线粒体靶向 TiS₂ 纳米片递送白藜芦醇实现光热触发肿瘤化疗

摘要

亚细胞器靶向递送抗癌药物是最大化疗效、最小化副作用的有前途策略。本研究基于 IR780 碘化物 (IR780) 和二硫化钛 (TiS₂) 纳米片构建了线粒体靶向药物递送纳米平台。得益于 TiS₂ 纳米片的大比表面积，纳米平台可高载抗癌药白藜芦醇 (RV)。制备的纳米复合材料 (IR780-TiS₂/RV) 用于高效的光热触发肿瘤化疗。IR780-TiS₂/RV 表现出良好的稳定性和生物相容性，RV 和 IR780 载药比分别约为 112% 和 56%。近红外 (NIR) 照射下，IR780-TiS₂/RV 产生的热量可触发 RV 释放。凭借线粒体特异性 IR780 的结合，IR780-TiS₂/RV 能靶向富集于线粒体，在 NIR 触发下释放 RV 降低线粒体膜电位，快速上调细胞色素 c 等关键内源性凋亡因子，启动半胱天冬酶级联反应，实现化疗效应。体外和体内实验证实 IR780-TiS₂/RV 具有高抗肿瘤疗效且无显著组织毒性。研究表明 NIR 触发的 IR780-TiS₂/RV 纳米平台有望成为临床实践中有前途的化疗药物。

引言

癌症仍是全球高死亡率的致命疾病。手术、化疗、放疗、激素治疗仍是临床主流手段。化疗因相对高疗效被广泛接受，但面临耐药、复发、非特异性等严重问题。开发新型化疗药物和策略克服这些障碍刻不容缓。近年来，将抗癌药物负载于可同时实现靶向递送和可控释放的功能化载体上，成为最大化疗效、减少副作用的热门方案。大比表面积提供更高载药比是优秀药物载体的关键。

为提高药物特异性，载体常修饰细胞靶向分子，如叶酸、谷胱甘肽等靶向细胞表面受体。由于许多化疗药物作用于特定亚细胞器，设计细胞器特异性递送系统可显著增强疗效、减少副作用。因此，选择肿瘤细胞内的靶向位点至关重要。线粒体不仅是细胞“能量工厂”，也是化疗药物靶向启动内源性凋亡途径的关键靶点。开发线粒体靶向抗癌药物递送系统对更有效的癌症化疗至关重要。目前已设计多种药物递送系统，如介孔二氧化硅、碳基材料、蛋白等，虽报道高效但仍需更多新型高效系统。

本研究构建基于二维二硫化钛 (TiS₂) 纳米片的线粒体靶向、NIR 触发药物递送纳米平台，用于可控靶向肿瘤化疗。TiS₂ 属过渡金属二硫属化物，具有大比表面积。经蛋白辅助超声剥离后，TiS₂ 纳米片表面可通过共价或非共价相互作用修饰功能分子。选用肿瘤线粒体特异性分子 IR780 (IR-780 碘化物) 修饰 TiS₂ 纳米片。IR780 通过有机阴离子转运多肽介导的主动转运和亲脂阳离子特性赋予线粒体靶向能力。报道显示 IR780 作为亲脂阳离子，因肿瘤细胞线粒体膜电位幅度高于正常细胞，在肿瘤细胞线粒体中富集更多。此外，IR780 还是近红外响应光热剂。制备的纳米平台 IR780-TiS₂ 经确认具有生物相容性，可高效负载抗癌药白藜芦醇 (RV) 得到 IR780-TiS₂/RV。该纳米平台具备线粒体靶向和光热效应。NIR 作为外部刺激触发照射下的局部药物释放。体内外实验显示 IR780-TiS₂/RV 具有高效化疗效果。机制研究揭示其诱导细胞死亡通过线粒体介导的内源性凋亡途径。该线粒体靶向药物递送系统 (Scheme 1) 可作为未来临床应用的潜在化疗药物。

材料与方法

材料

Sigma-Aldrich 提供 IR-780 碘化物 (IR780)、TiS₂ 粉末、荧光素异硫氰酸酯 (FITC) (St. Louis, MO, USA)。牛血清白蛋白 (BSA ≥ 98.0%) 购自 BioSharp (韩国)。CCK-8 采自 Dojin Chemical Laboratory (日本)。细胞培养试剂包括 DMEM 培养基和胎牛血清 (FBS) 由 Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 提供。化学试剂来自 Sigma-Aldrich (上海)。

