超薄钯纳米酶：光激活过氧化物酶拟态用于精准催化

摘要

光激活纳米酶为化工和生物技术提供新机遇。但现有远程可控催化体系尚不理想。本文展示超薄Pd纳米片（Pd NSs）作为光可控过氧化物酶拟态的有趣案例。因大部分Pd原子暴露于表面，厚度1.1 nm Pd NSs具有高过氧化物酶样活性。更关键的是，光激发下该内在活性可进一步激活2.4-3.2倍。此现象归因于超薄Pd NSs独特光学性质：能高效捕获光子通过表面等离子体共振（SPR）效应产生热电子，促进H₂O₂原位分解为活性氧自由基（O*）。该增强催化也可用于实时高灵敏比色检测H₂O₂。期望本工作为生物医学诊断、药物递送、环境化学中可控高效人工纳米酶合理设计提供有价值见解。

引言

天然酶是精妙生物催化剂，能催化生命几乎所有化学转化。但存在固有缺陷：稳定性差、成本高。自磁性纳米颗粒固有过氧化物酶拟态活性首次报道以来，设计开发具有酶样活性纳米材料（纳米酶）引发持续研究热潮。目前一系列氧化物、金属、碳基纳米材料被用于模拟辣根过氧化物酶（HRP）。其中贵金属纳米材料如银(Ag)、金(Au)、铂(Pt)、钯(Pd)等被报道具有高过氧化物酶拟态活性。另一方面，引入光激活纳米酶活性也有报道，为生物技术和化工提供丰富机遇。但现有远程可控催化体系仍远未令人满意。

等离子体金属纳米材料因SPR独特光学性质能捕获或响应阳光。这些材料通过SPR效应捕获光子产生热电子，成为提高催化速率、促进生物分子新型光学传感、光热治疗工程、利用太阳能作为可再生能源的关键材料。然而，无研究聚焦等离子体金属基纳米酶SPR效应对其酶拟态活性影响。因此，将等离子体金属基纳米酶与SPR效应结合实现高活性光调控酶催化极具吸引力。

本文首次报道厚度约1.1 nm超薄Pd纳米片（Pd NSs）可作为优秀光可控过氧化物酶拟态。Pd基纳米酶和光控纳米酶系统已报道展现氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等多种酶拟态活性。但其结构通常为颗粒、块体、棒状。超薄Pd NSs具有高表面能、小侧向尺寸、高电子迁移率，导致高密度活性表面位点。此外，超薄纳米片大部分原子暴露可作为工程化性能理想平台。受超薄纳米片独特结构启发，提出策略不仅充分利用Pd原子活性位点，还将热电子注入酶催化过程。方案1所示：光子与超薄Pd NSs相互作用激发表面等离子体共振，非辐射衰变产生热电子和空穴，从而促进H₂O₂原位还原分解生成氧自由基（O*）在可见光下氧化TMB。引入可见光进入酶促反应，Pd NSs表现出比暗条件显著更高催化活性。

材料与实验

材料与表征

柠檬酸(CA)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自Sigma Aldrich。乙酰丙酮钯(Pd(acac)₂)、W(CO)₆、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)购自Macklin。过氧化氢(H₂O₂, 30 wt%)购自北京化学品(北京,中国)。所有化学品未经进一步纯化直接使用。全程用Millipore系统纯化水(18.2 MΩ; Millipore Co., USA)。

产物相结构用PANalytical X射线衍射仪(Cu Kα辐射, λ=1.5406 Å)表征。样品室温UV-vis漫反射光谱(DRS)用Lambda 750, PerkinElmer测定。溶液中催化剂浓度用ICP-AES(720, Agilent)测定。透射电镜(TEM)图像在JEM1400 plus透射电镜100 kV记录。高分辨TEM(HRTEM)在JEM-2100F场发射透射电镜(FE-TEM)200 kV进行。

Pd纳米片合成

按文献法[27]合成Pd NSs。简述：乙酰丙酮钯(16 mg)、PVP(MW=24,000, 30 mg)、CA(150 mg)、CTAB(60 mg)混于DMF(10 mL)中氮气氛下搅拌1 h。当烧瓶(25 mL)中溶液颜色变为均匀橙红色溶液时,氮气氛下加入100 mg W(CO)₆。随后80 °C加热1 h。反应后,暗蓝色产物经离心(9000 rpm/min, 3 min)配合足量丙酮分离,再分散乙醇中。重复三次。最终Pd纳米片分散于10 mL乙醇中供后续实验。

