纳米藻酸盐通过反胶束合成：阿霉素封装和乳腺癌细胞毒性

背景

与将游离药物全身给药到血液中相比，治疗有效载荷的封装提供了许多优势。通过纳米载体递送增加循环时间 [1,2,3]、屏蔽血浆蛋白 [4] 和降低全身毒性 [5, 6] 可能会显着提高治疗效果。此外，如果将治疗剂封装在适当大小或类型的载体中，则实体瘤的渗透性和保留增强可用于被动靶向[7,8,9]。许多疗法已被纳入纳米载体，包括阿霉素 (DOX) [6, 10,11,12]、顺铂 [13, 14] 和紫杉醇 [15,16,17]。此外，许多载体技术，如脂质体 [18,19,20,21]、基于聚合物的载体 [15,22,23,24,25] 和脂质纳米粒子 [26,27,28,29]，已经开始对临床结果产生影响。然而，这些化合物的制备和加工过程中的挑战往往阻碍了新配方的转化。在这里，我们提出了一种简单、可靠和稳健的方法来生产能够封装亲水性化学治疗剂的生物相容性海藻酸盐纳米载体。

生物聚合物已被用于封装治疗剂，部分原因在于它们的易用性和生物相容性 [30]。使用的聚合物包括藻酸盐 [31, 32]、肝素 [33, 34]、壳聚糖 [35, 36] 和角叉菜胶 [37, 38] 等。海藻酸盐是一种天然衍生的聚合物，由不同数量的 β-d-甘露糖醛酸和 α-l-古洛糖醛酸残基通过 1,4-糖苷键连接 [39]（分别为 M 和 G 嵌段）组成。海藻酸盐可以通过添加多价阳离子进行交联，其中钙是常用的 [40,41,42]。钙的存在会导致连接的 G 嵌段之间形成更大的堆积结构，称为“蛋盒”结构 [43]。溶液中藻酸盐链的交联产生水凝胶。其他聚合物，如壳聚糖 [43,44,45]，会影响颗粒的结构特性。藻酸盐链上的羟基和羧酸基团为聚合物的组装结构赋予负总电荷 [14, 46]。通过连接羧酸并形成三维矩阵，可以捕获治疗药物。

阿霉素是一种广泛使用的化疗药物，用于治疗各种癌症 [47]。阿霉素的主要作用机制涉及与复制相关酶的结合，这允许嵌入 DNA 链。它还能够直接插入到 DNA 链中。结果是复制过程被破坏，从而阻止细胞增殖，并导致细胞凋亡 [48]。除了这种机制，阿霉素还与细胞中活性氧的产生有关 [48, 49]。多柔比星非常有效 [6, 50]，但具有涉及多个器官的严重毒性作用，包括心脏 [51, 52]、脑 [53]、肝脏 [47] 和肾脏 [54]。封装可降低全身毒性，脂质体 Doxil 已成为众所周知的成功 [7]。

海藻酸盐是一种低成本、生物相容性、可生物降解且易于采购的物质，通常被认为是非免疫原性的 [55, 56]。由交联藻酸盐形成的水凝胶纳米颗粒已用于封装各种治疗剂 [56]。这些过程从表面活性剂驱动的反胶束形成 [39] 到机械刺激或温度诱导的颗粒形成 [41]。我们提出了一种生产相对单分散的藻酸盐纳米载体的简单而可靠的方法。该合成过程在室温下进行（与 Machado 等人提出的不同），只需几个小时即可完成。反胶束过程将水溶性治疗剂结合到藻酸盐基质中，无需化学修饰。藻酸盐纳米粒子的动态光散射 (DLS) 测量显示粒子的均匀分布~ 80-90 nm。电子显微镜证实了颗粒的尺寸和粗糙的球形形态。与游离多柔比星相比，包裹在纳米颗粒海藻酸盐基质中的多柔比星在体外表现出明显的疗效，表明未来的研究可以研究该药物在体内的疗效。

方法

材料

海藻酸钠、二水氯化钙、环己烷 (99.9%) 和十二烷胺 (98%) 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。盐酸多柔比星购自 MedChem Express (Monmouth Junction, NJ)。这些试剂按原样使用，如所示将海藻酸钠和治疗剂溶解在水中。所有水均为Milli-Q源提供的18 MΩ过滤水。

