逆向胶束合成纳米藻酸盐载体：多柔比星封装及其在小鼠乳腺癌细胞中的细胞毒性

摘要

交联藻酸盐纳米颗粒是药物封装和递送的理想平台。本文报道了一种简单的逆向胶束方案，将水溶性多柔比星（DOX）负载进钙交联藻酸盐基质中，制得NALG-DOX颗粒，其流体动力学直径约83 nm，zeta电位+7.2 mV。TEM证实纳米藻酸盐（NALG）颗粒呈球形且单分散。DOX释放受控，生理pH下4 h保留约70%，24 h释放约90%。荧光成像证实NALG-DOX中的DOX被4T1小鼠乳腺癌细胞摄取。细胞毒性实验（LIVE/DEAD和Alamar Blue）显示NALG-DOX的IC₅₀为0.45 µg/mL，游离DOX为0.093 µg/mL，而空白NALG载体无毒性。结果证明逆向胶束法制备生物相容性药物负载藻酸盐纳米颗粒的潜力。

背景

化疗药物封装相比游离药物全身给药具有优势，包括延长循环时间、免受血浆蛋白影响、降低全身毒性。纳米载体可利用实体瘤的增强渗透和滞留（EPR）效应，在尺寸合适时实现被动靶向。虽然脂质体、聚合物颗粒和脂质纳米颗粒已进入临床，但许多新制剂面临规模化制备和重现性挑战。藻酸盐是一种天然来源的可生物降解、非免疫原性多糖，可通过二价阳离子（通常为Ca²⁺）交联形成水凝胶纳米颗粒。本研究展示了一种快速、室温下的逆向胶束合成法，制备均一的藻酸盐纳米颗粒，可封装亲水性药物如DOX。

方法

材料

海藻酸钠、氯化钙二水合物、环己烷、十二胺和盐酸多柔比星分别从Sigma‑Aldrich和MedChem Express购买。所有溶液用18 MΩ水配制。

纳米藻酸盐（NALG）制备

海藻酸钠（15 mg/mL）搅拌30 min至完全溶解。负载DOX时，药物溶于同一水相。将8 mL环己烷置于小瓶，加入80 µL十二胺（温水溶解）形成油相。在剧烈搅拌（1,200 rpm）下加入20 µL水相海藻酸钠/DOX溶液，反应20 min，再加入30 µL 50 mM CaCl₂使藻酸盐在逆向胶束中交联。25 min后加入2 mL水分离水相，用移液管回收纳米颗粒。

纯化

水相提取物依次通过100 kDa和10 kDa离心过滤装置（Pall, Millipore）去除聚集体和游离药物，得1 mL纯化的NALG或NALG‑DOX。

表征

动态光散射（Malvern Zetasizer）测定粒径（633 nm激光，25 °C，173°后向散射）。随即测定zeta电位。透射电镜（TEM，Tecnai F‑20，4 kV）确认形貌。DOX含量利用其内在荧光（激发470 nm，发射550 nm）并对比标准曲线定量。

释放研究

透析（Slide‑A‑Lyzer MINI，2 kDa MWCO）在PBS（pH 7.4）和柠檬酸缓冲液（pH 5.5）中，于1、2、4、24、48、72 h测定DOX释放，荧光读数计算释放浓度。

细胞培养与处理

4T1‑luc2‑GFP小鼠乳腺癌细胞（PerkinElmer）用RPMI 1640 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素培养。以4,000细胞/孔接种于96孔板，24 h后用NALG、游离DOX或NALG‑DOX不同浓度处理。

荧光成像

48 h后，福尔马林固定，NucBlue染色，EVOS FL Auto（ThermoFisher）成像，使用DAPI、GFP和DOX通道。ImageJ处理图像。

Live/Dead实验

72 h时，孵育NucBlue Live和NucGreen Dead试剂（ThermoFisher），固定后同法成像，绿色荧光指示死细胞。

Alamar Blue活力实验

72 h加入Alamar Blue（10 µL/孔，100 µL培养基），37 °C孵育1 h，Tecan Infinite M200 Pro读数（560/590 nm），以未处理对照为100%计算细胞活力。

结果与讨论

逆向胶束合成

逆向胶束法制得透明的NALG和NALG‑DOX水相胶体。环己烷作油相，十二胺作表面活性剂稳定胶束内藻酸盐链。氯化钙交联形成水凝胶网络，水相萃取得单分散颗粒。

颗粒表征

DLS显示NALG粒径92.2 ± 4.2 nm（PDI 0.320 ± 0.063，ζ –15.0 ± 0.8 mV），NALG‑DOX粒径82.8 ± 3.6 nm（PDI 0.204 ± 0.044，ζ +7.2 ± 4.6 mV）。TEM证实球形形貌，直径与DLS一致。DOX负载量约7%（≈4 µg/mL），封装效率中等，符合聚合物载体典型水平。