光催化过氧化物酶拟态测量

Pd NSs纳米酶过氧化物酶拟态活性通过测定TMB氧化评价。300 W氙灯(CEL-HXF300/CEL-HXUV300, 中国教育奥莱特有限公司, 北京)作光源,加玻璃滤光片使可见光(λ≥400 nm)通过。典型实验:12.6 μg mL⁻¹ Pd NSs纳米酶(ICP-AES测定)加入1 mL磷酸缓冲液(0.1 M, pH 4)含50 mM H₂O₂和0.7 mM TMB,室温下。不同照射时间下,离心后监测652 nm特征吸收峰确定TMB氧化产物浓度,评价过氧化物酶拟态活性。对照实验条件相同除无光照。

结果与讨论

Pd NSs纳米酶设计与表征

通过经典方法制备典型钯纳米片(图1a),构建一系列高活性原子位点超薄纳米酶,固有底物和光子捕获及高效过氧化物酶拟态特性。图1b-d展示合成Pd NSs典型低倍透射电镜(TEM)图像,由均匀纳米片组成,侧向尺寸约10.0 nm(图1b插图),平均厚度约1.1 nm(图1c插图)。按尺寸计算,顶底平坦表面面积百分比超90%。高分辨透射电镜(HRTEM)进一步确认Pd NSs形貌和相。图1g显示~0.22和0.256 nm适当间距对应钯(111)和(200)晶面[27]。为实验需要,将Pd NSs负载商业碳表征XRD图谱。图1e显示40.11°、46.65°、68.12°衍射峰分别对应立方Pd NSs(111)、(200)、(220)晶面,与HRTEM观察一致。此外无除商业碳相关峰外其他晶相峰。Pd 3d谱显示两峰(图1f) Pd 3d₅/₂和Pd 3d₃/₂(自旋-轨道劈裂),分别位于335.5和339.2 eV[25],揭示钯原子两种化学环境。

光催化过氧化物酶拟态活性

以TMB为典型过氧化物酶底物考察Pd NSs过氧化物酶样活性。因超薄纳米片表面暴露大部分Pd原子,推测超薄Pd NSs拥有高密度活性表面位点,从而具有优异催化活性。如预期,共存H₂O₂下Pd NSs高效催化无色底物TMB氧化为蓝色产物oxTMB,652 nm特征吸收(图2a,b)。无H₂O₂加入时同条件下Pd NSs活性可忽略,表明过氧化物酶样活性在反应中起重要作用。类似天然酶和其他纳米酶,Pd纳米酶具有pH、温度、浓度依赖过氧化物酶活性(图2c和图S1)。实验条件下,Pd NSs在弱酸溶液显示最优催化活性,温度从25至75 °C变化时35 °C反应溶液特征吸收峰最高(图2c)。惊人地,有无光照下过氧化物酶拟态活性显著差异(图2d和图S2)。按反应溶液60 min吸收值,可见光下Pd NSs活性比暗条件约高2.4-3.2倍(图2d和图S2)。类似地,引入光到催化过程其他等离子体金属纳米颗粒也增加其过氧化物酶样活性(图S3-S5).比较这些纳米酶,发现Pd NSs展示最大活性调控范围。此现象主要因超薄纳米片独特结构。推断可见光对所有等离子体金属纳米材料过氧化物酶样活性有直接影响(图2e),SPR效应在催化过程中起关键作用。

Pd纳米酶动力学与机理研究

为表征Pd NSs酶促行为,用酶动力学理论确定反应动力学。适宜TMB浓度范围内,Pd NSs呈现典型米氏-门滕曲线(图3a)。米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)用Lineweaver-Burk方程获得(表S1)。与辣根过氧化物酶(HRP)比较,Pd NSs对TMB表观Km值减弱0.28(图3a,b和表S1)。此结果表明制备超薄片结构Pd NSs对TMB亲和力高,甚至高于天然酶HRP。