纳米藻酸盐的制备

将海藻酸钠以 15 毫克/毫升的浓度溶解在玻璃小瓶中，并在使用前通过搅拌棒混合至少 30 分钟。如果要将 DOX 并入纳米载体，则将 DOX 溶解在该​​水相中。在用于合成之前检查藻酸盐溶液是否完全溶解藻酸盐粉末。如果不引入多价阳离子，海藻酸盐水相可保持均匀数周。将八毫升环己烷移入小瓶中。十二胺，室温下的固体，在温水中加热几分钟，直到一些固体转化为液体形式。然后，将 80 μL 的十二胺吸移到环己烷中。将搅拌棒加入玻璃小瓶中，然后以 125 rpm 搅拌混合物。混合 5 分钟后，认为有机相已充分混合并准备好加入水相。将 20 微升藻酸盐水相加入环己烷/十二胺有机相中。搅拌速率增加到 1200 rpm。在持续搅拌 20 分钟下进行混合。然后将 30 微升 50 mM 氯化钙溶液加入混合物中。颗粒混合/胶凝 25 分钟后，将 2 mL 水加入混合物中，在有机层下方形成水层。纳米颗粒分离到水相中，用1 mL移液管去除水层。

NALG的纯化

水层在 100 kDa 离心过滤装置 (Pall) 中以 3200 x g 离心 10 分钟 在离心机中去除大聚集体，并将渗透物转移到 10 kDa 单位（Millipore）。然后将溶液以相同速度旋转 5 分钟以滤除小杂质。加入水并旋转 5 分钟以洗涤滞留物。收集最终体积 1 mL，并对该产品进行表征。

NALG 的特征

将过滤后的纳米颗粒溶液转移到比色皿（Malvern Instruments，DTS 1070 zeta 池）中进行动态光散射测量。粒度分布使用 Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, UK) 测定。尺寸测量是使用 633 nm 波长的激光在 25°C 下进行的，检测方法为 173° 反向散射角。藻酸盐纳米颗粒的 Zeta 电位测量在尺寸测量后立即在同一比色皿中进行。大小和 zeta 电位的测量一式三份进行，显示的结果表明三个试验的平均值 ± 标准偏差。透射电子显微镜 (TEM) 用于确认纳米颗粒的尺寸并研究它们的形态。 TEM 图像是使用 Technai F-20 透射电子显微镜在 4200 eV 下操作获得的。 TEM 网格的制备涉及将 10 μL 过滤后的纳米颗粒溶液逐滴沉积到 formavar/碳背衬 TEM 网格 (Ted Pella) 的铜表面上。在成像前将湿 TEM 网格放置在干燥器中过夜，以确保适当干燥。

多柔比星具有内在荧光，可用于将多柔比星海藻酸盐纳米颗粒 (NALG-DOX) 的荧光与 DOX 的标准曲线进行比较，以估计其浓度。我们使用了 470/550 nm 的激发/发射波长。通过将最终过滤的纳米颗粒溶液透析到 pH 7.4 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或 pH 5.5 的柠檬酸盐缓冲液中来确定阿霉素从 NALG-DOX 溶液中的释放。如前所述制备两组五批的 NALG-DOX，藻酸盐水溶液中的初始 DOX 浓度为 1.25 mg/mL。通过向每个装置添加 100 μL NALG-DOX 制备了 18 个内体积为 100 μL 且截留分子量为 2 kDa 的 Slide-A-Lyzer MINI 透析装置 (ThermoFisher)。每个装置都放置在含有 20 mL 缓冲液的闪烁瓶中。将搅拌棒添加到每个含有缓冲液的小瓶中，并将所有小瓶放在搅拌板上，以便在实验期间轻轻搅拌。将小瓶盖上以减少缓冲液因蒸发而损失，并避光。在每个时间点（1、2、4、24、48、72 小时），移除三个装置，从每个装置中取出 100 μL 样品并置于单独的孔中，并在 Tecan 上进行荧光测量Infinite M200 Pro 酶标仪（Tecan Trading AG），波长为 470/550 nm。将荧光测量值与标准曲线的测量值和实验前的初始等分试样进行比较，以确定缓冲液中 DOX 的浓度和损失量。

细胞培养和给药

从 PerkinElmer (Waltham, MA) 获得鼠乳腺癌细胞、Bioware Ultra Green 细胞系 4T1 荧光素酶/绿色荧光蛋白（4T1-luc2-GFP，小鼠腺癌）和无报告基因 4T1 细胞。这些细胞在 37°C 的 5% CO2 培养箱中用补充有 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素/链霉素的 RPMI 1640 培养基维持。 4T1 细胞以 4000 个细胞/孔接种在 96 孔黑色壁透明底板中。接种孔后24小时，吸出初始培养基，并引入药物/培养基配方。

