Her2 功能化金纳米壳磁性杂化纳米粒子：一种用于乳腺癌双模态成像和光热治疗的治疗诊断剂

介绍

乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因[1]。有效减少乳腺癌死亡的关键是早期准确诊断[2]。尽管近几十年来取得了进展，但当前的诊断和治疗策略在乳腺癌的早期检测和精确治疗方面仍然存在局限性 [3]。因此，有必要在早期和亚临床阶段探索创新的乳腺癌治疗新策略。

Theranostics 涉及在一个平台内结合诊断和治疗方法，预计将在推进个性化医疗方面发挥重要作用 [4]。通常，治疗诊断试剂将分子成像和治疗功能整合到单个纳米颗粒中，从而有可能在细胞或分子水平上同时监测和治疗乳腺癌 [5]。在临床上，超声（US）和磁共振成像（MRI）是两种常用的乳腺癌诊断和分期方法[6]。 US 成像显示出安全性高、测量实时性和易于获得的优势，并且对比增强超声 (CEUS) 提高了检测乳腺病变的敏感性和特异性 [7]。但是超声成像的应用仍然受限于相对有限的空间和解剖分辨率。 MRI 可以提供具有出色空间分辨率和软组织对比度的图像，同时具有相对较长的成像时间和有限的灵敏度 [8, 9]。因此，结合US和MRI的能力以提供更多关于乳腺癌的互补、协同和准确信息是有意义的[10]。此外，手术和辅助化疗是乳腺癌的主要治疗手段，但也存在并发症严重、多药耐药性增加等弊端。利用近红外 (NIR) 激光和光吸收剂的光热疗法 (PTT) 由于其微创性和良好的可控性，最近作为传统治疗的有效替代方案引起了广泛关注 [11, 12]。因此，将US/MR成像与PTT合二为一，实现双模态成像引导监测乳腺癌光热消融具有重要价值。

最近，纳米材料的制备在癌症治疗诊断学的潜在应用方面取得了重大进展。众所周知，由于其出色的生物相容性和生物降解性，基于聚（乳酸-乙醇酸共聚物）（PLGA）的纳米结构已被广泛研究用于药物输送系统和分子成像 [13, 14]。全氟辛基溴 (PFOB) 是一种液体全氟化碳 (PFC)，由于其高氧溶解性、疏水性和疏脂性，已被封装在聚合物外壳中，例如 PLGA，以开发新型超声造影剂 (UCA) [15, 16]。此外，超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIOs）由于其良好的生物相容性和优异的对比度增强作为MR分子探针获得生物体解剖信息而受到广泛关注[17,18,19]。

另一个有前途的纳米平台是金 (Au) 纳米结构，由于其良好的生物相容性和独特的光学和电学特性，它被广泛用于生物和医学研究 [20]。金纳米壳是一种球形金纳米材料，在 NIR 区域表现出显着的表面等离子体共振 (SPR) 吸收，使其在 PTT 中能够选择性杀死癌细胞而不影响周围的健康细胞 [21]。也有报道称，Au 纳米壳包覆的 PLGA 微胶囊可用于美国分子成像 [22]。许多研究都集中在 Au 纳米壳和聚合物的组合作为癌症治疗诊断的“壳核结构”上。柯等人。开发了一系列基于 Au 纳米壳聚（乳酸）微胶囊的治疗诊断剂，用于多模式成像和 PTT [23, 24]。卢等人。制备负载多柔比星的聚合金纳米壳，用于癌症的荧光成像和光热化疗 [25]。然而，这些纳米颗粒面临的一个普遍问题是其表面缺乏高亲和力的结合配体，导致它们无法以高特异性识别或结合特定的靶细胞，从而最大限度地发挥诊断和治疗效果。此外，据我们所知，很少有研究致力于研究靶向金纳米壳PLGA混合纳米平台用于乳腺癌双模式协同诊断和PTT。

在迄今为止考虑用于乳腺癌的分子靶标中，人表皮生长因子受体 2 (Her2)，一种细胞膜表面结合受体酪氨酸激酶，最常用作乳腺癌定位和识别的重要生物标志物 [26, 27 ]。它在大约 25-30% 的与肿瘤侵袭性、高复发率和不良预后相关的人类原发性乳腺癌中过度表达 [28, 29]。因此，制备靶向Her2的治疗诊断剂是促进乳腺癌早期发现和治疗的一个蓬勃发展的领域。

