Fe(II)-单宁酸包覆MOF靶向递送青蒿素增强三阴性乳腺癌铁死亡

摘要

通过诱导铁死亡抑制肿瘤发展，可能为对细胞内氧化失衡敏感的三阴性乳腺癌（TNBC）提供潜在疗法。近年，青蒿素（ART）及其衍生物作为潜在抗癌药物被研究，通过铁介导的内过氧化物桥断裂诱导铁死亡治疗高侵袭性癌症。但因其水溶性差、细胞内铁含量有限，抗肿瘤应用面临挑战。本研究基于单宁酸（TA）和亚铁离子（Fe(II)）包覆沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）并封装ART（TA-Fe/ART@ZIF），通过配位驱动自组装开发了供铁纳米载体。药物释放实验显示：pH 7.4下ART几乎不释放，pH 5.0下10 h释放59%，展现优异pH响应释放。同时，细胞内ROS和MDA水平显著升高，GSH和GPX4下降，表明新纳米药物系统显著增强铁死亡。与单药相比，体外和体内肿瘤抑制实验证实TA-Fe/ART@ZIF具有更高肿瘤抑制效率。本工作为增强铁死亡纳米药物效力、TNBC治疗新方向提供新思路。

引言

铁死亡是新发现的细胞死亡亚型，导致铁依赖性脂质过氧化物（LPO）积累，破坏细胞结构完整性[1-3]。新兴证据表明，多种小分子激活铁死亡在多种实验癌症模型中有效抑制肿瘤，引发对铁死亡作为新型抗癌疗法潜力的高度期待[4-6]。三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型，缺乏靶向疗法，常伴随复发、远处转移和耐药[7]。先前研究指出，xCT胱氨酸/谷氨酸反向转运体在众多TNBC细胞高表达，对维持谷胱甘肽（GSH）水平和氧化还原平衡起重要作用[8]。降低细胞内GSH含量可使TNBC细胞对铁死亡敏感，从而杀灭肿瘤细胞[8]。值得注意的是，铁死亡还可绕过TNBC对常规程序性凋亡的耐药[9]。因此，基于诱导铁死亡的策略或药物对难治性TNBC临床治疗具有潜力。

青蒿素（ART）是一种含过氧基的倍半萜内酯，从传统中药黄花蒿中分离，在多种癌细胞系显示良好抗肿瘤活性[10,11]。越来越多证据显示癌细胞细胞内铁池显著高于正常细胞，铁介导的内过氧化物桥断裂使ART在多种癌细胞系中选择性致死[12,13]。铁离子依赖的抗肿瘤活性引发对ART调控铁死亡的关注[13]。机制上，ART以自噬非依赖方式诱导铁蛋白溶酶体降解，增加细胞亚铁离子水平，使细胞对铁死亡敏感[11]。

然而ART是否在TNBC中诱导铁死亡尚不清楚。此外，水溶性差、细胞内亚铁离子可用性不足等因素限制ART抗肿瘤应用[13]。ART纳米复合物有望作为ART类抗肿瘤药物的前瞻性纳米递送系统[14-16]。近年，金属有机框架（MOFs）作为一类多孔聚合材料，因大孔径、高比表面积、小分子选择性摄取等特性受关注[17-19]。作为MOF代表材料，沸石咪唑骨架（ZIF-8）因pH响应性、高药物负载、良好生物相容性，广泛用于纳米药物开发[20-23]。此外，MOF可调表面允许控制表面性质并赋予多功能性[24,25]。金属-酚配位包覆层在MOF表面的超分子组装近年因刺激响应性解离、胶体稳定性、生物相容性等优良性质受关注[26,27]。MOF上的金属-酚配位材料可作为疏水ART递送的理想载体。

受此启发，我们开发了调控TNBC细胞铁死亡的亚铁离子-单宁酸配位包覆ZIF-8纳米系统封装ART（TA-Fe/ART@ZIF），示意图见图1。选择ZIF-8作为纳米载体封装ART，因其良好生物相容性和pH响应释放。亚铁离子-TA配位包覆层固定在ART@ZIF表面，旨在提供分散稳定性和供给亚铁离子（Fe(II)）。纳米系统被细胞内化后，载体酸性降解促进ART释放和Fe(II)积累。细胞内Fe(II)水平上升通过铁介导的内过氧化物桥断裂分解ART产生自由基，显著增强铁死亡效应。总之，TA-Fe/ART@ZIF介导铁死亡的发现可为开发针对TNBC的新型治疗提供新视角。

