黄柏炭碳点保护肾脏免受急性肾损伤：针对五步蛇毒液诱导模型的研究

摘要

碳点（CDs）作为新兴纳米材料在生物医学领域备受关注，但其抑制蛇毒诱导急性肾损伤（AKI）的生物活性鲜有报道。本研究首创绿色一步法热解工艺，以黄柏（Phellodendri Chinensis Cortex，PCC）为单一前驱体制备黄柏炭碳点（PCCC-CDs），并首次探讨其对五步蛇毒液诱导AKI的保护作用。建立腹腔注射五步蛇毒液AKI小鼠模型，在6个时间点（1、3、12 h，1、2、5天）考察PCCC-CDs对肾功能障碍、炎症反应、组织损伤及血小板减少的改善效果。结果显示，PCCC-CDs显著抑制肾功能指标（SCR、BUN、UTP、MALB）升高，降低趋化因子MCP-1、促炎因子IL-1β及抗炎因子IL-10水平，改善肾组织病理改变及血小板减少。PCCC-CDs对五步蛇毒致AKI具有显著保护作用，拓展了CDs生物医学应用，为开发治疗五步蛇咬伤致AKI新药提供潜在靶点。

引言

五步蛇（Deinagkistrodon acutus）属蝰科，是中国最危险陆生毒蛇之一。其毒液致出血、血小板减少及直接肾损伤，AKI是最严重全身效应及常见并发症，导致持续肾功能不全和高发病率。现用马源抗毒血清疗效有限，难中和局部组织损伤（尤其是AKI），且有过敏、热原反应，成本高、稳定性差，野外/农村地区治疗困难。亟需高效、安全、廉价的辅助治疗药物。

碳点（CDs）是尺寸<10 nm的新型碳纳米材料，2004年偶然发现，因良好生物相容性、低毒性、高水溶性、原料丰富备受瞩目。CDs推动生物成像、生物医药、药物递送、光催化等“智能”纳米系统发展。具有内在生物活性的CDs为新药发现提供策略：已报道抗菌治疗细菌性角膜炎、止血、过氧化物酶样、抗癌、抗病毒、抗炎等活性。荆芥炭碳点缓解五步蛇毒致出血的研究，为探索CDs对五步蛇毒致AKI的保护作用提供新视角。

黄柏炭（PCCC）碳点由黄柏（传统中药，应用>1000年）一步热解制得，粒径1.2-4.8 nm，低毒性，已证实显著止血作用，拓展CDs应用并阐明黄柏炭止血物质基础。黄柏炭最早见于《太平圣惠方》（978-992 AD），止血抗炎疗效确切，载入《中国药典》（2015版）。但其更多生物活性（尤其是抑制五步蛇毒致AKI）鲜有研究。

蛇毒致肾损伤机制涉及肾毒性成分直接作用或免疫炎症介质激活/调节，主要影响生化指标（SCR、BUN、UTP、MALB）、炎症因子（IL-1β、IL-10、MCP-1）、肾组织病理及血小板计数。本研究制备PCCC-CDs，首次系统评价其对五步蛇毒腹腔注射致AKI小鼠上述异常的保护效应。

材料与方法

试剂

黄柏材料购自北京千草药饮片有限公司，黄柏炭实验室自制。透析袋（1000 Da）购自北京瑞达恒惠科技。CCK-8购自日本同仁化学。冻干五步蛇毒液由安仁蛇场提供。ELISA试剂盒（MCP-1、IL-10、IL-1β）购自武汉云克隆。均用去离子水。

动物

昆明种雄鼠（30.0±2.0 g），北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SPF级，12h明暗周期，自由饮食饮水。北京中医药大学动物实验伦理委员会批准。

毒液溶液制备

冻干毒液生理盐水溶解（5 mg/mL），-20℃保存。

PCCC-CDs制备

黄柏置瓷坩埚，预热炉中350℃热解1h，冷至30℃研粉，沸水煮提2次（各1h），0.22 μm醋酸纤维素膜预过滤，1000 Da透析袋透析72h去非碳质杂质，浓缩4℃保存。流程见图1。

表征

TEM/JEM-2100（200 kV）观察形貌，HRTEM/Tecnai G2 20测晶格条纹，UV-Vis（CECIL）和荧光光谱（F-4500）测光学性质，FTIR（400-4000 cm⁻¹）分析表面官能团。

细胞毒性

人正常肝细胞L02和人胚肾293T细胞，CCK-8法检测。5000-19.5 μg/mL浓度梯度，24h孵育后检测活力。

五步蛇毒致AKI模型与给药

腹腔注射毒液建模。随机分5组（各36只）：对照组、模型组、PCCC-CDs高/中/低剂量组（8.0、4.0、2.0 mg/kg）。模型组腹腔注射毒液1 mg/kg（0.15 mg/mL，0.2 mL）+ 0.5 mL生理盐水；给药组同量毒液+对应剂量PCCC-CDs；对照组仅注射生理盐水。各时间点（1、3、12 h，1、2、5天）处死6只（后3天每日给药2次）。

尿蛋白检测

代谢笼收集24h尿液，全自动生化分析仪测UTP和MALB。

肾功能指标

眶后静脉采血，4℃静置4h，750×g离心15 min取血清，测BUN和SCR。

炎症因子检测

右肾组织匀浆离心上清，ELISA测MCP-1、IL-10、IL-1β。

肾组织病理

左肾10%中性福尔马林固定>48h，石蜡切片H&E染色，光镜观察形态学改变。

血小板计数

眶后静脉血自动血液分析仪（XS-800i）测PLT。

统计学

SPSS 13.0，均数±SD，单因素ANOVA+LSD多重比较，p<0.05为显著。

结果

PCCC-CDs表征

TEM显示CDs近球形、均一分散，粒径2.84±0.89 nm，无明显团聚。HRTEM晶格条纹0.24 nm对应石墨化碳。荧光光谱：370 nm激发下蓝光发射峰445 nm。UV-Vis：265 nm强吸收峰（π-π*跃迁）。FTIR：3433 cm⁻¹（O-H/N-H），2923/2853 cm⁻¹（C-H），1624 cm⁻¹（C=O），1109 cm⁻¹（C-O-C），1400 cm⁻¹（C-N），与前期报道一致。

