低强度聚焦超声激活的靶向姜黄素纳米粒子实现卵巢癌pH响应诊疗一体化

摘要

本研究构建了一种简单通用的纳米平台：利用pH敏感铁蛋白纳米笼内核共载抗癌药姜黄素（Cur）和液态全氟己烷（PFH），外壳修饰肿瘤靶向分子叶酸（FA），命名为FA-FCP。FA-FCP平均粒径47 nm，在不同介质中理化性质稳定，体内外生物相容性和安全性高。在低强度聚焦超声（LIFU）和pH 5.0条件下，24 h药物释放率达53.2%。经4 min LIFU（7 W）照射，pH 5.0下FA-FCP显现超声造影成像能力。得益于FA受体介导的内吞作用，FA-FCP高效进入细胞并定位溶酶体。注射18 h后对肿瘤施以LIFU，获得造影超声图像。体内外实验证实FA-FCP联合LIFU显著抑制肿瘤。结论：FA-FCP结合外源LIFU与内源酸性微环境，具备强大诊疗一体化功能，为无创肿瘤诊疗提供新范式。

引言

卵巢癌转移性强、致死率高、早期症状不明显，确诊时常已高度转移。临床常规细胞减灭手术联合化疗，晚期患者5年生存率极低，亟需开发新型诊疗策略。近年兼具靶向治疗与成像诊断功能的纳米平台为肿瘤精准治疗提供新思路。

声响应纳米平台（ARN）广泛用于肿瘤诊疗研究，常设计为微泡（MBs）或纳米粒子（NPs）模式。相比微泡，NPs粒径更小、渗透性更强、药代动力学周期更长、稳定性更好、表面修饰更易。全氟戊烷（PFP）、全氟己烷（PFH）、全氟辛基溴（PFOB）等相变性液态全氟碳常用于实现声响应性。外源聚焦超声诱导声滴汽化（ADV）产生气泡甚至破裂，赋予ARN超声造影能力。PFP沸点低（29.2℃）易在体内气化引发气栓；PFOB沸点高（144℃）需超高强度超声触发相变。PFH沸点56℃，被认为是理想相变材料。但PFH疏水，需封装入纳米粒子实现水溶。目前脂质体、PLGA、有机介孔、有机聚合物等载体均有报道封装液态全氟碳，同时可载药实现化疗与声控释药。但此类纳米载体生物相容性仍是临床转化顾虑。近年来无铁铁蛋白纳米笼因内源性蛋白、显著pH敏感性，广泛用作药物递送载体：酸性环境下解离、碱性环境下重组，具高生物相容性和可控载/释药能力。

本研究以铁蛋白为载体共载PFH和Cur，表面修饰FA构建多功能纳米平台FA-FCP。姜黄素为天然多酚，抗癌效果好但水溶性差。FA-FCP提高PFH和Cur水溶性，生理稳定性好，生物相容性优。LIFU+pH 5.0下24 h释药率53.2%；4 min LIFU（7 W）下pH 5.0具造影成像能力；FA受体介导内吞高效入细胞并定位溶酶体；注射18 h后肿瘤部位LIFU照射显影；体内外实验证实显著抑瘤效果。非侵入性、配体/受体靶向、LIFU触发相变/爆破、精准释药等优势使FA-FCP成为极具前景的肿瘤诊疗一体化纳米平台。

材料与方法

材料

铁蛋白（FRT）、叶酸（FA）、全氟己烷（PFH）购自Sigma（美国）。姜黄素（Cur）购自阿拉丁（上海）。NH₂-PEG₂₀₀₀-FA和NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH购自西安瑞熙生物。EDC、NHS购自Thermo Fisher。CCK-8试剂盒购自Dojindo（日本）。DMEM、PBS、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国）。

FA-FCP制备

（1）10 mg FRT溶于10 mL水；10 mg Cur溶于0.3 mL DMSO；两液混合加1 mL PFH，pH 5.0条件下冰浴超声30 min；调节pH至7.4得Cur和PFH共载铁蛋白（FCP）。（2）FA共价修饰：上述FCP溶液中加入5 mg NH₂-PEG₂₀₀₀-FA、5 mg/mL EDC、20 mg/mL NHS，室温微搅拌反应3 h；透析袋（MWCO 12 kDa）对水透析24 h得FA-FCP。Cur载量经UV-Vis分光光度计426 nm测定计算。