荧光成像

在 48 h 时，吸出培养基，用 PBS 洗涤细胞 3 次，并在孔中加入福尔马林。室温孵育 30 分钟后，将细胞再次用 PBS 洗涤 3 次，并将每毫升培养基中两滴 NucBlue 固定细胞 ReadyProbes 试剂（ThermoFisher）加入孔中。室温孵育 1 小时后，再次用 PBS 洗涤细胞 3 次。然后，将 100 μL PBS 添加到固定细胞中，并将板转移到 EVOS FL Auto Cell Imaging System (ThermoFisher)。 × 20 的物镜用于对每个板中某些孔的部分进行成像。分别记录每个荧光通道的图像； 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的蓝色图像、DOX 的红色图像（使用 RFP 通道捕获固有荧光）和绿色图像的 GFP。 4T1-luc2-GFP 细胞表达绿色荧光蛋白，因此无需额外染色即可在绿色通道中看到细胞。 DOX 处理会“染色”细胞，不需要进一步的试剂在红色通道中对其进行可视化。图像在 ImageJ 中进行了亮度/对比度调整。

活/死细胞活力测定

使用 LIVE/DEAD 细胞活力测定 (ThermoFisher) 对 4T1 细胞与 NALG、DOX 和 NALG-DOX 共孵育后的活力进行定性评估。在引入载有药物的培养基后 72 小时，吸出培养基，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。 LIVE/DEAD 检测是通过从每毫升培养基中的每滴 NucBlue Live Reagent 和 NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) 滴管中加入两滴来进行的。孵育 30 分钟后，再用 PBS 洗涤 3 次，并将福尔马林加入孔中以固定细胞。在福尔马林之后用 PBS 再洗涤 3 次，并将最后 100 μL 量的 PBS 添加到每个孔中。如上所述进行了类似的成像，但绿色通道现在表明存在死细胞，因为受损的细胞膜允许绿色试剂进入细胞。

活/死细胞活力测定

使用 Alamar Blue 细胞活力测定 (ThermoFisher) 对与 NALG、DOX 和 NALG-DOX 共孵育后 4T1 细胞活力的定量评估。在引入载有药物的培养基后 72 小时，吸出培养基。通过将 10 μL 的 Alamar Blue 试剂与 100 μL 的新培养基一起添加到每个孔中并在 37°C 下孵育 1 小时来进行 Alamar Blue 测定。 1 小时后，使用 Tecan Infinite M200 Pro 酶标仪（Tecan Trading AG）测定每个孔的细胞活力。激发/发射波长设置为 560/590，通过软件确定板的最佳增益设置，并使用底部读取协议读取板中每个孔的荧光强度。 % 细胞活力可以通过以下等式从荧光强度读数中确定：

结果和讨论

反胶束乳化工艺

在这项工作中，纳米藻酸盐药物载体 NALG 通过反胶束乳液工艺制备，如图 1 所示。将藻酸盐水溶液加入环己烷/十二胺油相中，形成反胶束。然后通过添加氯化钙 (CaCl2) 溶液使藻酸盐交联。在经过时间以允许反胶束内的藻酸盐交联之后，通过添加水来提取NALG。最后，离心过滤器去除潜在污染物并帮助缩小纳米颗粒的尺寸分布。最终产品为透明胶体水溶液。

NALG和NALG-DOX的形成过程。 一 反胶束合成过程的示意图。含水藻酸盐链在有机浴（上）中交联，萃取到水相（左下），然后过滤纯化（右下）。 b Ca ²⁺ 的分子相互作用 交联，导致形成NALG。 c 各点合成照片，从左到右，CaCl2加入前乳液，CaCl2加入后乳液，加水分离

反胶束乳液体系的组分是根据实验数据和过去的文献确定的。为了缩小系统的自由度，我们选择环己烷作为有机相。在此过程的优化过程中，我们测试了一系列表面活性剂形成纳米级藻酸盐颗粒的能力，这表明在搅拌下引入少量水相后有机混合物的浊度增加。十二胺是一个合适的候选者，并被选为表面活性剂以继续使用。本实验中选择水作为水相。

NALG 的特征

在图 2a、b 中，显示了 NALG 和 NALG-DOX 的纳米颗粒流体动力学尺寸的分布。纳米颗粒，无论是空的还是治疗负载的，都显示出以 90 nm 为中心的类似峰。 NALG 和 NALG-DOX 的粒径分别为 92.2 ± 4.2 nm 和 82.8 ± 3.6 nm。颗粒的多分散指数 (PDI) 分别为 0.320 ± 0.063 和 0.204 ± 0.044，ζ 电位分别为 - 15.0 ± 0.8 mV 和 7.2 ± 4.2 ± 4.6。 <图片>

a 的动态光散射分布 NALG 和 b NALG-DOX 显示海藻酸盐纳米颗粒的单分散分布。 c 的透射电子显微镜图像 NALG 和 d NALG-DOX 显示颗粒的球形形态。比例尺在大图中表示 50 纳米，在插图中表示 20 纳米