材料与方法

试剂

青蒿素（99%）、2-甲基咪唑（98%）、硝酸锌（Zn(NO₃)₂；98%）、单宁酸（TA；98%）、硫酸亚铁（FeSO₄；98%）、无水甲醇由阿拉丁试剂公司（上海）提供。

TA-Fe/ART@ZIF纳米颗粒制备

ART@ZIF纳米颗粒制备：200 mg ART溶于1 mL无水甲醇，缓慢加入2 g 2-甲基咪唑（溶剂8 mL无水甲醇）。磁力搅拌下缓慢加入0.2 g硝酸锌（溶剂1 mL无水甲醇）。最终调整体积至15 mL搅拌10 min得淡白色溶液。10,000 rpm离心，甲醇洗涤3次。上清液测定ART含量，沉淀冻干得固体备用。

TA-Fe/ART@ZIF制备：TA溶液（40 mg/mL去离子水，2 mL）缓慢加入ART@ZIF溶液（10 mg/mL，4 mL）。搅拌20 min后缓慢加入5 mg/mL FeSO₄。再搅拌30 min得深紫色溶液。10,000 rpm离心收集沉淀，去离子水洗涤3次，冻干得TA-Fe/ART@ZIF备用。

表征

透射电镜（TEM，JEM-1230；JEOL，日本东京）测定纳米颗粒各部分形貌和元素组成。动态光散射和Zeta电位（DLS；Zetasizer Nano系统，马尔文仪器，英国马尔文）评价颗粒尺寸和电稳定性。傅里叶变换红外光谱（FTIR，VERTEX 70；布鲁克，德国不来梅）和热重分析分析纳米颗粒成分组成。X射线光电子能谱（XPS）用PHI 5000 Versa Probe III（Physical Electronics）测量。TA-Fe/ART@ZIF元素组成用EDX（蔡司Neon-40）分析。

包封效率和载药量测定

高效液相色谱（HPLC，Agilent 1200；Agilent Technologies，美国圣克拉拉）测定上清液ART含量。药物负载率和包封率计算公式：

药物负载率(%) = 实际包封药物量 / 纳米颗粒量 × 100%

包封效率(%) = 实际包封药物量 / 初始用药量 × 100%

TA-Fe/ART@ZIF纳米颗粒体外释放与pH响应

包裹2 mg纳米颗粒的透析袋分别置于pH 7.4和5.0的50 mL磷酸缓冲液（PBS）中，37℃持续振荡。透析袋外溶液在实验启动后15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h取样。用HPLC测定缓冲液中ART含量。

细胞培养

MDA-MB-231和L929细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国马纳萨斯）。37℃、5% CO₂、RPMI-1640培养基（Solarbio，北京），补充10%胎牛血清（Cyclone，美国犹他）、100 µg/mL丙酮酸钠、青霉素、链霉素（Solarbio，北京）。

体外细胞毒性测试

采用MTT法[28,29]测定细胞活力。MDA-MB-231和L929细胞接种于96孔板（5,000 cells/well），37℃、5% CO₂培养24 h。弃液，每孔加入100 µL含PBS和不同浓度ART、TA-Fe/ZIF、TA-Fe/ART@ZIF、去铁胺（DFO，MedChemExpress，上海）、Z-VAD-FMK（MedChemExpress，上海）、铁死亡抑制剂Fer-1（MedChemExpress，上海）的无血清培养基。48 h后加入10 µL MTT（5 mg/mL）再孵育4 h。用自动酶标仪（BioTek，美国）测定各孔吸光度。结果以细胞活力百分比表示。

Calcein-AM染色实验

MDA-MB-231细胞接种24孔板（2×10⁴ cells/well）培养24 h。随后用不同浓度TA-Fe/ART@ZIF处理24 h。弃培养基，暗处4℃用Calcein-AM（Beyotime，上海）染色20 min，荧光倒置显微镜（奥林巴斯，东京）观察。