在我们的研究中，基本思想是开发结合双模态US / MR成像和PTT的Her2功能化金纳米壳磁性混合NPs（Her2-GPH NPs），致力于乳腺癌的早期诊断和精准治疗。该试剂是通过将 PFOB 和 SPIO 封装到 PLGA NPs 中，然后在表面涂覆金纳米壳，然后与抗 Her2 抗体结合来构建的（图 1）。预计通过抗体介导的靶向特异性和药物的纳米级尺寸，可以实现药物在 Her2 阳性乳腺癌 SKBR3 细胞中的充分积累。本研究还旨在验证使用该试剂作为双模式分子探针在体外提供 US/MR 对比度增强成像的可行性，以及 NIR 吸收 Au 诱导的乳腺癌细胞的靶向 PTT 效应。纳米壳。<​​/P>

Her2-GPH NPs制备过程示意图

材料和方法

材料

聚（乳酸-乙醇酸共聚物）（PLGA，羧酸封端，丙交酯：乙交酯 50:50，Mw 24,000–38,000）、聚烯丙胺盐酸盐（PAH，Mw 17,500）和四氯金酸 (III) 三水合物 (HAuCl4·3H2O)购自 Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.（中国上海）。平均直径为 10 nm 的油酸包覆超顺磁性氧化铁纳米粒子 (OA-SPIO) 购自上海索铁生物医药有限公司（中国上海）。全氟辛基溴 (PFOB)、聚乙烯醇（PVA，87–89% 摩尔水解，低分子量）、1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自阿拉丁化学有限公司（中国上海）。羧基封端的聚（乙二醇）（SH-PEG-COOH，Mw 2000）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗 Her2 抗体购自西安瑞熙生物科技有限公司（中国西安） ) 和 Abcam（剑桥，马萨诸塞州，美国）。其他试剂均为分析纯。

PFOB/SPIOs@PLGA NPs 的制备

PFOB/SPIOs@PLGA NPs 是通过使用合适的油/水乳液溶剂蒸发方法制造的 [24, 30]。简而言之，将在己烷中的油酸包被的 SPIO（0.5 mL，20 mg/mL）添加到二氯甲烷（3.6 mL）中，溶解 PLGA（100 mg）和 PFOB（60 μL）。将得到的有机相逐滴加入预冷的 PVA 水溶液（20 mL，2%，w /v ）。随后，在 80% 输出振幅设置下，在冰水浴中使用探针超声将系统乳化 2 分钟。之后，将乳液在室温下搅拌 5 h，然后离心（16,000 rpm，5 min，15 °C，Avanti J-25，Beckman Coulter），用去离子（DI）水洗涤两次，得到 PFOB/SPIOs@ PLGA NP。

PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs 的制备

首先，如先前报道的那样，制备平均直径为 5 nm 的柠檬酸盐稳定的金纳米粒子 [21]。同时，将PFOB/SPIOs@PLGA NPs悬浮液（1 mL）与PAH溶液（1.0 mg/mL，0.5 mol/L NaCl水溶液）混合30 分钟，然后离心（15,000 rpm，10 分钟，15 °C） ) 并用去离子水洗涤两次。然后，将混合物加入柠檬酸盐稳定的金 NPs 悬浮液 (100 ml) 中并搅拌 30 分钟。在重复离心/洗涤步骤后，将得到的 Au NPs 包覆的 PFOB/SPIOs@PLGA NPs 重新分散到 HAuCl4 溶液（2 mL，1% w /v ) 在磁力搅拌下。接下来，加入新鲜制备的盐酸羟胺溶液（NH2OH·HCl，0.3 mL，0.5 mol/L）以还原HAuCl4，在PFOB/SPIOs@PLGA NPs表面形成Au纳米壳。<​​/P>

Her2-GPH NP 的制备

将制备好的PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs水溶液（1 mL，1 mg/mL）与SH-PEG-COOH（5 mg）混合，在室温下搅拌12 h。离心（16,000 rpm，20 min，15 °C）并洗涤两次后，将沉淀物分散在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。接着，加入EDC(10 mg)和NHS(10 mg)，在室温下搅拌2 h，激活聚乙二醇化NPs的羧酸基团，然后反复离心/洗涤得到活化的NPs(GPH NPs)脚步。然后，将带有 FITC 标记的抗 Her2 抗体（10 μL，0.38 mg/mL）加入到活化的 NPs 分散体中，并在等温振荡器中孵育 90 分钟。最后，通过离心/洗涤步骤去除游离抗体以获得Her2功能化的PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs（Her2-GPH NPs）。

特征

Her2-GPH NPs 的表面结构和形态通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM，Hitachi S-4800，Tokyo，Japan）表征。高分辨率透射电子显微镜（TEM，JEM-2100；JEOL，Tokyo，Japan）通过将样品浸入涂碳的铜网格上来确认其内部结构。将样品（没有金溅射过程）的相应能量色散 X 射线光谱 (EDS) 连接到 TEM 以分析所得 NPs 的元素组成。使用动态激光散射 (DLS) 仪器 (Zetasizer Nano ZS3690; Malvern Instruments, Malvern, UK) 测量 Her2-GPH NPs 的流体动力学尺寸和 zeta 电位。用紫外-可见分光光度计（Beckman Coulter DU 730，美国）获得药剂在不同制备阶段的紫外-可见吸收光谱。 Her2-GPH NPs中Au和Fe元素的含量通过电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES，Vistampxicp Varian，USA）进行评估。