将 DOX 掺入藻酸盐基质后，颗粒的尺寸是一致的。空 NALG 的 ζ 电位为负，这与其他通过钙连接的藻酸盐纳米粒子一致 [39]。载有阿霉素的颗粒具有正 ζ 电位。这可能部分是由于颗粒表面带正电荷的钙离子过量，这可能有助于在纳米颗粒上赋予正电荷。此外，存在于 DOX 分子上的伯胺可以与藻酸盐上的游离羧酸基团发生静电相互作用，从而减少颗粒表面的负电荷。

图 2c、d 显示了钙交联的 NALG 和 NALG-DOX 的透射电子显微镜图像。两种类型的纳米颗粒都显示出球形形态。纳米粒子的一般分布在大小上似乎与 DLS 分布相似。使用阿霉素分子的固有荧光评估最终 NALG-DOX 溶液的浓度。将过滤后的 NALG-DOX 产品的体积分成三套透析装置，置于充满 PBS 的闪烁瓶中，并允许 DOX 从 NALG-DOX 中释放不同的时间。最初，NALG-DOX 溶液中 DOX 的浓度为~ 4 μg/mL，表明 NALG-DOX 的封装效率或 NALG-DOX 中 DOX 与添加到制剂中的初始 DOX 的比率为~ 7%。虽然与类似颗粒相比，这种封装效率被认为较低 [57]，但这可能是由于水相中存在初始 DOX。我们没有通过降低初始水相中存在的 DOX 量来迭代配方，并假设可以通过降低初始配方中 DOX 的量来提高效率。未封装的 DOX 很可能在合成结束时通过 3 kDa 过滤器洗涤。由于多柔比星的可用性和相对较低的成本，我们选择用 DOX“饱和”制剂，因为知道大量剩余的 DOX 可能会通过未封装的。提高封装效率可以在未来的工作中改进该粒子平台。

NALG-DOX 在 pH 5.5 和 7.4 下的释放曲线见图 3。NALG-DOX 在前 4 小时内保留了大约 70% 的 DOX 有效载荷，90% 的颗粒在 24 小时内离开, 在 pH 值 7.4。这种释放模式在聚合物材料中很常见 [57, 58]，并且在暴露于 PBS 储库时的前 24 小时内表现出受控释放。在 5.5 的较低 pH 值下，更类似于纳米颗粒在晚期内体中细胞摄取期间所见的 pH 值 [59]，DOX 以更快的速度释放。这是理想的行为，因为在血液中的一般循环中需要较慢的释放，但在酸性肿瘤微环境中，优选较快的释放。

从纳米颗粒溶液中释放多柔比星显示在 PBS，pH 7.4 中的前 24 小时内受控释放。在 pH 5.5 时，阿霉素的释放速度更快。每个点代表n的均值 ± 标准差 =3 次测量

DOX 的细胞摄取

48 小时时 4T1 小鼠乳腺癌细胞对 NALG-DOX 的吸收如图 4a、b 所示。每行表示一个单独的颜色通道，底行显示所有颜色通道的合成图像。在左栏中，使用了高浓度的 DOX 或 NALG-DOX，足以消除大部分细胞。中间一列显示 DOX 的浓度为 0.31 μg/mL，NALG-DOX 中 DOX 的浓度为 0.28 μg/mL，这显示了一些细胞杀伤潜力，右列显示了未处理的细胞。中心图像中的细胞显示多柔比星（红色）围绕并与细胞核（蓝色）重叠。由于存在 DOX，与未处理的孔相比，DOX 抑制了细胞增殖，因此 a 和 b 图中的前两列中的细胞数量减少。多柔比星通过嵌入核 DNA 发挥作用 [12]，多柔比星和细胞核的共定位表明它在摄取时通过这种机制发挥作用。在图 4b 中，包裹的多柔比星在核区域的外围是明显的。右列显示未处理的细胞，在红色通道中未检测到显着信​​号。游离 DOX 虽然有效，但会造成脱靶毒性并缩短体内循环时间。封装允许在增加循环时间的情况下更稳定地释放，使 NALG-DOX 在体内可能更好，并且可以在未来的工作中进行探索。