体外细胞毒性

L02和293T细胞暴露PCCC-CDs 24h，5 mg/mL下L02活力>85%，2500 μg/mL下293T无影响，低细胞毒性，适合生物医学应用。

PCCC-CDs降低尿蛋白

模型组UTP（3.08±0.92 mg/L）和MALB（17.78±5.96 mg/L）显著升高（vs对照组0.98±0.38和2.02±0.91 mg/L，p<0.01）。中剂量PCCC-CDs组UTP（2.36±0.83 mg/L，p<0.05 vs模型）和MALB（14.25±4.16 mg/L）降低趋势明显。

PCCC-CDs改善肾功能

毒液组第1-5天BUN和SCR持续显著升高（p<0.01）。低剂量PCCC-CDs第1天显著抑制SCR（9.77±0.79 μmol/L，p<0.01）和BUN（10.50±1.38 mmol/L，p<0.05）升高；高/中剂量抑制SCR但不抑制BUN。第2天三剂量组SCR均降低（p<0.05），高/低剂量组BUN降低（p<0.01/0.05）。第5天高/中剂量组BUN和SCR均显著抑制（p<0.01/0.05）。SCR水平PCCC-CDs组与对照组无显著差异。

PCCC-CDs抑制炎症因子分泌

毒液显著升高肾组织IL-1β（全时间点p<0.05/0.01）。高/低剂量PCCC-CDs在1、3、12 h显著降低IL-1β（p<0.05/0.01），中剂量仅3 h显著（p<0.01）。IL-10在毒液组3 h、12 h、1、2天显著升高（p<0.05/0.01），高/中剂量3 h抑制（p<0.05），低剂量3 h、12 h、1天抑制（p<0.05），均接近对照组水平。MCP-1毒液组1、3、12 h、24 h显著升高（p<0.01/0.05），中/低剂量在1、3、12 h显著抑制（p<0.01），高剂量仅3 h显著（p<0.01）。部分时间点虽无显著差异但呈下降趋势。

PCCC-CDs改善血小板减少

毒液致血小板急剧下降，1 h即显著（354±70×10⁹/L，p<0.01），3 h谷底（315±77×10⁹/L），此后逐渐恢复但第5天仍低于对照组。高剂量（8 mg/kg）PCCC-CDs在1 h、3 h、12 h、1、2天显著抑制血小板下降（p<0.05/0.01），中/低剂量在部分时间点显著或呈升高趋势。

组织病理学观察

毒液组肾小球正常但肾实质显著出血、肾小管扩张变性。PCCC-CDs联合治疗组肾组织结构近乎正常，仅轻微出血、肾小管扩张变性，病理损伤明显减轻。

讨论

CDs作为新兴纳米材料，因低毒性、良好生物相容性，是下一代纳米药物理想载体。PCCC-CDs准球形、水分散性好、表面官能团丰富，低毒性（L02/293T细胞），适合生物医学应用。

本研究首次证实PCCC-CDs对五步蛇毒致AKI的显著生物活性。五步蛇别名“五步倒”、“百步蛇”，中国分布>90%，咬伤重症/死亡率高于多数毒蛇。AKI致继发肾缺血衰竭，机制复杂。本研究建立腹腔注射毒液AKI模型，评估PCCC-CDs保护作用。

实验显示毒液致显著AKI：约24h出现少尿、蛋白尿、SCR/BUN升高；UTP/MALB升高提示小球功能受损及小管重吸收障碍，病理印证。PCCC-CDs显著降低UTP/MALB，逆转SCR/BUN升高，加速恢复，减轻病理损伤（出血、小管扩张变性），提示抑制毒液直接肾毒性。

剧烈炎症反应是毒蛇咬伤共性。MCP-1招募/激活白细胞，单核吞噬细胞/淋巴细胞分泌促炎介质诱导肾常驻细胞表达趋化因子。本研究证实毒液致MCP-1、IL-1β、IL-10升高，提示AKI发病涉及肾炎症反应。PCCC-CDs显著降低三者水平，提示其肾保护机制涉及抑制肾炎症。

血小板参与急性止血炎症，是AKI发病机制关键细胞，对损伤响应迅速，与预后相关。毒液显著降低PLT，符合蛇毒致血小板减少报道。PCCC-CDs显著升高PLT，与前期止血研究一致。

本研究首次系统揭示五步蛇毒致AKI异常表现：肾功能障碍（蛋白尿、少尿、氮质血症）、病理损伤、炎症反应、血小板减少。PCCC-CDs通过抑制上述损伤展现保护活性，为开发五步蛇咬伤AKI辅助治疗药物提供新策略，也为中药炭有效成分研究及CDs生物医学应用拓展提供新思路。机制研究为后续工作重点。

结论

首次证实PCCC-CDs对五步蛇毒致AKI的显著保护作用，主要表现为改善肾功能障碍、病理损伤、炎症反应及血小板减少。PCCC-CDs有望作为五步蛇咬伤致AKI的辅助治疗药物，同时为中药炭有效成分研究及CDs生物医学应用拓展提供新思路。