恢复miR-133a-3p或抑制PSAT1通过抑制GSK3β/β-连环蛋白通路限制内皮损伤驱动的颅内动脉瘤

摘要

微小RNA-133a-3p（miR-133a-3p）在颅内动脉瘤（IA）中的功能角色尚不清楚。本研究旨在探讨miR-133a-3p通过磷酸丝氨酸氨基转移酶1（PSAT1）/糖原合酶激酶3β（GSK3β）/β-连环蛋白信号通路调控血管内皮损伤诱导IA的机制。收集脑外伤患者正常颅内小动脉组织和IA患者动脉瘤组织，经RT-qPCR和Western blot检测miR-133a-3p、PSAT1、GSK3β、β-连环蛋白表达。培养人IA内皮细胞（EC），转染miR-133a-3p模拟物和si-PSAT1，检测其对EC迁移、凋亡、增殖的影响，并测定相关分子表达。建立IA大鼠模型，检测病理改变及体内相关分子表达。结果显示：miR-133a-3p表达与动脉瘤数量和大小相关；IA组织中miR-133a-3p下调，PSAT1、GSK3β、β-连环蛋白上调；恢复miR-133a-3p或敲低PSAT1可减轻病理改变，降低PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白表达，抑制EC凋亡、促进增殖迁移，并降低体内VEGF和MMP-9表达。研究表明，miR-133a-3p过表达或PSAT1下调通过抑制GSK3β/β-连环蛋白通路保护内皮细胞，促进其增殖，miR-133a-3p或成IA潜在标志物和治疗靶点。

假说提出

推测miR-133a-3p/PSAT1轴可能通过调节GSK3β/β-连环蛋白通路影响内皮细胞损伤诱导的IA。

假说验证

收集临床样本、人IA内皮细胞并建立IA大鼠模型，阐明miR-133a-3p和PSAT1在IA过程中的功能。

假说意义

研究证实：miR-133a-3p过表达或PSAT1下调通过抑制GSK3β/β-连环蛋白通路限制内皮损伤、促进内皮增殖，为IA靶向治疗提供新思路。

引言

颅内动脉瘤（IA）是一种脑血管疾病，表现为脑动脉异常膨隆及破裂导致的蛛网膜下腔出血（SAH），致死致残率高。IA发病机制尚未完全阐明。IA虽有家族遗传倾向，但多认为是高血压、吸烟等传统风险因素导致的获得性血管损伤结果。血管内栓塞或显微手术夹闭可预防高风险未破裂动脉瘤再出血，但术后恢复不佳者仍存。亟需深入探究机制、寻找新疗法。

微小RNA（miRNA）是一类非编码RNA，通过转录后抑制翻译或介导mRNA降解调控靶基因表达。研究显示miR-133a-3p在多种恶性肿瘤中作为抑癌因子，过表达可抑制结直肠癌细胞生长。另有研究表明miR-133a-3p通过阻断自噬介导的谷氨酰胺分解抑制胃癌转移生长，并参与心脏发育和心肌肥大调节。相关研究发现miR-195-5p上调通过抑制PSAT1依赖的GSK3β/β-连环蛋白通路降低卵巢癌血管生成和顺铂耐药；miR-365通过调节PSAT1抑制食管鳞癌侵袭生长。PSAT1是丝氨酸生物合成关键酶，最初从羊脑分离，多组织高表达。文献报道PSAT1通过调节GSK3β/β-连环蛋白通路介导乳腺癌细胞周期进程；Liu等指出PSAT1促进食管鳞癌发展并预示预后差，是潜在抗癌靶点。基于上述分析，本研究旨在揭示miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白轴在IA中的功能角色。

材料与方法

伦理声明

经天津中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。动物实验符合国际实验动物护理使用指南。

研究对象

2016年1月-2018年3月，收集天津中医药大学第一附属医院神经外科行显微手术治疗的SAH合并IA患者病理样本75例（IA组：29男46女，31-55岁，平均44.98±6.79岁）。同期脑外伤患者正常颅内小动脉组织75例为对照组（43男32女，34-56岁，平均48.14±8.68岁）。排除高血压、糖尿病、肿瘤病史者。两组性别年龄无显著差异（P>0.05）。

