制备基于 Fe3O4 纳米团簇的混合纳米结构作为磁共振成像和药物递送的治疗诊断剂

介绍

近年来，已经开发了各种多功能给药系统，用于未来生物医学应用中的诊断和治疗 [1,2,3,4]。集成了有利特性的多功能混合纳米结构将具有重要的应用，例如多模态成像和同步诊断和治疗 [5,6,7,8,9,10,11]。此外，这些纳米结构是刺激响应的药物递送系统，用于改善药物积累、增强治疗效果和/或减少副作用。特别是，这些 pH 响应药物递送系统引起了广泛的研究兴趣。这是因为大多数人类肿瘤具有更酸性的pH值，这为设计药物分子的控释提供了可能的途径[12,13,14,15,16]。

在过去的几十年里，通过将无机纳米材料与有机聚合物相结合 [17,18,19,20] 开发了各种混合纳米结构，包括磁性粒子 [21,22,23]、上转换纳米粒子 (NPs) [17, 24]和介孔二氧化硅颗粒 [25]。其中，室温下具有较大磁化强度的基于氧化铁的磁性杂化纳米结构已广泛应用于生物医学领域[26,27,28,29]。包覆有聚电解质层的无机纳米材料的功能化可以实现药物分子的 pH 响应包封和释放 [12, 17, 30]。最近，由聚（苯乙烯磺酸钠）（PSS）和聚阳离子聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）组成的聚电解质层已得到广泛研究[31,32,33,34,35,36]。最近也报道了聚电解质层与磁性和发光纳米颗粒或药物分子相结合，用于多功能药物递送系统 [37,38,39]。氧化铁 (Fe3O4) NPs 由于其独特的超顺磁性、生物相容性、低细胞毒性和柔韧性，在磁共振成像 (MRI) 和药物递送领域越来越受到关注 [9, 11, 28, 29, 40 ,41,42]。一般来说，有两种方法可以提高 Fe3O4 NPs 的磁响应性。第一个是合成微米级磁铁矿颗粒。然而，由于尺寸大，它们倾向于在水溶液中聚集，这不利于生物医学应用。另一种方法是将 Fe3O4 NPs 组装成纳米团簇 (NCs)。与单独的 Fe3O4 NPs 相比，这些 Fe3O4 NCs 大大提高了磁响应性 [22, 43]。因此，如果采用自组装的 Fe3O4 NCs 作为核心来制造多功能混合纳米结构，则 Fe3O4 NPs 的集体效应将提高 MRI 性能 [43,44,45]。据我们所知，用 PAH/PSS 多层功能化的自组装 Fe3O4 NCs 用于 pH 响应药物释放的报道很少。

在这项工作中，建立了一个基于 Fe3O4 NPs 的多功能治疗诊断纳米平台，用于 MRI 和药物输送。在我们的方法中，Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构是通过结合水包油微乳液法和逐层（LBL）静电吸附法获得的。预计填充的 Fe3O4 NC 系统可以提高 T 2 弛豫率和成像对比度，以及 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构的大比表面积允许抗癌药物的高负载。此外，体外实验表明，与Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX一起孵育的人肺癌（A549）细胞的MRI对比度得到显着增强。

材料和方法

材料

FeCl3·6H2O (99.99%)、FeCl2·4H2O (99.99%)、油酸 (OA, 90%) 和 1-十八烯 (ODE, 90%) 购自 Alfa Aeasar。油酸钠（NaOA）、乙醇、己烷、环己烷、异丙醇、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、氟化铵（NH4F）、氢氧化钠（NaOH）、二甲亚砜（DMSO）、氨水购自国药集团化学试剂有限公司。 , Ltd (中国)。聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）、聚（苯乙烯磺酸盐）（PSS）和 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物购自 Sigma-Aldrich。抗癌药盐酸阿霉素（DOX，> 98%）购自上海生工生物科技有限公司（中国上海）。 APMI 1640 生长培养基和胎牛血清 (FBS) 购自 Hyclone。所有试剂均按原样使用，无需进一步纯化。