表征

Zeta Sizer（Malvern NanoZS）测粒径与Zeta电位；TEM（日立）、AFM（Agilent 5500LS）观察形貌；共聚焦激光扫描显微镜（LEXT OLS4100）和流式细胞仪（BD）检测细胞摄取；UV-Vis分光光度计（UV1800）测吸收光谱。

细胞培养与动物模型

人卵巢癌细胞系SK-OV-3（上海细胞生物学研究所提供），DMEM+10% FBS+1%双抗，5% CO₂，37℃培养。BALB/c裸鼠（雌，5周龄，北京维通利华）皮下接种1×10⁶ SK-OV-3细胞建模。实验符合四川省医学科学院实验动物伦理委员会批准。

pH/LIFU触发Cur释放

FA-FCP水溶液分四份装入透析袋（MW 5000），透析于pH 5.0和7.4 PBS中。3 h后分别施以或不施LIFU（7 W, 5 min，50%占空比，脉冲波模式）。定时取1 mL透析液并补充等体积等pH空白液，UV-Vis测Cur浓度。

ADV性质与超声成像功能

pH 5.0和7.4下FA-FCP嵌入琼脂糖凝胶，不同功率（5,6,7 W）和时长（3,4,5 min）LIFU照射，超声设备（Esaote Mylab 90，5-12 MHz，MI 0.06）成像，ImageJ分析感兴趣区灰度值。

靶向能力

FITC标记纳米粒子：1 mg FITC溶于1 mL DMSO与FCP、FA-FCP温和振荡30 min，透析除去游离FITC/DMSO。细胞培养24 h后加入FITC标记纳米粒子孵育3 h，PBS洗涤3次，DAPI染核5 min，LysoTracker Red染溶酶体10 min，4%多聚甲醛固定15 min，共聚焦观察；流式细胞术定量细胞内荧光信号。

血液循环与肿瘤富集

游离Cur和FA-FCP（同Cur浓度）静脉注射正常鼠，不同时间点取眶静脉血，溶血液中UV-Vis测Cur浓度，以注射剂量百分比/组织克重（ID%/g）表示。肿瘤负鼠静脉注射FA-FCP后0,1,6,12,18,24 h取瘤组织，王水消化24 h，UV-Vis测Cur浓度计算ID%/g。

体内外抗癌疗效

体外：细胞用PBS、Cur、FA-FCP、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU（同Cur剂量5 mg/kg）处理3 h，再LIFU照射（5 min, 7 W），继续孵育21 h，CCK-8测活力。体内：瘤鼠随机分5组（n=6），尾静脉注射生理盐水、游离Cur、FA-FCP、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU。治疗24天，每3天卡尺测瘤体积（长×宽²/2），记录体重。相对瘤体积V/V₀（V₀为初始体积）评估生长抑制。

生物安全性评价

SK-OV-3细胞96孔板种植，FA-FCP（0-500 μg/mL）共培养24 h，CCK-8测活力。健康鼠注射FA-FCP 25天后取心肝脾肺肾HE染色，光镜观察组织学变化。

统计分析

数据均以均值±标准差表示，SPSS 22.0处理，Student's t检验，P<0.05为显著差异。

结果与讨论

FA-FCP制备与表征

Scheme 1展示FA-FCP合成及应用。自组装法制备，TEM/AFM显示球形结构（图1a插图及补充图S1）。DLS测得平均粒径约47 nm，Zeta电位-37 mV（图1a,b）。水、PBS、生理盐水、FBS中放置4周粒径稳定（图1c），归因于PEG修饰和铁蛋白本身稳定性。UV-Vis-NIR显示Cur吸收峰（图1d），Cur载量率125.8±2.1%。

pH/LIFU响应释药

图2展示不同条件下Cur累积释放曲线。无LIFU时，pH 5.0下24 h释放约30%，显著高于pH 7.4（5.3%）。LIFU（7 W, 4 min）下两pH均急剧增加，但pH 5.0释放量（50%）显著高于pH 7.4。此特性使FA-FCP适配肿瘤微环境。机制：(1) 铁蛋白酸性下解体打开笼结构释放Cur；(2) LIFU诱导瞬时相变使Cur从扩张多孔壳层稳定逸出。