样本处理保存

手术切取样本分三部分：甲醛固定、梯度酒精脱水、石蜡包埋切片作HE染色和免疫组化；液氮速冻后-80°C保存供Western blot和RT-qPCR；戊二醛固定供电镜观察；部分用于EC分离培养。

电镜观察

3%戊二醛固定，1%四氧化锇复固，丙酮脱水，Epon812包埋，切3 μm半薄切片，醋酸铀/柠檬酸铅双染色，H-600IV透射电镜（日立）观察。

HE染色

石蜡切片60°C烘烤30分钟，二甲苯透明、梯度酒精脱水、PBS洗涤，苏木精染色、氨水分化、伊红复染、脱水透明、中性树脂封片，光学显微镜观察记录。

免疫组化染色

Zymed试剂盒。石蜡切片脱蜡水化，3% H₂O₂封闭内源过氧化物酶，山羊血清封闭，一抗（MMP-9 5 μg/mL、VEGF 1:250）孵育1-2小时，生物素化二抗30-60分钟，链霉亲和素-过氧化物酶复合物，新制DAB显色，复染封片。Nikon SPOT FlexTM成像系统获图，定量分析软件测定阳性表达面积，每样本随机选5个高倍视场取平均吸光度统计。

EC分离培养鉴定

组织切成3 mm²小块，0.1%胶原酶B/0.1%解散酶消化25分钟，吹打过100 μm筛网分离。悬液离心后用含生长因子和20% FBS的MV2培养基重悬，接种于纤维连接蛋白包被皿（10⁴ cells/cm²），5% CO₂培养1天。换新培养基，80-100%融合时用UEA-1包被磁珠免疫分离纯化EC。EC贴壁增殖4-6天达汇合。免疫细胞化学染色CD31和FVIII相关抗原鉴定，阳性率95%。

细胞分组转染

分7组：对照组（正常血管EC）、IA组（IA血管EC）、mimic NC组、miR-133a-3p mimic组、si-NC组、si-PSAT1组、miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1组。核酸由GenePharma设计合成，Lipofectamine 2000转染。

流式细胞术检测凋亡

0.25%胰蛋白酶消化，800 rpm离心5分钟，1×结合缓冲液重悬至1×10⁷ cells/mL。100 μL细胞悬液加5 μL PI（20 μg/mL）和Annexin V-FITC孵育20分钟，加400 μL结合缓冲液，1小时内流式检测。Q4（FITC⁻/PI⁻）活细胞，Q3（FITC⁺/PI⁻）早期凋亡，Q2（FITC⁺/PI⁺）晚期凋亡/坏死；凋亡率=Q3+Q2。

MTT法检测增殖

胰酶消化制备悬液，计数调整至5×10⁴ cells/mL，96孔板接种。48小时后加20 μL MTT孵育4小时，150 μL DMSO溶解，570 nm测OD值计算增殖率。

划痕实验检测迁移

24孔板接种2×10⁵ cells/孔，三复孔。90%融合时无菌枪头划痕，洗去浮细胞换新培养基，24小时后显微镜观察，National Instruments Vision Assistant 8.6软件量化愈合面积。迁移率=愈合面积/初始划痕面积×100%。

IA大鼠模型构建与干预

84只7周龄SD大鼠（180-200 g），按文献[15]建立IA模型。按症状判断破裂：进食饮水减少（24小时体重下降~10%）、躯干前肢屈曲、单侧行走、静止侧倾无自主活动。症状出现者术后3个月处死取组织。84只大鼠随机分7组（每组12只）：正常组、IA组（立体定向注射PBS+Lipofectamine 2000）、mimic NC组、miR-133a-3p mimic组、si-NC组、si-PSAT1组、miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组。每天注射1次，SPF级饲养12周。术后灌注固定取脑底动脉环，显微镜下观察病理改变。核酸由上海桑工生物合成。

血流动力学检测

术前3天和干预12周后测左颈总动脉末端血流速度。麻醉固定，剃毛，彩超探头涂耦合剂测量记录。

RT-qPCR

TIANGEN试剂盒提总RNA，紫外/变性电泳检质，PrimeScript逆转录，SYBR Premix Ex Taq II扩增。引物由北京康维生物设计合成（表1）。U6作miR-133a-3p内参，GAPDH作其他基因内参，2⁻ΔΔCt法分析。