油酸铁的制备

磁性纳米颗粒的合成始于油酸铁的合成。将 FeCl3·6H2O (2.59 g)、NaOA (14.6 g)、C2H5OH (32 mL)、H2O (24 mL) 和己烷 (56 mL) 在 150 mL 三颈烧瓶中混合并加热至 70 °C回流4 h，形成透明的油酸铁络合物溶液。之后，通过分液漏斗将液体分离，保留上层油层。液体中的己烷通过旋转蒸发在 70 °C 下蒸发，并在真空下干燥 48 小时。制备好的样品保存在真空手套箱中备用。

Fe3O4 NPs 的合成

我们按照先前报道的程序稍加修改合成了 Fe3O4 NPs [46]。将油酸铁 (7.2 g)、OA (1.28 mL) 和 ODE (50 mL) 在 100mL 三颈烧瓶中混合在一起，并在氩气保护下加热至 300 °C 40 分钟；之后，将混合物冷却至室温并在空气中氧化12 小时以上。通过加入异丙醇沉淀所得纳米晶体，离心，并用乙醇-水混合物（1:1 v /v ）。最后将油酸封端的Fe3O4 NPs分散在200 mL环己烷中，上清液密封保存以备后续实验使用。

Fe3O4 NCs 的制备

Fe3O4 NCs 是通过简单直接的微乳液自组装技术制备的，如前所述，并进行了修改 [47]。简而言之，将 200 μL Fe3O4 纳米晶体在环己烷中的溶液倒入 4 mL 含有 14 mg SDBS 的水溶液中。混合溶液超声处理5 min 4次。将形成的水包油包固体 (S/O/W) 乳液在室温下搅拌 6 h 以蒸发有机溶剂，然后 Fe3O4 NPs 自组装形成 3D NCs。最终产品用去离子水洗涤 3 次以去除多余的 SDBS、未掺入的纳米晶体和一些可能的较大污染物。

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的制备

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构是通过静电吸引相互作用制备的。由于阴离子表面活性剂的包封，所制备的 Fe3O4 NCs 带负电。它们首先通过吸附一层带正电的聚电解质聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH，MW 15 000）而带正电。具体而言，首先使用去离子水将 300 μL Fe3O4 NC 样品稀释 10 倍至 3 mL。随后在剧烈搅拌下将 Fe3O4 NC 混合物逐滴加入 PAH 水溶液（1 mL，10 g/L，4 mM NaCl）中。将溶液搅拌 24 h 后，离心去除多余的 PAH，将得到的 PAH 包覆的 Fe3O4 NCs (Fe3O4 NC/PAH) 重新分散在水 (3 mL) 中。

然后通过吸附一层带负电的聚电解质聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS，MW 70 000）使 Fe3O4 NC/PAH 带负电。具体而言，在剧烈搅拌下，将 3 mL Fe3O4 NC/PAH 样品溶液逐滴加入 PSS 水溶液（1 mL，10 g/L，4 mM NaCl）中。将溶液搅拌24 h后，离心去除多余的PSS，将得到的PSS包覆的Fe3O4 NC/PAH（Fe3O4 NC/PAH/PSS）重新分散在水（3 mL）中。

首先制备 DOX 水溶液储备液 [17]。浓度为5.0 mg/mL。通过在小塑料管中混合 Fe3O4 NC/PAH/PSS 溶液（3 mL，32 mg/mL）和 DOX 储备溶液（60 μL），在暗室中搅拌 24 h，获得混合纳米结构溶液。离心后最终得到Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构。

MRI 测量

MRI 测量在 11.7 T 微型 2.5 显微成像系统（Bruker，德国）中进行。将不同量的 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构分散在 1.2 mL 琼脂糖水溶液中，然后装入微管中进行 MRI 测量。最终的Fe离子浓度分别为0 mM、0.013 mM、0.026 mM、0.032 mM、0.041 mM、0.052 mM和0.065 mM。测量参数如下：重复时间（TR）=300 ms，回波时间（TE）=4.5 ms，成像矩阵=128×128，切片厚度=1.2 mm，视场（FOV）=2.0×2.0 cm，和平均数 (NA) =2。