光热性能测量

Her2-GPH NPs 的光热性能是通过监测 NIR 激光照射下的温度升高来评估的。不同浓度的Her2-GPH NPs水溶液（50、100、150、200 μg/mL）被808 nm激光（1 W/cm ² ）照射 ）在石英比色皿（总体积为 1 mL）中保持 10 分钟，每 10 s 用 FLIR A300 热像仪测量溶液的温度。为了评估试剂的光热稳定性，在辐照过程之前和之后获取材料的吸收光谱。 DI水在相同条件下进行辐照以进行比较。

细胞培养

过表达Her2的人乳腺癌SKBR3细胞系（SKBR3细胞）和低表达Her2的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系（MDA-MB-231细胞）来自生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。它们在含有 20% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM, Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 中培养。所有细胞均在37 °C和5% CO2环境下生长。

体外细胞毒性测定

Her2-GPH NPs 的体外细胞毒性通过细胞计数试剂盒-8 测定（CCK-8，Dojindo Molecular Technologies Inc.，日本）对 SKBR3 和 MDA-MB-231 细胞进行评估。两种细胞分别接种于96孔板中，密度为1 × 10 ⁴ 每孔孵育 24 h。去除培养基后，用不同浓度（0、10、20、50、100、200 μg/mL）的Her2-GPH NPs处理细胞，并进一步孵育12或24 小时。然后，加入CCK-8溶液（10 μL CCK-8在100 μL DMEM中）并再孵育2 小时。最后，使用酶标仪（Thermo science Multiskan MK3）在450 nm波长处测量各孔的光密度（OD）。

体外受体特异性靶向研究

共聚焦激光扫描显微镜

SKBR3 和 MDA-MB-231 细胞接种于玻璃底细胞培养皿 (Φ =20 mm) 密度为 2 × 10 ⁴ 细胞/孔培养24 h，然后分为三组，分别为非靶向组、靶向组和靶向抑制组。两种非靶向组细胞分别用100 μL GPH NPs处理，靶向组细胞用100 μL Her2-GPH NPs处理。在靶向抑制组中，细胞与游离的抗 Her2 抗体（20 μL）孵育 30 分钟，然后用 Her2-GPH NPs 处理。分别孵育30 min后，PBS洗细胞3次，4%多聚甲醛固定15 min。然后用细胞核染色剂（DAPI；Beyotime Biotechnology Co., Ltd.，Shanghai，China）将细胞染色10 min，再次用PBS洗涤。最后，使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）（Leica TCS SP5 II，Leica Microsystems Ltd.，Mannheim，Germany）观察细胞。

流式细胞术

SKBR3 和 MDA-MB-231 细胞按上述方法培养和处理，分组与 LSCM 测定一致。所有细胞用胰蛋白酶消化，然后在流式细胞术 (FCM) 前以 2 × 10 ⁵ 的密度重新悬浮在 PBS 中 每管细胞。通过流式细胞仪（FC500MCL，Beckman Coulter，Fullerton，CA）测定细胞的荧光强度。 SKBR3 和 MDA-MB-231 细胞用作空白对照来设置门。然后调节FL1的电压和荧光补偿，保证细胞自发荧光在10 ¹ 荧光直方图。用纳米颗粒孵育细胞后，与空白组荧光强度的偏差反映了纳米颗粒与细胞的结合率。所有实验一式三份进行。

体外美国成像和定量分析

体外溶液超声成像

Her2-GPH NPs 的体外溶液超声成像是使用 Mylab Twice 超声系统装置（Esaote SpA，Genova，Italy）进行的。 Her2-GPH NPs 在脱气去离子水中分散成不同浓度（0.1、0.5、1、1.5、2 mg/mL）并注入Eppendorf管（2 mL）中，然后将管浸入超纯水槽中。使用 LA522 换能器在二维 (2D) 灰度模式和对比度增强模式下进行超声检查，参数如下：机械指数 (MI) =0.01，频率范围为 3-9 MHz。图像取自管的纵向横截面，并记录用于使用QontraXt V3.06软件进行时间-强度曲线（TIC）的定量分析。