Western Blot

总蛋白提取，BCA定量，5×样品缓冲液煮沸5分钟，10%分离胶/5%浓缩胶电泳，5%脱脂奶粉封闭1小时，一抗孵育（PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白 1:500，β-连环蛋白/Ki-67 1:5000，Bax/Bcl-2/CyclinD1 1:1000/1:1000/1:200，MMP-9 1 μg/mL，VEGF 1:1000，均Abcam），HRP标记二抗1:2000孵育1小时，ECL显影，X光胶片曝光显影。GAPDH 1:10000作内参，ImageJ分析灰度。

双荧光素酶报告基因分析

生物信息学网站（https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/）预测miR-133a-3p与PSAT1 3′UTR结合位点。扩增含结合位点的PSAT1 3′UTR片段克入pGL3-basic构建WT质粒（PSAT1-WT），点突变破坏结合位点构建MUT质粒（PSAT1-MUT）。对数生长期EC接种96孔板，70%融合时共转染WT/MUT质粒与mimic NC/miR-133a-3p mimic，48小时后收集裂解，Promega试剂盒测荧光素酶活性。

统计分析

SPSS 21.0。计数资料率/百分数，卡方/Fisher精确检验。计量资料正态分布用均数±标准差，两组独立样本t检验，多组单因素ANOVA+Tukey事后检验。P<0.05差异有统计学意义。

结果

IA患者一般资料

表2列出IA组与对照组一般资料对比。

miR-133a-3p表达与动脉瘤数量大小相关

以平均相对表达量为界分高表达组（n=47）和低表达组（n=28），卡方/Fisher检验显示miR-133a-3p表达与年龄、性别、动脉瘤形状部位无关（P>0.05），但与数量和大小相关（P<0.05）。

IA组织中miR-133a-3p下调，PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白上调

RT-qPCR显示IA组miR-133a-3p显著低于对照组（P<0.05，图1a）。RT-qPCR和Western blot均证实PSAT1、GSK3β、β-连环蛋白在IA组显著升高（P<0.05，图1a-c）。

动脉瘤病理改变及MMP-9/VEGF表达

肉眼观察：对照组动脉鲜红，腔内无斑块血栓；IA组瘤体多呈褐/暗红色，囊状/紡錘狀，质韧。切开见白/暗红色粥样硬化斑（扁平/圆/椭圆），部分瘤腔有软质壁血栓。瘤壁自颈向顶渐薄，顶部仅薄纤维膜甚至破裂，破裂口多位于瘤顶或附近。

HE染色：对照组血管壁厚度均匀，内中外膜结构清晰完整，细胞形态正常，邻近细胞肌膜紧密贴合，壁层炎性细胞稀少。IA组：分叉处远侧血管腔局部膨隆，瘤顶内膜变钝变小，局部EC脱失；少数样本平滑肌细胞向内膜迁移增生；EC减少甚至消失，内膜由增生肌源性内膜细胞和排列整齐的EC构成，或凋亡EC与贴附腔内血细胞构成，空泡变性、连续性中断，部分连同基膜剥离，内膜胶原纤维增多；动脉粥样硬化改变，血管壁明显变薄，大量结缔组织填充；全层可见炎性细胞浸润弥漫，以中膜外膜为主；部分细胞有脂质/胆固醇结晶沉积；部分瘤壁完全或局部变薄向外膨出（图2a,b）。

电镜：对照组脑血管壁基质纤维清晰，无内皮损伤/细胞核固缩/变性；IA组可见明显EC损伤、核固缩/空泡变性，中膜平滑肌细胞减少、核固缩明显、染色质聚集和凋亡小体，线粒体肿胀内部结构消失，细胞骨架基质模糊呈无定形絮状，缺失部位有大量碎片（图2c,d）。

免疫组化：对照组75例MMP-9和VEGF均阴性。IA组75例中MMP-9阳性60例（内外膜不均匀，棕黄色胞浆），VEGF阳性66例（中外膜高表达、内膜低表达，棕黄色胞浆）（图2e,f，表4）。

