS4 4 :

中观 -四（对磺基苯基）卟啉