流式细胞术检测凋亡

MDA-MB-231细胞六孔板接种（2.5×10⁵ cells/well）。经PBS、ART、TA-Fe/ZIF、TA-Fe/ART@ZIF处理24 h后，离心收集细胞。碘化丙啶和Annexin-V双染色（Annexin V-FITC Kit；Beckman Coulter，法国马赛），流式细胞术检测。

体外活性氧（ROS）测定

用ROS荧光探针（二氯二氢荧素二乙酸酯DCFH-DA，Beyotime，上海）测定细胞ROS含量。MDA-MB-231六孔板接种（2.5×10⁵ cells/well），37℃、5% CO₂培养24 h。弃液，按空白对照组（无血清培养基）、阳性对照组、实验组（不同浓度纳米颗粒）处理。37℃孵育8 h后各孔加入0.1% DCFH-DA再孵育30 min。PBS洗去未响应DCFH-DA的细胞，荧光倒置显微镜（奥林巴斯，东京）观察。

丙二醛（MDA）和GSH含量测定

用MDA试剂盒（TBA法；建成生物工程，南京）和GSH试剂盒（Beyotime，上海）测定细胞内MDA和GSH水平。经PBS、ART、TA-Fe/ZIF、TA-Fe/ART@ZIF处理后收集计数MDA-MB-231细胞，按说明书测定细胞内MDA和GSH含量。

Western Blot分析

经不同纳米颗粒处理的MDA-MB-231细胞用RIPA裂解液裂解。测定蛋白浓度后，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜。0.5% BSA封闭1 h，一抗4℃孵育24 h。TBST洗涤一抗，对应二抗室温孵育2 h。洗去二抗，化学发光液显色，凝胶成像系统观察。

体内抗肿瘤实验

所有动物实验经潍坊医学大学伦理委员会批准。健康雌性裸鼠（4周龄；13-17 g；Vital River，北京）皮下接种5×10⁶ MDA-MB-231细胞（150 µL PBS）。肿瘤体积达70-120 mm³时随机分四组。分别腹腔注射PBS、ART（20 mg/kg）、TA-Fe/ZIF（80 mg/kg）、TA-Fe/ART@ZIF（100 mg/kg），每3天1次。14天后处死小鼠，收集肿瘤组织和重要器官进行HE染色。

统计分析

所有实验至少重复3次。SPSS 22.0软件（IBM Corp.，美国阿蒙克）统计分析。数据以mean ± STD表示。p < 0.05为统计学显著。

结果与讨论

TA-Fe/ART@ZIF纳米颗粒表征

首先，按文献[30]室温下从甲醇、乙酸锌、2-甲基咪唑、ART合成ART@ZIF纳米颗粒。随后涡旋混合TA和亚铁离子，在ART@ZIF模板表面快速形成稳定金属-多酚超分子膜。相比报道的磁性纳米颗粒[31-33]，TA-Fe/ART@ZIF通过自组装法在MOF表面形成TA-Fe膜，无需苛刻化学或水热反应。更关键的是，TA-Fe/ART@ZIF纳米载体可被低pH触发释放ART和Fe(II)，进一步经ART内过氧化物催化生成碳中心自由基，显著增强铁死亡。首次离心上清液经HPLC测定包封效率为66.7%。TA-Fe/ART@ZIF上清液经HPLC计算ART药物负载量为11.4%。FTIR谱（图2a）显示ART特征吸收峰：1,738 cm⁻¹羰基、724 cm⁻¹过氧桥[34]，证实ART成功包封。热重分析（图2b）显示ART约400℃完全分解。与TA-Fe/ZIF对比，ART占TA-Fe/ART@ZIF总重量7.1%，与HPLC结果基本一致。