血管EC鉴定

免疫细胞化学检测FVIII和CD31，EC阳性率95%，胞浆大量棕色颗粒，五代细胞棕染显著高于一代（图3a,b）。

上调miR-133a-3p和下调PSAT1抑制IA EC凋亡、促进增殖迁移

流式、RT-qPCR、Western blot检测转染后EC凋亡及Bax/Bcl-2表达。对照组 vs IA组：IA组凋亡率升高、Bax上调、Bcl-2下调（P<0.05）。IA组、mimic NC组、si-NC组三者间无显著差异（P>0.05）。vs mimic NC组/si-NC组：miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组凋亡率降低、Bax下调、Bcl-2上调（P<0.05）。vs miR-133a-3p mimic组：miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组凋亡率和Bax升高、Bcl-2降低（P<0.05，图4a-e）。

MTT、RT-qPCR、Western blot检测增殖及Ki-67/CyclinD1表达。对照组 vs IA组：IA组增殖活性及Ki-67/CyclinD1表达降低（P<0.05）。IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异（P>0.05）。vs mimic NC组/si-NC组：miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组增殖活性及Ki-67/CyclinD1表达升高（P<0.05）。vs miR-133a-3p mimic组：miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组增殖活性及Ki-67/CyclinD1表达降低（P<0.05，图4f-i）。

划痕实验检测迁移。IA组 vs 对照组：IA组迁移受抑（P<0.05）。IA组、si-NC组、mimic NC组无显著差异（P>0.05）。vs si-NC组/mimic NC组：si-PSAT1组和miR-133a-3p mimic组迁移增强（P<0.05）。vs miR-133a-3p mimic组：miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组迁移减弱（P<0.05，图4j,k）。

恢复miR-133a-3p和耗竭PSAT1降低EC中PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白表达

RT-qPCR检测EC中miR-133a-3p表达：IA组低于对照组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异；miR-133a-3p mimic组高于mimic NC组（P<0.05）；si-PSAT1组 vs si-NC组无显著变化；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组 vs miR-133a-3p mimic组无显著差异（图5a）。

Western blot和RT-qPCR检测PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白：IA组显著高于对照组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异；miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组显著低于mimic NC组和si-NC组（P<0.05）；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组显著高于miR-133a-3p mimic组（P<0.05，图5a-c）。

上调miR-133a-3p和下调PSAT1减轻IA组织病理改变

血流动力学：术前3天各组血流速度无差异（P>0.05）。干预12周后：IA组血流速度低于正常组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组、miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组降幅无显著差异；miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组血流速度高于mimic NC组和si-NC组（P<0.05）；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组低于miR-133a-3p mimic组（P<0.05，图6a）。

HE染色观察病理：正常组中膜弹性纤维整齐、波浪结构完整无断裂降解。vs 正常组：IA组管腔扩大，弹性蛋白波浪结构消失，中膜局部弹性纤维断裂甚至完全降解。si-NC组、mimic NC组、IA组、miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组形态无显著差异。vs si-NC组/mimic NC组：miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组弹性蛋白波浪结构保存，局部结构轻度紊乱但无断裂溶解（图6b）。

高表达miR-133a-3p和低表达PSAT1降低体内IA组织中PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白/VEGF/MMP-9表达

RT-qPCR检测体内miR-133a-3p：IA组低于正常组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异；miR-133a-3p mimic组高于mimic NC组（P<0.05）；si-PSAT1组 vs si-NC组无显著变化；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组 vs miR-133a-3p mimic组无显著差异（图7a）。

Western blot和RT-qPCR检测PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白：IA组显著高于正常组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异；miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组显著低于mimic NC组和si-NC组（P<0.05）；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组显著高于miR-133a-3p mimic组（P<0.05，图7a-c）。

Western blot检测VEGF/MMP-9：IA组显著高于正常组（P<0.05）；IA组、mimic NC组、si-NC组无显著差异；miR-133a-3p mimic组和si-PSAT1组显著低于mimic NC组和si-NC组（P<0.05）；miR-133a-3p mimic+oe-PSAT1组显著高于miR-133a-3p mimic组（P<0.05，图7d,e）。