IR780-TiS₂/RV 合成

第一步：按文献制备水溶性 TiS₂ 纳米片。5 mg 体相 TiS₂ 加 5 mL 水搅拌 20 分钟，悬浮液加入 5 mg BSA，冰浴下用 500 W、20 kHz 探针超声 (Sonics, VCX130, USA) 解离 6 小时。12,000 rpm 离心 10 分钟，上清液得 TiS₂ 纳米片。

第二步：TiS₂ 纳米片与 IR780 偶联。三乙胺 (TEA) 作酸结合剂。5 mg IR780 溶于 2 mL DMSO，60°C 搅拌 8 小时并加入 TEA。混悬液蒸馏水透析 2 天，9000 rpm 离心 8 分钟除去聚集物，上清液得 IR780-TiS₂。

第三步：RV 负载。IR780-TiS₂ (1 mg/ml) 与 RV (2 mg/ml, DMSO 溶解) 混合，室温微搅拌过夜。透析除去 DMSO 和游离 RV 得 IR780-TiS₂/RV。RV 载药比经 UV-Vis 分光光度计 (UV-2550, Shimadzu, Japan) 检测，按公式计算：

$$ \mathrm{RV\ loading\ ratio\ (\%)}=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

其中 Aₐ (mg)、A_b (mg)、A_c (mg) 分别代表初始、未结合 RV 和 IR780-TiS₂ 质量。

Bruker TENSOR 27 傅里叶变换红外光谱仪 (Bruker Optics, 英国) 检测 TiS₂、IR780-TiS₂、IR780-TiS₂/RV 化学结构。BET 分析 (Quantachrome ChemBET-3000) 测定比表面积。

细胞系与培养

小鼠结肠癌细胞 CT26 来自中国科学院细胞库 (上海)。完整 DMEM 培养基 (10% FBS + 90% DMEM)，5% CO₂、37°C 湿润培养箱培养。

IR780-TiS₂/RV 细胞内定位

FITC 标记 IR780-TiS₂/RV 或 TiS₂/RV。FITC 乙醇溶液 (2.0 mg/mL) 与纳米复合材料水溶液 (1.0 mg/mL) 暗室室温搅拌 4 小时。透析除去多余 FITC 和乙醇。为确认线粒体共定位，细胞经 FITC 标记纳米复合材料 5 小时孵育后，用 MitoTracker 染色。CLSM (Ix81-FV1000, Olympus) 观察细胞内化。ImageJ 分析荧光强度。

体外 NIR 触发肿瘤化疗与凋亡研究

4×10³ cells/well CT26 细胞经游离 RV、IR780-TiS₂、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RV 不同 RV 浓度处理 5 小时，随后 808 nm、0.3 W/cm² NIR 照射或不照射 3 分钟，再孵育 24 小时，CCK-8 分析细胞活力。Rhodamine123 染色经流式细胞仪 (FCM, FC 500 MCL, Beckman Coulter) 分析。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 (Bender MedSystems, 维也纳) 经 FCM 分析细胞凋亡。

Western Blot

CT26 细胞经 PBS (对照)、RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV + NIR (等效 RV 30 µg/mL；等效 IR780 0.5 µg/mL) 5 小时孵育，再 24 小时收集细胞进行 Western blot。依据文献方案：细胞裂解、蛋白酶和 Triton X-100 抑制，SDS-PAGE 分离蛋白，转移至 PVDF 膜，5% 脱脂奶封闭，4°C 过夜孵育一抗：细胞色素 c (1/1000, Boster, 武汉)、cleaved caspase-3 (1/1000, CST)、cleaved caspase-9 (1/1000, CST)、actin (1/1000, Mouse, Boster, 武汉)，孵育二抗，ECL 试剂检测。

动物模型

建立 CT26 皮下移植瘤模型：1×10⁷ CT26 细胞 (100 µL PBS) 皮下注射 Balb/c 裸鼠背部。肿瘤体积 = 长 × 宽²/2。动物实验遵循 NIH 实验动物护理使用指南，经驻马店中心医院动物伦理委员会批准 (河南)。