细胞摄取和磁共振成像

为了证明有效的细胞摄取，将 A549 细胞接种在共聚焦盘中的盖玻片上，并在 37 °C 的 5% CO2 加湿气氛中培养 4 小时。然后，将不同浓度的 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构加入培养液中，培养 2 h。最终获得的 Fe 离子浓度分别为 0、2.2、4.5、9.0 和 13.5 μM。除去培养基后，用PBS（pH=7.4，20 mM）洗涤细胞两次，直接用于MR成像。

DOX标准曲线

通过振荡将适量的DOX溶解在水中。然后，制备一系列不同浓度的 DOX 水溶液（0-0.03 mg/mL）。测定不同浓度DOX溶液的荧光强度(λ ex =490 nm）。最后通过荧光强度vs的曲线拟合确定DOX的标准曲线 DOX浓度。

面积标准曲线：Y =447.4423 + 69745.08457X。

标准曲线精密率：R ² =0.9992。

DOX 加载和发布

为了测量 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的负载能力，在制备的混合纳米结构离心后收集上清液。检测上清液中DOX分子的荧光光谱，通过比较DOX的标准曲线计算上清液中DOX的浓度。根据下式计算Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构中DOX的残留百分比：

其中 W 0 和 W s 分别表示初始 DOX 质量和上清液中的 DOX 质量。

对于 PBS 缓冲溶液（pH 5.0 和 7.4）中累积的 DOX 释放研究，NaCl 浓度为 0.15 M，将 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构分散在 1.0 mL 的缓冲溶液中，然后转移到透析中包。然后，将其保存在缓冲溶液中，并在暗室中在 37 °C 下轻轻摇动。在选定的时间间隔内，抽取100 μL溶液进行荧光光谱分析，然后返回原溶液。

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的体外细胞毒性

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构对 A549 细胞的体外细胞毒性基于标准甲基噻唑基四唑 (MTT) 测定进行评估。 A549 细胞在 APMI 1640 生长培养基中培养，该培养基补充有 10% 胎牛血清 (FBS)、100 μg/mL 的链霉素和 100 μg/mL 的青霉素。在空气中含有 5% CO2 的潮湿气氛中，将细胞保持在 37 °C。该测定以相同方式一式三份进行。简而言之，将A549细胞以8×10 ³ 的密度接种到96孔板中 100 μL 培养基中每孔的细胞数。过夜生长后，然后将细胞在不同浓度的游离 DOX、Fe3O4 NC/PAH/PSS 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构（0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μM）下孵育24 小时。孵育24 h后，每孔加入10 μL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液(5 mg/mL)，再孵育细胞4 h 在 37 °C。除去3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑溶液后，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，轻轻振摇10 min使板溶解析出的紫色晶体。使用酶标仪 (Perkin Elmer, Victor X4) 在 490 nm 处测量光密度 (OD)。以与对照细胞相比的百分比来评估细胞活力。

特征化

Fe3O4 NPs 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的尺寸和形貌通过 FEI Tecnai G2-F20 透射电子显微镜 (TEM) 在 200 kV 的加速电压下进行检查。动态光散射 (DLS) 测量在 Malvern 的粒度和 zeta 电位分析仪 (Zetasizer Nano ZS90) 上进行。紫外-可见吸收光谱由 Perkin Elmer Lambda-25 紫外-可见光谱仪获得。使用 Hitachi F-4600 荧光分光光度计记录荧光光谱。采用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）（Agilent 5100）分析Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构中的Fe元素浓度。

