M2 巨噬细胞来源的 miR-18a 通过靶向 TGFBR3 激活 TGF-β 通路驱动鼻咽癌进展

摘要

目的

鼻咽癌（NPC）具有高转移侵袭性。肿瘤相关替代活化（M2）巨噬细胞与 NPC 相关。本研究旨在探讨 M2 巨噬细胞来源的 microRNA-18a (miR-18a) 在 NPC 中的机制与作用。

方法

外周血单核细胞分化为巨噬细胞，IL-4 极化为 M2 型。SUNE-1 和 CNE2 细胞转染 miR-18a 模拟物/抑制剂或 TGFBR3 siRNA/过表达载体，探究其在 TGF-β 信号通路中的作用。进一步将转染 miR-18a 或 TGFBR3 的 M2 巨噬细胞与 NPC 细胞 Transwell 共培养，研究其联合效应。

结果

NPC 细胞中 miR-18a 高表达、TGFBR3 低表达。miR-18a 上调、TGFBR3 敲低或共培养 miR-18a 模拟物/si-TGFBR3 转染的 M2 巨噬细胞，促进 SUNE-1 细胞进展、小鼠成瘤，降低 p-Smad1/t-Smad1，升高 p-Smad3/t-Smad3。miR-18a 下调、TGFBR3 过表达或共培养 miR-18a 抑制剂/OE-TGFBR3 转染的 M2 巨噬细胞，抑制 CNE2 细胞进展、成瘤，升高 p-Smad1/t-Smad1，降低 p-Smad3/t-Smad3。

结论

M2 巨噬细胞分泌的 miR-18a 通过抑制 TGFBR3，导致 Smad1 失活、Smad3 激活，促进 NPC 细胞进展及裸鼠成瘤。

引言

NPC 为上皮恶性肿瘤，易局部浸润和早期远处转移。患者常伴第六神经麻痹和 Horner 综合征。主流治疗为放疗及放化疗，但并发症多、耐药性阻碍疗效，寻找潜在靶向治疗迫在眉睫。失调的 miRNA 参与 NPC 发生、转移、耐药。miR-18a 通过抑制 SMG1 激活 mTOR 通路、调控 DICER1、损害 miRNA 生物合成等机制促进 NPC 进展。M2 极化肿瘤相关巨噬细胞与实体瘤/血液瘤进展、转移、耐药相关，预示 NPC 预后不良。TGFBR3 为 TGF-β 共受体，低表达致免疫耐受微环境，瞬时过表达可诱导 NPC 细胞凋亡。已知 miR-181a 极化 M2 巨噬细胞促进转移，但 miR-18a、TGFBR3 与 M2 巨噬细胞在 NPC 中的协同机制尚不清楚，本研究旨在揭示三者相互作用机制。

材料与方法

伦理声明

经中南大学湘雅三医院伦理委员会批准，符合医学伦理标准，获捐献者书面知情同意。动物实验符合国家实验动物管理规定。

外周血单核细胞分离

健康供者外周血经 Ficoll-Paque 密度梯度离心获取单核细胞，贴壁法富集单核细胞。

巨噬细胞分化与极化

M-CSF (100 ng/mL) 诱导单核细胞分化为巨噬细胞（7-8 天，每 3 天换半量培养基）；IL-4 (20 ng/mL) 刺激 24 h 极化为 M2 巨噬细胞。免疫荧光检测 CD68、CD163、CD206 确认巨噬细胞身份；流式细胞术检测 CD68 (21.16%) 和 CD163 (98.69%) 确认 M2 极化；RT-qPCR 显示 M2 标志物 CCL22、PPAR-γ 及 miR-18a 显著上调。

分子生物学检测

RT-qPCR 检测 miR-18a、CCL22、PPAR-γ、TGFBR3 表达（U6/GAPDH 內参，2⁻ΔΔCt 法）。Western blot 检测 TGFBR3、t-Smad1、p-Smad1、t-Smad3、p-Smad3 蛋白（GAPDH 內参，ImageJ 定量）。双荧光素酶报告基因实验验证 miR-18a 直接靶向 TGFBR3 3'UTR。

细胞实验

筛选出 miR-18a 表达差异最大的 CNE2 和最小的 SUNE-1 细胞系。SUNE-1 转染 miR-18a mimics/si-TGFBR3 上调通路；CNE2 转染 miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 下调通路。M2 巨噬细胞转染相应核酸后与 NPC 细胞 Transwell 共培养（0.4 μm 孔径，允许小分子交换）。MTT、克隆形成、划痕、Transwell 侵袭/迁移、流式细胞术（细胞周期 PI 染色、凋亡 Annexin V-FITC/PI 双染）评估细胞功能。