体内生物分布

尾静脉注射 IR780-TiS₂/RV (150 µL, 6 mg/kg) 24 小时后检测裸鼠生物分布。心、肝、脾、肺、肾、肿瘤器官称重、王水消解，ICP-OES 定量 Ti 元素含量。

体内 NIR 触发肿瘤化疗

CT26 移植瘤小鼠随机分 6 组 (n=6)：生理盐水、生理盐水+NIR、RV、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV+NIR (等效 RV 1 mg/kg；等效 IR780 0.5 mg/kg)。NIR 条件：808 nm、0.3 W/cm²、3 分钟。治疗 30 天，每 3 天记录肿瘤体积和小鼠体重。结束后心、肝、脾、肺、肾取材固定、H&E 染色。

统计分析

数据呈现为均值±标准差。Student's t 检验比较两组差异。P < 0.05 为显著，P < 0.01 为极显著。

结果与讨论

IR780-TiS₂/RV 制备与表征

制备 IR780-TiS₂/RV：首先，BSA 和超声辅助剥离法制备生物相容性 TiS₂ 纳米片 (文献 [34,35])。其次，IR780 氯原子与吸附在 TiS₂ 纳米片上 BSA 的氨基在 TEA 作用下发生取代反应合成 IR780-TiS₂。最后，IR780-TiS₂ 纳米平台通过物理吸附负载抗癌药 RV。Scheme 1 示意图。附件图 S1 TEM 显示蛋白辅助剥离 TiS₂ 为纳米片结构。XRD 显示 TiS₂ 纳米片结晶度良好，与 TEM 一致 (附件图 S2)。功能化后 IR780-TiS₂/RV 纳米复合材料呈片层状，晶格间距 0.25 nm (TEM，图 1a,b)，平均直径 ~123.6 nm，zeta 电位 -37.2 mV (纳米粒度仪，Malvern，图 1c,d)。水、FBS、生理盐水中 2 周存放，平均粒径维持 ~123 nm (图 1e)，表明稳定性好，可能因 BSA 吸附在 TiS₂ 表面。吸收光谱 (图 1f) 显示 IR780-TiS₂/RV 同时呈现游离 IR780 和 RV 的特征峰，证实两者成功结合。RV 载药比 ~112% (W/W)，通过非共价相互作用 (π-π 堆积、疏水作用) 实现。BET 结果：体相 TiS₂ 和 TiS₂ 纳米片比表面积分别为 15.2 和 122.1 m²/g，剥离纳米片提供巨大活性面积利于载药。高载药可能归因于大比表面积和 BSA 粘附。FTIR (附件图 S6) 显示 TiS₂ 纳米片特征峰均在 IR780-TiS₂/RV 中出现，且新增 ~3191、~1510、1230 cm⁻¹ 三峰，指示 RV 和 IR780 存在。

低功率 NIR 照射 (808 nm, 0.3 W/cm², 3 min) 下，IR780-TiS₂/RV 溶液温升与浓度成正比 (0, 5, 10 µg/ml)，10 µg/ml 达最高 47.6°C (图 2a)。IR780-TiS₂/RV 经 5 次 NIR 循环照射保持初始光热效应，游离 IR780 光热效应下降 (图 2b)，表明 IR780-TiS₂/RV 具有优异光稳定性。

RV 释放动力学 (图 2c,d)：24 小时后，生理条件 (pH 7.4) 释放 8.56%；pH 6.5 显著增至 16.2%，弱酸性促进释放；pH 6.5 配合 3 分钟 NIR 照射 (808 nm, 0.3 W/cm²) 释放比显著增至 44.8%。证明 NIR 可作为可控外部刺激触发 RV 释放。机制可能为 NIR 下 IR780-TiS₂ 产热削弱 RV 与表面非共价吸附；酸性环境下 H⁺ 改变 TiS₂ 表面电荷，改变亲疏水平衡。

IR780-TiS₂/RV 细胞内定位

FITC 标记纳米颗粒，CLSM 观察细胞内荧光。5 小时孵育后，TiS₂/RV 和 IR780-TiS₂/RV 细胞质荧光强度相近 (图 3a,b)，表明两者均能进入细胞 (可能经内吞作用)。但 IR780-TiS₂/RV 与 MitoTracker 合并后黄绿荧光强度更大 (图 3a,c)，表明高效靶向线粒体。TEM 进一步证实纳米颗粒保留在部分线粒体中 (图 3d)。结果确证 IR780-TiS₂/RV 实现良好线粒体靶向，促进线粒体药物富集，导致即时细胞毒性。靶向机制可能为有机阴离子转运多肽主动转运和亲脂阳离子特性，使纳米颗粒高度富集于肿瘤细胞线粒体。