体外ADV效应

不同功率/时长LIFU激发FA-FCP评估最佳参数。超声灰度值代表ADV效应（图3）。pH 7.4下呈时间/功率依赖性，7 W 5 min峰值；pH 5.0下7 W 4 min峰值。低于5 W 3 min气泡不足，超过7 W 4 min气泡坍塌消失。最佳激发条件：pH 5.0，7 W，4 min。

靶向能力

FITC标记FCP与FA-FCP荧光强度无显著差（补充图S2），排除标记量差异影响。共聚焦及流式显示：FCP摄取率19.5%（可能因细胞表面铁蛋白受体）；FA-FCP摄取率升至44.3%，游离FA预处理后骤降至13.8%（图4a,b），证实FA受体介导内吞显著增强摄取。溶酶体定位实验（图4c）：FA-FCP（绿）与LysoTracker Red（红）合并呈强黄色荧光，证实FA-FCP定位溶酶体（pH≈5.0），利于细胞内触发释药。

血液循环与肿瘤富集

FA-FCP半衰期约7.31 h（图5a），较游离Cur延长8倍，归因于PEG修饰和铁蛋白包裹，延长血液循环利于药物在肿瘤富集。肿瘤组织动态富集（图5b）：FA-FCP在18 h达峰值富集，游离Cur约1 h达峰。FA-FCP肿瘤富集显著优于游离Cur，得益于EPR效应和FA受体主动靶向。

体内超声成像

四组裸鼠（空白+LIFU、FCP+LIFU、FA-FCP+LIFU、FA-FCP无LIFU）注射后18 h经LIFU（7 W, 4 min）照射成像（图6）。空白组无显著信号；FA-FCP+LIFU组肿瘤内超声信号显著强于FCP+LIFU和FA-FCP无LIFU组（图6a,b），证实FA-FCP+LIFU增强肿瘤超声造影对比度。

体内外抗癌治疗

体外CCK-8（图7a）：所有组随Cur浓度依赖性抑制细胞活力。无LIFU时FA-FCP抑制优于游离Cur（FA靶向效应）；FA-FCP+LIFU抑制显著优于FP+LIFU、FCP+LIFU、FA-FCP无LIFU，得益于LIFU诱导释药/空化效应、溶酶体酸性环境触发释药、FA靶向作用。体内抗癌（图7b,c,d）：按FA-FCP肿瘤峰值富集时间（18 h），每2天LIFU照射共3次。24天后FA-FCP+LIFU组相对瘤体积显著降低；瘤重在FA-FCP和FCP+LIFU组显著低于对照和Cur组，FA-FCP+LIFU组抑制最强；治疗期各组体重无显著下降（图7d）。优异疗效归因于FA-FCP肿瘤靶向富集、声/ pH双响应释药、血液长循环延缓肿瘤部位清除。

体内外生物相容性

CCK-8和HE染色评价（图8）。FA-FP（0-500 μg/mL）和LIFU（0-8 W）处理细胞活力均>90%（图8a,b），无显著细胞毒性。FA-FCP+LIFU组小鼠主要器官HE染色无组织学异常（图8c），证实高生物相容性。

结论

本研究利用铁蛋白纳米笼构建多功能FA-FCP，共载抗癌药Cur和靶向分子FA，实现造影超声成像与精准化疗。FA-FCP具高生物相容性、优异肿瘤靶向、声/ pH触发释药、声响应相变成像等特性，可作为无全身毒性的高效抑瘤因子。该生物相容性诊疗一体化纳米平台有望融合超声成像与增强治疗，为癌症治疗提供新范式。

数据与材料可用性

本文结论基于正文及图表呈现的数据。

缩略语

US

超声

FA

叶酸

FRT

铁蛋白

PFH

全氟己烷

LIFU

低强度聚焦超声

ADV

声滴汽化

FITC

异硫氰酸荧光素

CCK-8

细胞计数试剂盒-8

FBS

胎牛血清

EDC

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

NHS

N-羟基琥珀酰亚胺

Cur

姜黄素