体内成瘤实验

裸鼠腋下注射 SUNE-1/CNE2 细胞 (5×10⁷ cells/mL, 0.2 mL)，SPF 环境饲养，每 4 天测量肿瘤体积/体重，第 20 天处死取瘤称重拍照。

统计分析

SPSS 21.0，均数±标准差，t 检验（两组）、单因素方差分析+Tukey 事后检验（多组），P<0.05 为显著差异。

结果

M2 巨噬细胞鉴定与 miR-18a 表达

免疫荧光、流式、RT-qPCR 确认 M2 巨噬细胞成功极化，且 miR-18a 在 M2 中显著高于 M0（图 1）。

miR-18a 高表达、TGFBR3 低表达于 NPC 细胞

生物信息学预测并双荧光素酶实验验证 miR-18a 直接靶向 TGFBR3 3'UTR（图 2a,b）。转染实验证实 miR-18a 负调控 TGFBR3（图 2c,d）。NPC 细胞系 (CNE2, TW03, C666-1, SUNE-1) 较正常 NP96 细胞，miR-18a 上调、TGFBR3 下调（图 2e）。SUNE-1 转染 miR-18a mimics/si-TGFBR3 后 miR-18a 升、TGFBR3 降（图 2f）；CNE2 转染 miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 后 miR-18a 降、TGFBR3 升（图 2g）。共培养实验显示 M2 巨噬细胞分泌 miR-18a 进入 NPC 细胞下调 TGFBR3（图 2h,i）。

miR-18a 促进 NPC 细胞活力与克隆形成

MTT 和克隆形成实验：miR-18a 上调或 TGFBR3 下调增强 SUNE-1 活力和克隆数（图 3a,e）；miR-18a 下调或 TGFBR3 上调抑制 CNE2（图 3b,f）。共培养 M2 巨噬细胞（尤其 miR-18a mimics/si-TGFBR3 转染）促进 SUNE-1（图 3c,g）；共培养 miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 转染 M2 巨噬细胞抑制 CNE2（图 3d,h）。

miR-18a 促进 NPC 细胞侵袭迁移

划痕和 Transwell 实验：miR-18a mimics/si-TGFBR3 增加 SUNE-1 迁移/侵袭（图 4a, 5a）；miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 减少 CNE2 迁移/侵袭（图 4b, 5b）。共培养结果一致（图 4c,d, 5c,d）。

miR-18a 减少 G0/G1 期阻滞、抑制凋亡

流式检测：miR-18a mimics/si-TGFBR3 减少 SUNE-1 G0/G1 期细胞，增加 S/G2/M 期，降低凋亡率（图 6a, 7a）；miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 作用相反（图 6b, 7b）。共培养 M2 巨噬细胞重现上述表型（图 6c,d, 7c,d）。

miR-18a 调控 TGF-β 通路关键蛋白

Western blot：miR-18a mimics/si-TGFBR3 降低 SUNE-1 p-Smad1/t-Smad1，升高 p-Smad3/t-Smad3（图 8a）；miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 在 CNE2 中作用相反（图 8b）。共培养实验确认 M2 巨噬细胞分泌 miR-18a 通过 TGFBR3 调控 Smad1/3 磷酸化平衡（图 8c,d）。

miR-18a 促进裸鼠成瘤

原位注射转染细胞或共培养后的细胞：miR-18a mimics/si-TGFBR3 组肿瘤体积/重量显著增大（图 9a,c）；miR-18a inhibitors/OE-TGFBR3 组显著减小（图 9b,d）。

讨论

本研究揭示 M2 巨噬细胞分泌 miR-18a 抑制 TGFBR3，激活 TGF-β/Smad3 通路、抑制 Smad1 通路，驱动 NPC 进展（图 10）。M2 极化富集 miR-18a，M2 表型促进肿瘤生长血管生成。结果与既往研究一致：miR-18a 在 NPC 组织高表达关联淋巴结转移、临床分期；TGFBR3 低表达关联不良预后。体外体内实验均证实 miR-18a 促进、TGFBR3 抑制 NPC 进展。双荧光素酶实验验证 TGFBR3 为 miR-18a 直接靶点。大样本队列研究仍需进一步验证。

结论

本研究阐明 M2 巨噬细胞源性 miR-18a 通过抑制 TGFBR3、失活 Smad1/激活 Smad3 激活 TGF-β 通路，加剧 NPC 进展；miR-18a 敲低或 TGFBR3 过表达可逆转该过程。为 NPC 靶向治疗提供新靶点，但需大队列深入研究验证。