体外 NIR 触发肿瘤化疗

先评估体外光热效应：5 小时孵育后，IR780-TiS₂/RV 温升 ~17°C，TiS₂/RV ~10°C (图 4a)，光热效应源于 IR780 和 TiS₂ 纳米片。生物相容性：IR780-TiS₂ 300 µg/ml 以下无显著细胞毒性 (图 4b)。RV 有无 NIR 均呈浓度依赖性杀细胞效应 (图 4c)。同等 RV 浓度下，IR780-TiS₂ 载药并 NIR 照射组杀细胞效果最佳，优于游离 RV、游离 IR780-TiS₂、TiS₂ 载药 RV 等所有条件 (图 4d)。有趣的是，未载药 IR780-TiS₂ 平台 NIR 照射与否抗癌效果无显著差异 (图 4d)，表明 NIR 产生的热量主要用于触发药物释放进而杀伤细胞。结果提示 IR780-TiS₂/RV 能在 NIR 触发下于线粒体释放 RV，显著提高线粒体局部 RV 浓度，实现更强肿瘤抑制效果。

细胞死亡机制

阐明 IR780-TiS₂/RV NIR 触发化疗机制，分析细胞死亡类型、线粒体膜电位 (Ψm)、凋亡相关蛋白表达。FCM 检测 Annexin V-FITC/PI 染色 (图 5a)：同等 RV 浓度下，游离 RV、TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV、IR780-TiS₂/RV+NIR 均诱导凋亡，主要因 RV 存在。RV 已报道能诱导凋亡。其中 IR780-TiS₂/RV+NIR 凋亡率最高达 90.8%。Ψm 下降是线粒体 (内源性) 凋亡途径关键事件。同等 RV 浓度下，IR780-TiS₂/RV+NIR 降低 Ψm ~85%，显著高于其他处理组 (图 5b)，表明通过内源性凋亡途径介导细胞死亡。Western blot 检测关键凋亡蛋白：IR780-TiS₂/RV+NIR 处理细胞胞质细胞色素 c 表达最多 (图 5c)。细胞色素 c 转位是启动半胱天冬酶级联的最重要起始因子。因此，cleaved caspase-9 和 cleaved caspase-3 表达在 IR780-TiS₂/RV+NIR 组显著升高。数据明确表明凋亡经线粒体内源性途径介导。

体内 NIR 触发肿瘤化疗

评估体内疗效：CT26 移植瘤小鼠经生理盐水、生理盐水+NIR、RV、IR780-TiS₂/RV、TiS₂/RV+NIR、IR780-TiS₂/RV+NIR 处理。IR780-TiS₂/RV+NIR 组肿瘤体积显著缩小，30 天后几乎消失，其余组肿瘤体积上升趋势 (图 6a)。治疗期间各组体重无显著差异 (图 6b)。H&E 染色显示所有组别主要器官无明显组织毒性或异常 (图 6c)。结果表明 IR780-TiS₂/RV 纳米复合材料具有卓越的 NIR 触发抗肿瘤疗效和低全身毒性。生物分布显示纳米颗粒主要进入肝脏系统并可能被代谢 (附件图 S4)。

结论

综上，基于 TiS₂ 纳米片开发了线粒体靶向、载 RV 纳米平台，实现 NIR 触发药物释放和增强肿瘤化疗。制备的 IR780-TiS₂/RV 片层形貌，稳定性好、生物相容性佳。得益于 IR780 线粒体靶向能力，IR780-TiS₂/RV 选择性富集于肿瘤细胞线粒体，在 NIR 触发下释放 RV。释放的 RV 促进线粒体膜电位下降、细胞色素 c 释放，进而启动半胱天冬酶级联反应，通过线粒体信号通路促进肿瘤细胞凋亡。体内外结果证实 IR780-TiS₂/RV 具有高效 NIR 触发抗肿瘤疗效且无显著组织毒性。结果提示 IR780-TiS₂/RV 可作为临床实践中有前途的化疗药物。