结果与讨论

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构是由初级氧化铁 (Fe3O4) NPs 自组装制备的，通过微乳液自组装技术自组装形成致密的球形聚集体，如前所述 [17, 47]，如下LBL静电吸附法。图 1 说明了 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的合成示意图。疏水性油酸包覆的磁铁矿 Fe3O4 NPs 最初是通过有机溶剂中的热分解过程生产的 [46]。 Fe3O4 NPs 呈球形且大小均匀，平均粒径约为 15 nm（附加文件 1：图 S1）。对于磁性 NCs 的组装，将 OA 包覆的 Fe3O4 NPs 分散在环己烷中，然后滴加到含有 SDBS 的水溶液中。对复合溶液进行超声处理以形成稳定的水包油乳液。在乳液中有机溶剂蒸发后，Fe3O4 NPs 通过疏水相互作用自组装形成球形纳米团簇。接下来，通过LBL方法通过静电吸引相互作用制备了Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构，如图1所示。

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构作为MRI和药物递送治疗诊断剂的合成示意图

Fe3O4 NCs 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构的形态和尺寸分别用 TEM 和 DLS 检测。如图 2a 和 b 所示，Fe3O4 NCs 显示出准球形簇。通过 DLS 测量的平均粒径约为 57 nm（图 2e）。在之前的报道中，由于其优异的静电性能，带正电荷的 PAH 或带负电荷的 PSS 交替沉积在模板表面 [48,49,50,51]。为了研究沉积在 Fe3O4 NCs 上的每个聚电解质层的形成，进行了 zeta 电位实验。 PSS/PAH 和 DOX 涂层的 zeta 电位随聚电解质层的变化显示在附加文件 1：图 S2 中。由于 SDBS 的存在，原始的 Fe3O4 NCs 具有负的 zeta 电位 - 19.7 mV。 Fe3O4 NCs 上带正电的 PAH 单层的吸收使表面电位从 - 19.7 反转到 + 32 mV。随后，带负电的 PSS 层的沉积导致另一个表面电位从 + 32 反转到 - 34 mV。这表明在磁性 NC 混合纳米结构的制造过程中出现了逐步的层生长。这些结果表明 PAH 和 PSS 层成功地涂覆在 Fe3O4 NCs 上。最后，DOX 成功吸附在 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的表面，这由正 zeta 电位（+ 1.91 mV）证实（附加文件 1：图 S2）。 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构不同放大倍数的 TEM 图像如图 2c 和 d 所示。聚电解质涂层后没有观察到显着的结构和形态差异。与图 2a 和 b 相比，可以观察到明亮的对比，并且由于 PAH 和 PSS 层的涂层，Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构的尺寸略有增加。根据DLS测量结果（图2f），合成的磁性杂化纳米结构呈近乎单分散的准球形，平均尺寸约为84 nm。

Fe3O4 NCs (a , b ) 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS (c , d ) 分别在较低和较高的放大倍数下。 Fe3O4 NCs 的尺寸分布 (e ) 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构 (f )

为了评估 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构在 MRI 中的潜在应用，质子横向弛豫率 (1/T 2) 作为 Fe 离子浓度的函数，使用 Bruker AVANCE 500WB 光谱仪在 11.7 T 下确定。观察到弛豫率与 Fe 离子浓度之间的线性关系，如图 3b 所示。此外，横向弛豫率 (1/T 2) 由于 Fe3O4 磁性 NPs 核的高度聚集，随着 Fe3O4 NCs 浓度的增加而增加，表明磁性杂化纳米结构可能是一种有效的 T 2 加权 MRI 造影剂（图 3a）。根据图 3b 中曲线的斜率，横向弛豫率值 (r 2) 确定为 651.38 mM ^-1 S ⁻¹ ，高于报道的工作[22]。与商用T相比 2对比介质中，磁性纳米粒子在集体效应的基础上自组装后，纳米团簇可以显着提高Fe的对比能力，从而大大提高血管造影效果。在之前的工作中，由于磁性纳米晶体的集体效应，组装的磁铁矿纳米晶体表现出比单个纳米晶体更高的饱和磁化强度[43, 52]。

一 T Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构在水中不同浓度的 2 加权 MRI 图像。 b 松弛率图 r 2 对比 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构中的 Fe 浓度。弛豫度值 r 2 由实验数据线性拟合的斜率得到