PSAT1是miR-133a-3p的靶基因

在线软件预测PSAT1 3′UTR含miR-133a-3p结合位点。构建WT（PSAT1-WT）和MUT（PSAT1-MUT）报告质粒，EC共转染miR-133a-3p mimic。结果：MUT组荧光素酶活性无显著变化（P>0.05）；WT组活性显著下降（P<0.05，图7f,g），证实PSAT1为miR-133a-3p直接靶标。

讨论

IA是颅内动脉异常扩张，持续向外推挤血管壁导致壁体变弱、破裂风险增加。Liu等发现某些miRNA参与调控血管平滑肌细胞增殖，与IA密切相关。近期研究证实循环miRNA可作为高危人群IA发生可能性的新生物标志物。PSAT1传统上被认为与精神分裂症谱系疾病和丝氨酸代谢改变相关。本研究旨在探明miR-133a-3p通过调节PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白通路调控内皮损伤诱导IA的机制。

本研究分析miR-133a-3p表达与IA临床病理特征关系，发现其与动脉瘤数量大小相关，与年龄性别形状部位无关。有学者认为区域血流剪切应力诱导成纤维细胞和血管EC表达MCP-1和MIP-1α，招募巨噬细胞聚集介导炎症反应，激活c-Jun进而调节AP-1激活MMP-9启动子，升高MMP-9 mRNA，导致血管壁细胞外基质溶解形成IA。Saito等证实MMP-9阳性细胞主要源自中外膜巨噬细胞，MMP-9介导动脉壁变性致动脉瘤形成。上述研究提示MMP-9与IA形成相关。本研究发现IA中MMP-9上调，推测miR-133a-3p可能通过调节PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白通路进而调节MMP-9参与IA发生发展，未来将进一步验证。

本研究提供实质证据：IA中miR-133a-3p下调，PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白上调。新兴证据显示miR-133a-3p在多种肿瘤中起抑制作用：乳腺癌组织中显著下调；晚期前列腺癌尤其是骨转移组织中下调。PSAT1促癌作用见于多研究：非小细胞肺癌中显著升高预示预后差；结直肠癌中为最高上调基因且耐药患者高表达；PSAT1通过GSK3β/β-连环蛋白通路介导乳腺癌细胞周期进程；食管鳞癌中高表达预示生存差。GSK3β活性在癌组织中升高，其磷酸化水平及核内β-连环蛋白表达亦增高，提示该通路参与骨桥蛋白调节。

本研究进一步显示：上调miR-133a-3p和下调PSAT1抑制IA EC凋亡、促进增殖迁移，降低VEGF和MMP-9表达。既往研究表明：miR-133a-3p过表达靶向COL1A1抑制口腔鳞癌侵袭生长有丝分裂；高表达miR-133a-3p靶向COL1A1抑制食管鳞癌增殖、促凋亡、降低迁移侵袭；瞬时上调miR-133a-3p靶向RBPJκ抑制胆囊癌细胞迁移侵袭生长。本研究提示miR-133a-3p在IA中通过靶向PSAT1发挥作用。PSAT1过表达促进食管鳞癌生长和Matrigel侵袭，高表达PSAT1的细胞注射小鼠成瘤；PSAT1高表达预后差、增强体内外致瘤增殖；PSAT1通过得失功能实验证实促进细胞周期进程、增殖和致瘤。MMPs是依赖Zn²⁺活化水分子切割底物的酶家族，MMP-9对多种生物过程影响巨大；动脉瘤组中MMP-9升高。VEGF-A是滋养层血管内分化关键调节因子；沉默PSAT1抑制VEGF、β-连环蛋白和GSK3β磷酸化表达。

结论

总之，本研究证实：miR-133a-3p过表达或PSAT1下调通过抑制GSK3β/β-连环蛋白通路限制内皮损伤、促进内皮增殖，为IA靶向治疗提供新思路。研究强调了miR-133a-3p在PSAT1/GSK3β/β-连环蛋白通路相关IA中的作用。但受限于该领域现有研究较少，关于miR-133a-3p和PSAT1效应的明确结论仍需未来严格监测和临床试验进一步验证。