TEM结果显示ZIF-8和ART@ZIF呈相似均匀六方构型，粒径约100 nm（图3a,b）。TA-Fe/ART@ZIF呈球形，粒径150 nm。与完整ART@ZIF相比，Fe(II)和TA包覆的TA-Fe/ART@ZIF显示明显核壳结构，TA-Fe膜厚约30 nm（图3a）。区域元素映射分析确认TA-Fe/ART@ZIF外围被Fe元素包裹，表明Fe(II)和TA成功包覆（图3b）。XPS测定表面元素组成和相互作用，全谱扫描（附件1：图1s）主要峰位于285、408、531、737、1036 eV，分别对应C 1s、N 1s、O 1s、Fe 2p、Zn 2p，证实TA-Fe/ART@ZIF纳米复合物形成。EDS映射图（附件1：图2s）显示碳、氮、氧、铁、锌峰与XPS谱吻合。增加Fe(II)量可增大TA-Fe/ART@ZIF水动力直径（附件1：图3s）。为进一步确认包覆，测定各纳米颗粒Zeta电位。TA-Fe(II)层形成使ART@ZIF表面Zeta电位从+21 mV转变为-19.5 mV（附件1：图4s），因TA酸性。文献[30]报道TA结构丰富多酚基团不仅赋予底物包覆能力，还能与过渡金属离子（Fe、Zn）配位形成金属-酚复合物。Zn²⁺和Hmim混合形成溶液时，大量Zn²⁺配位于ART@ZIF表面，故Zeta电位+21 mV。TA酚羟基（pKa 8.5）去质子化带负电，可与带正电Zn²⁺相互作用，促进TA-Fe膜在ART@ZIF表面生长。药物递送偏好稳定载体，稳定性对药用至关重要。纳米颗粒在PBS中分散一周证明稳定性（附件1：图5s），粒径随时间保持理想大小和稳定性。

TA-Fe/ART@ZIF体外释放与细胞毒性

为研究TA-Fe/ART@ZIF是否具pH响应分解行为，考察中性和酸性条件下纳米颗粒ART释放。图4a显示酸性条件下纳米颗粒1 h内快速释放约58% ART。中性条件下仅缓慢释放微量ART。此外，透析袋外溶液用氢氧化钠处理时，pH 5.0组反应生成大量白色沉淀，pH 7.4组未观察到此现象。据推测，白色沉淀为酸性条件下纳米颗粒解离产生的锌离子与碱反应生成的氢氧化锌沉淀。这些证据成功表明纳米颗粒具有酸性条件下解离能力。

TA-Fe/ART@ZIF纳米系统设计中，TA-Fe(II)和ZIF结构在肿瘤微环境酸性条件下降解释放封装的ART和Fe(II)。细胞内Fe(II)水平升高通过铁介导的内过氧化物桥断裂分解ART产生自由基，显著增强铁死亡。因此进行MTT实验研究纳米系统对MDA-MB-231和L929细胞细胞毒性。相比ART，TA-Fe/ART@ZIF对MDA-MB-231细胞毒性更强（图4b），对正常细胞毒性低（图4c）。TA-Fe/ART@ZIF抑制MDA-MB-231活性53.9%，同浓度ART仅抑制24.1%。Calcein-AM染色证实随TA-Fe/ART@ZIF浓度增加，存活MDA-MB-231细胞逐渐减少（图4d）。

TA-Fe/ART@ZIF增强MDA-MB-231细胞ROS生成

ART通过铁介导的内过氧化物桥断裂产生ROS发挥抗癌活性[35,36]。因此用2′,7′-二氯二氢荧素二乙酸酯（DCHF-DA）探针[37]检测TA-Fe/ART@ZIF诱导ROS生成效率。图5显示，ART和TA-Fe/ZIF处理组荧光信号略强于未处理组，表明ART和Fe(II)离子可诱导ROS生成。相比之下，TA-Fe/ART@ZIF纳米药物处理组细胞显示强荧光信号，证实了期望的ROS产生，源于Fe(II)介导的ART内过氧化物断裂。纳米系统在细胞内降解使Fe(II)积累，显著增强ROS生成。ART及其衍生物抗癌作用归因于其通过DNA损伤响应、溶酶体介导的巨自噬、氧化应激等多种细胞过程诱导凋亡[13,35,38]。也有报道铁介导的ART内过氧化物桥断裂可影响细胞内氧化平衡诱导多种癌细胞铁死亡[11]。基于氧化失衡的铁死亡诱导可通过添加Fe(II)进一步放大。Fe(II)激活ART的同时，还可与细胞内过氧化氢通过Fenton反应生成羟基自由基，增强ART在肿瘤细胞中的凋亡诱导作用。