为了评估 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构作为药物递送载体的载药能力，选择水溶性抗癌药物 (DOX) 作为模型药物。 DOX 在混合纳米结构中的高效储存首先通过溶液的颜色变化来揭示。 Fe3O4 NC/PAH/PSS 溶液和纯 DOX 溶液的颜色分别为黄色和红色（图 4a 和 b）。在形成 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构后，溶液的颜色变为橙色（图 4c）。由于 Fe3O4 NPs 的存在，悬浮液中负载 DOX 的纳米结构可以被外部磁铁分离，表明所获得的混合纳米结构在磁性靶向药物递送方面具有巨大潜力（图 4d）。紫外-可见吸收光谱用于确定有效的 DOX 存储容量。图 4e 显示了 DOX 水溶液在与 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构相互作用之前和之后的 UV-vis 吸收光谱。与游离的 DOX 相比，在 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构中观察到相似的吸收峰特征，即 Fe3O4 NCs 和 DOX 的复合吸收峰。不含 DOX 的样品仅显示 Fe3O4 NCs 的吸收峰。这些数据表明 DOX 作为一种药物可以成功地吸收到混合纳米结构的表面上。还发现负载在杂化纳米结构表面的 DOX 的吸附浓度存在上限。图 4f 显示了离心后 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构在 Fe3O4 NC/PAH/PSS 溶液中加入不同浓度的 DOX 时的 PL 光谱。随着 Fe3O4 NC/PAH/PSS 浓度（1.30 × 10 ⁻² mg/mL) 不变。之后，由于过量的 DOX 不能吸附在 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构的表面，捕获量减少。 DOX的最强荧光强度对应于8 mg/mL的浓度，相应的样品将用于进一步研究进行生物医学实验。确保混合纳米结构的载药效率对于临床应用至关重要。上样效率采用 DOX 标准曲线法通过 DOX 荧光强度的面积积分计算[53, 54]。 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的负载效率计算高达 24.39%。因此，由于抗肿瘤药物DOX的有效吸收，基于Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构建立了治疗诊断平台。

照片 (a –d ) 在 Fe3O4 NC/PAH/PSS 混合纳米结构上不同吸收阶段的 DOX。紫外可见吸收光谱 (e ) 的 DOX、Fe3O4 NC/PAH/PSS 和 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构。发光光谱 (f )在Fe3O4 NC/PAH/PSS杂化纳米结构溶液中加入不同浓度的DOX时Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构的形成

Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构在各种环境 pH 值下的体外药物释放曲线如图 5 所示。 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构在磷酸盐缓冲液中通过透析膜透析在 37 °C。收集混合纳米结构释放的 DOX，然后通过上清液的荧光强度计算 DOX 的释放量。在生理 pH 7.4 时，观察到的药物释放是一个缓慢释放过程。大约20 wt%的DOX在最初的5 h释放出来，然后进入缓释的稳定阶段。在 pH 5.0 下，在达到释放平台之前的最初 15 h，大约 80 wt% 的 DOX 从混合纳米结构中释放出来。在 30 h 期间观察到的 DOX 释放的平台百分比分别为 80±3 wt% 和 20±3 wt%，pH 5.0 和 7.4。可以看出，Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构在 pH 5.0 下比在 pH 7.4 下显示出持续释放曲线和更高的 DOX 释放速率。低环境 pH 值加速了 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构中 DOX 的释放。这是由于 DOX 的 –NH2 基团在酸性条件下发生质子化，这降低了 DOX 和 PSS 聚合物在低 pH 值下的静电相互作用 [55]。药物释放研究表明，静电结合的药物分子在生理 pH 值下具有良好的稳定性，在酸性条件下触发释放，与报道的工作类似 [56,57,58]。因此，获得的Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构是DOX药物递送的pH响应系统，适用于实体瘤的特异性治疗[59]。