明确H₂O₂可在Pd NSs催化下分解生成活性氧物种提供氧化功能,关键是理解生成何种物种。原则上贵金属可催化H₂O₂分解生成•OH和低pH下反应中间体O*[28],二者均可能为酶拟态反应提供氧化功能物种。为理解Pd NSs可能催化机制,首先用对苯二甲酸(TA)/H₂O₂体系测试Pd NSs过氧化物酶拟态特性是否与•OH自由基形成相关(图4a)。以TA为荧光探针,•OH与2-羟基对苯二甲酸反应生成高荧光产物[29]。图4b显示加入Pd NSs后溶液荧光强度显著下降。结果与Pd NSs浓度增加荧光强度下降一致(图S6)。表明Pd NSs消耗•OH自由基而非生成。因此类似报道铁蛋白-铂纳米颗粒催化行为[30],Pd NSs催化性能独立于•OH自由基形成。

为探究Pd NSs催化机制是否与光产生热电子相关,也探索光催化反应中活性物种热电子捕获实验(图4c)[31]。图4d显示加入0.3 mg/mL KBrO₃(电子淬灭剂)后15 min内Pd NSs对TMB氧化催化能力显著下降。KBrO₃/反应体系与纯体系巨大差异揭示热电子存在可能对TMB氧化至关重要。这与Pd NSs通过SPR效应在500-1000 nm光谱范围有宽吸收峰一致(图S7)[25]。此外,热电子离开Pd NSs表面后留下相应空穴。因这些空穴能氧化乙醛生成乙醛,可能也对TMB有强氧化能力。如预期,无H₂O₂加入时可见光照射下生成更多oxTMB。

进一步测试可见光下活化O₂生成活性氧物种包括超氧阴离子(O₂⁻)。受控实验在不同气氛下进行。图S8显示分别引入氮气和氧气饱和反应体系时拟酶催化性能无显著变化,光催化活性不受O₂显著影响。需指出Pd NSs极高活性,可见光下5 min甚至达0.051 a.u./min,比暗条件高3.2倍(图2d)。极高活性导致假设:Pd NSs SPR效应产生热电子促进形成反应中间体O*而非自由基解释过氧化物酶样活性(图5a)[28]。简言之,活性物种捕获实验和通气实验为Pd NSs光催化拟酶机制提供有力支持。

新型实时高灵敏传感器

多项研究表明引入光作为外部能量输入可提升传感器性能[22,32,33]。如Ling等人[32]发现10 at.% LaOCl-SnO₂传感器O₂传感性能经紫外光照显著改善。考虑光对传感器显著影响及本实验可见光下Pd NSs优异过氧化物酶拟态活性,构建高效灵敏比色H₂O₂传感器。传感器机制(图5a)显示Pd NSs利用大比表面积捕获光子产生大量热电子,热电子促进H₂O₂分解生成中间体O*,氧化TMB为蓝色oxTMB,实现H₂O₂高效检测。

图5b插图显示构建H₂O₂传感器线性范围10-100 μM,检测限13.40 μM(LOD=3s/k, s和k为八次平行对照测量相对标准偏差和斜率线性校准块。本工作s=2.97988×10⁻⁴, k=6.67×10⁻⁵)。因此引入光条件下Pd NSs基H₂O₂传感器优于其他报道纳米材料。表S2显示同比色法检测H₂O₂,本传感器线性范围宽[34]。检测限低于许多Fe基或Co基过氧化物酶拟态传感器(表S3)[35,36]。最后进行H₂O₂及系列对照实验(图5c),潜在干扰物如K⁺、葡萄糖、Na⁺、CO₃²⁻、Ca²⁺。图5c插图显示这些干扰物652 nm处吸收弱,颜色不变。基于结果,基于可见光高效高特异性H₂O₂传感器成功实现。此传感器不仅充分利用可见光提升检测性能,也为其他等离子体金属传感器提供良好范例。

结论

总之,展示超薄Pd纳米片(Pd NSs)作为高效光可控过氧化物酶拟态激动案例,得益于纳米片表面高密度活性位点和SPR独特光学性质。可见光照射下,Pd纳米片SPR效应产生热电子随后分解H₂O₂生成中间体O*。可见光下此类纳米酶表现出比暗条件高得多过氧化物酶样活性。该光激活系统进一步用于增强H₂O₂生物传感。此处提出基于光激活Pd纳米酶SPR效应产生热电子基本概念,有助于设计智能或更高效人工酶系统,为化工和生物技术提供许多新机遇。