TA-Fe/ART@ZIF诱导MDA-MB-231细胞凋亡与铁死亡

为研究细胞死亡机制和Fe(II)作用，利用铁螯合剂去铁胺、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、铁死亡抑制剂铁死亡抑制剂-1挽救细胞。预期中，去铁胺作为Fe(II)清除剂明显阻断细胞死亡，提示Fe(II)关键作用。凋亡和铁死亡抑制剂分别将MDA-MB-231存活率从31.4%显著提升至56.3%和76.0%（图6a），凸显凋亡和铁死亡在TA-Fe/ART@ZIF介导细胞死亡中的重要性。此外，Annexin V-FITC流式细胞术定量测定凋亡程度，TA-Fe/ART@ZIF诱导21.8% MDA-MB-231细胞凋亡（附件1：图6s），高于ART，表明凋亡参与但非主因。

铁死亡共同特征为内源性脂质过氧化[39]。脂质过氧化产物MDA[40]用于评估铁死亡程度。结果显示TA-Fe/ART@ZIF使MDA水平较对照组升高约2.5倍（图6b），推测因纳米载体富集Fe(II)导致脂质自由基水平相应升高。作为细胞主要抗氧化成分之一，细胞内GSH随铁死亡减少[41]。考虑GSH在铁死亡中重要作用，评估TA-Fe/ART@ZIF处理后细胞内GSH水平。GSH显著低于对照组（图6c），有力证明以Fe(II)介导激活ART为中心的GSH耗竭和氧化失衡。Western blot分析TA-Fe/ART@ZIF对GPX4活性影响[42]。观察到TA-Fe/ART@ZIF对GPX4活性抑制显著强于ART（图6d），与GSH耗竭程度最高一致。

体内抗肿瘤实验

通过抑制裸鼠皮下异种移植瘤评估纳米颗粒对MDA-MB-231体内抗肿瘤疗效。14天治疗期间，相对其他组，TA-Fe/ART@ZIF因Fe(II)-ART反应产生大量ROS显著抑制MDA-MB-231异种移植瘤生长（图7a）。各组小鼠体重无显著差异（图7b），表明TA-Fe/ART@ZIF急性全身毒性可忽略。为进一步研究治疗效果，14天处理后肿瘤和正常组织HE染色检查。图8显示TA-Fe/ART@ZIF导致肿瘤组织最大面积细胞死亡，正常组织无明显损伤和凋亡。总体结果表明TA-Fe/ART@ZIF介导疗法不仅具有抗癌疗效，且急性全身毒性低。

结论

总之，铁死亡为TNBC治疗提供潜在疗法，因其独特优势可克服当前主流疗法的必然障碍。我们设计了基于TA-Fe(II)包覆ZIF纳米颗粒封装ART的供铁纳米载体，通过配位驱动自组装增强铁死亡。纳米载体可在弱酸微环境溶解释放ART和Fe(II)，进而导致细胞内ROS和MDA高水平、GSH和GPX4下降，在体外和体内实现强效肿瘤生长抑制和抗癌疗效。本工作为增强铁死亡纳米药物效力和TNBC治疗新方向提供新思路。TA-Fe/ART@ZIF诱导铁死亡的生物相容性和全面机制需进一步研究确证。

数据与材料可用性

所有数据无限制公开可用。

缩略语

MOF:

金属有机框架

TNBC:

三阴性乳腺癌

ART:

青蒿素

TA:

单宁酸

ZIF:

沸石咪唑骨架-8

TA-Fe/ART@ZIF:

单宁酸和亚铁离子包覆沸石咪唑骨架-8封装青蒿素

ROS:

活性氧

LPO:

脂质过氧化物

GSH:

谷胱甘肽

TEM:

透射电镜

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

HPLC:

高效液相色谱

PBS:

磷酸缓冲液

MTT:

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐

DFO:

去铁胺

Fer-1:

铁死亡抑制剂-1

Z-VAD-FMK:

N-苯氧羰基-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(O-甲基)氟甲基酮

Calcein-AM:

Calcein-乙酰氧甲基酯

DCFH-DA:

二氯二氢荧素二乙酸酯

MDA:

丙二醛

BSA:

牛血清白蛋白

TBST:

Tris缓冲盐水Tween

SDS-PAGE:

聚丙烯酰胺凝胶电泳

GPX4:

谷胱甘肽过氧化物酶4