PBS缓冲液中Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构在pH 7.4和5.0下释放DOX的图

细胞摄取和细胞毒性是评估新药物递送系统潜力的关键因素。研究了 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构对 A549 细胞系的细胞摄取和细胞毒性。使用光学和荧光显微镜研究了 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构的细胞间吸收，这主要是通过监测 DOX 的荧光来实现的。 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构已被证明可有效地将 DOX 递送至癌细胞。如图 6 所示，在培养 24 h 后，在癌细胞中观察到来自 DOX 的强烈红色荧光。混合纳米结构主要通过内吞作用被内化[60]。细胞摄取后，混合纳米结构在内体/溶酶体周围的酸性环境中释放 DOX，其中足够低的 pH 值（4.3）可以触发有效的 DOX 释放（pH 5.0，图 5）。 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构在 A549 癌细胞中表现出时间依赖性吸收，如图 6 所示。在孵育后 0.5 h，细胞周围可见红色荧光。结果表明，含有 DOX 的混合纳米结构主要停留在 A549 细胞周围。然而，当孵育时间增加到 24 h 时，A549 细胞的细胞间荧光信号增加。显然，随着时间的推移，许多混合纳米结构可以进入癌细胞。这些结果证实 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构可以有效地将 DOX 转移到 A549 细胞中。从细胞质中的杂化纳米结构释放的DOX穿过核膜并最终在细胞核中积累，通过引起DNA构象的变化来杀死细胞[61]。

A549 细胞与 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构在 37 °C 下孵育 a 的共聚焦荧光显微图像 0.5 h 和 b 24 小时。比例尺，20 μm

为了评价Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX杂化纳米结构的药理活性，采用MTT法测定体外对A549细胞的细胞毒性。图7显示了不同浓度的游离DOX、Fe3O4 NC/PAH/PSS和Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX混合纳米结构与A549细胞孵育24 h后的细胞活性。根据 DOX 的浓度计算材料量。游离 DOX 浓度与 Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX 杂化纳米结构中的 DOX 浓度相同，Fe3O4 NC/PAH/PSS 杂化纳米结构中的浓度与 Fe3O4 中的 Fe3O4 NC/PAH/PSS 浓度相同NC/PAH/PSS/DOX 混合纳米结构。每个样品与 A549 细胞一起培养 24 小时。 Fe3O4 NC/PAH/PSS的浓度范围为0.1-2.0μM，细胞存活率超过85%。这表明Fe3O4 NC/PAH/PSS杂化纳米结构对癌细胞没有明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性。 After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe3O4 NC/PAH/PSS, and Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe3O4 NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe3O4 concentrations. Figure 8 presents the T 2-weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe3O4 concentration in Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T 2-negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T 2-weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

T 2-weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively

Conclusion

The multifunctional Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe3O4 NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe3O4 NPs. The Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. The Fe3O4 NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.

数据和材料的可用性

Data sharing is not applicable to this article as no datasets were generated or analyzed during the current study. Please contact the author for data requests.

缩写

1/T 2 :

The proton transverse relaxation rates

A549:

Human lung cancer

DLS：

动态光散射

DMSO：

二甲亚砜

DOX：

Doxorubicin hydrochloride

FBS：

胎牛血清

Fe3O4 :

Iron oxide

FOV:

Field of view

LBL:

Layer-by-layer

MRI:

Magnetic resonance imaging

MTT：

Methyl thiazolyltetrazolium

不适用：

Number of averages

NaOA:

Sodium oleate

NaOH:

Sodium hydroxide

NC：

Nanocluster

NC：

Nanoclusters

NH4F:

Ammonium fluoride

NP：

纳米粒子

OA：

油酸

OD：

光密度

ODE：

1-十八碳烯

多环芳烃：

Poly(allylamine hydrochloride)

PSS:

Poly(sodium 4-styrenesulfonate)

S/O/W:

Solid-in-oil-in-water

SDBS:

Sodium dodecyl benzene sulfonate

TE：

Echo time

TEM：

透射电子显微镜

TR:

Repetition time