用多柔比星 (DOX) 处理的固定 4T1-luc2-GFP 乳腺癌细胞图像的荧光显微镜检查 (a ) 和 NALG-DOX (b ) 暴露 48 小时后。比例尺表示 100 μm。蓝色核染色：DAPI；绿色（转染细胞系）：GFP；红色（固有分子荧光）：DOX

NALG-DOX 的细胞毒性

作为细胞杀伤潜力的基本测试，未处理的 4T1 细胞和用 NALG-DOX 处理的细胞用 LIVE/DEAD 细胞测定 (ThermoFisher) 染色并在暴露 72 小时后固定。图 5a-d 分别显示了未经处理的孔、用 NALG 处理的孔、用 0.078 μg/mL DOX 处理的孔和用 0.20 μg/mL NALG-DOX 处理的孔的示例图像。图 5c、d 中显示的绿色重叠表明这些孔中的 DOX 和 NALG-DOX 处理导致该孔中的许多细胞死亡。由于治疗剂的存在，细胞不能以与图 5a、b 所示的未处理和空纳米颗粒处理孔中相同的方式增殖。 NALG和NALG-DOX中用于给药的纳米颗粒稀释度相同。

LIVE/DEAD 荧光检测表明未经处理的 4T1 细胞几乎没有细胞死亡 (a ) 和在用 NALG (b ）。在用 0.078 μg/mL DOX (c ) 和 0.20 μg/mL NALG-DOX (d )，表明细胞死亡。比例尺表示 100 μm。浓度表示游离或颗粒中 DOX 的量。 NALG 在 (b ) 在与 NALG-DOX 相同的粒子密度

4T1-luc2-GFP 细胞在暴露于 NALG、游离 DOX 和 NALG-DOX 72 小时后通过 Alamar Blue (ThermoFisher) 测定的细胞活力的定量评估如图 6 所示。在图 6a 中，游离多柔比星-处理的细胞在整个浓度范围内显示出比 NALG-DOX 处理的细胞（对于等效浓度的 DOX）更少的活细胞。这通过 IC50 值或显示 50% 抑制作用所需的浓度进一步显示，对于游离 DOX 和 NALG-DOX，IC50 值分别为 0.093 μg/mL 和 0.45 μg/mL。游离 DOX 值类似于 Du 等人 在 72 小时针对 4T1 细胞发现的值。 [60]。 IC50 值与 Eliaz 等人发现的值相似。使用 DOX 和脂质体包裹的 DOX 在 72 小时后对抗 B16F10 黑色素瘤细胞 [61]。

4T1-luc2-GFP 细胞在暴露于 NALG-DOX 和 DOX 72 小时后的细胞活力 (a ) 和 NALG (b ) 在不同的浓度。数据点和误差条表示与 n 的均值 ± 标准偏差 =3 孔。浓度表示 (a ）。在b , NALG 孔从与 NALG-DOX 相同的颗粒浓度开始给药，表明仅药物载体很少或没有细胞死亡

NALG-DOX 需要更高浓度的阿霉素才能显示与游离药物相似的效果。这应该是意料之中的，因为封装的治疗剂在运输到其作用部位时受到更大的阻碍。封装的阿霉素仍然显示出细胞抑制作用，这意味着该药物仍然具有治疗活性，或者纳米颗粒本身对细胞有毒。为了对此进行测试，以与 NALG-DOX 类似的方式评估了 NALG 的生存能力。 NALG在所有浓度下均表现出最小的毒性，如图6b所示，表明该药物是有效的。

结论

我们开发了一种反胶束平台，能够生产尺寸 ~ 90 nm 的球形藻酸盐纳米粒子。在 4T1-luc2-GFP 乳腺癌细胞中检查了 NALG-DOX 吸收，当封装在藻酸盐载体中时，显示出对细胞核附近位置的明显吸收。通过检查治疗性 IC50 值比较游离药物与包封药物的细胞毒性。与游离药物对应物相比，封装的阿霉素表现出较低的毒性。这些 NALG-DOX 可能对药物递送目的非常感兴趣，因为在封装形式的全身给药中，阿霉素的脱靶效应会降低。未来的配方将针对较慢的控释曲线和增加的封装进行优化。这种简便的过程提供了一种可在短短几个小时内完成的高效合成路线，从而可以快速进行进一步的表征、体外和体内实验。

缩写

4T1-luc2-GFP：

4T1荧光素酶/绿色荧光蛋白

氯化钙：

氯化钙

DAPI：

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚

DLS：

动态光散射

DMSO：

二甲亚砜

DOX：

阿霉素

NALG：

海藻酸盐纳米颗粒

NALG-DOX：

多柔比星海藻酸盐纳米粒

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

PDI：

多分散指数

TEM：

透射电子显微镜