针对美国的乳腺癌细胞成像

SKBR3细胞和MDA-MB-231细胞在6孔板中以2 × 10 ⁶ 的密度培养 /well 24 h，分为对照组、非靶向组和靶向组三组。非靶向组和靶向组的细胞分别用GPH NPs（100 μg/mL）和Her2-GPH NPs（100 μg/mL）处理30 min。随后，将细胞用PBS洗涤、消化并重新分散在含有PBS(0.5 mL)的试管中。琼脂糖凝胶 (1%) 在 20 mL 玻璃皿中制备。为模拟纳米颗粒对细胞表面的靶向超声成像效果，将六组试管中的细胞悬液分别用1mL注射器抽取，缓慢注入琼脂凝胶中。使用 SL3116 换能器在灰度模式下进行成像（增益 =70%；中心频率 =22 MHz；MI =0.06）。扫描后，在每组超声图像中绘制感兴趣区域（ROI）。使用图像分析软件（DigSubAna；上海交通大学，上海，中国）定量分析每个ROI的灰度值，以评估Her2-GPH NPs的靶向超声成像效果。

体外 MR 成像和定量分析

T 2 Her2-GPH NPs的测量和MR成像

Her2-GPH NPs 的 MR 成像和弛豫测量是使用 0.5 T 系统（Shanghai Niumag Corporation ration NM120-Analyst）进行的。 Her2-GPH NPs 以各种 Fe 浓度（0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mM）和 T 悬浮在去离子水中 使用自旋回波序列（TR =2000 ms；TE =100 ms；切片厚度 =3 mm；FOV =3 × 3 cm）获得样品的2加权MR图像。横向弛豫时间 (T 2) NPs 水溶液的水质子的数量, 和横向弛豫率 (r 2) 通过1/T的曲线拟合确定 2 (s ⁻¹ ) 与 Fe 浓度 (mM) 的关系。

乳腺癌细胞的靶向磁共振成像

SKBR3 和 MDA-MB-231 细胞的分组和处理与靶向美国成像测定一致。与非靶向 GPH NPs (100 μg/mL) 或靶向 Her2-GPH NPs (100 μg/mL) 孵育 30 分钟后，用 PBS 洗涤细胞、消化并分散在黄原胶 (1 mg/mL) 中.使用具有与上述相同参数的自旋回波序列扫描所有样品。定义每张图像的ROI，利用image J软件对信号强度进行定量分析。

体外靶向 PTT 评估

为了可视化 Her2-GPH NP 的靶向 PTT 效应，将 SKBR3 细胞接种在玻璃底细胞培养皿 (Φ =20 mm) 密度为 1 × 10 ⁵ 细胞/孔培养24 h，分别分为5组，分别为DMEM对照组有无激光照射、靶向材料组有无激光辐照、非靶向材料有激光辐照。目标组用含有 Her2-GPH NPs (100 μg/mL) 的 DMEM 分散液处理 30 分钟，非目标组在相同条件下用 GPH NPs (100 μg/mL) 处理。激光照射组细胞用近红外激光(808 nm, 1 W/cm ² ) 10 分钟，然后在 37 °C 下进一步培养 2 小时。然后，使用活/死细胞测定试剂盒（Life Technologies，Grand Island，NY）评估细胞活力。最后，用 LSCM 获取染色细胞的图像。为了量化光热细胞毒性，SKBR3 细胞 (1 × 10 ⁴ 每孔）接种在 96 孔板中并孵育 24 h。分组与上述一致，细胞活力通过CCK-8法检测。进一步定量评估不同浓度和激光照射下 Her2-GPH NPs 的光热细胞毒性。将细胞与含有不同浓度（0、50、100、150、200 μg/mL）的Her2-GPH NP的DMEM分散体一起温育。用PBS（10 mM，pH 7.0）洗涤后，用NIR激光（808 nm，1 W/cm ² ）照射细胞 ) 10 分钟，并进一步孵育 2 小时。然后还通过CCK-8测定法测定细胞活力。结果显示为平均值 ± 标准偏差 (n =4).

为了模拟Her2在乳腺肿瘤组织中的异质表达，我们将SKBR3细胞和MDA-MB-231细胞按不同比例（0:100%、25:75%、50:50%、75:25%、100 :0%)。所有细胞均用 Her2-GPH NPs (200 μg/mL) 处理 30 min, 并用 NIR 激光 (808 nm, 1 W/cm ² ) 10 分钟。进一步孵育 2 h 后，用 CCK-8 测定分析细胞活力。结果显示为平均值 ± 标准偏差 (n =4).

统计分析

定量数据表示为平均值 ± 标准偏差（mean ± SD）。通过方差分析 (ANOVA) 确定多组之间的统计差异，并使用 Student t 比较来自两个独立样本的数据 测试。 P <0.05被认为具有统计学显着差异。使用SPSS v17.0（IBM，Armonk，NY，USA）进行统计分析。

结果和讨论

特征

PFOB/SPIOs@PLGA NPs 是通过油/水乳液溶剂蒸发工艺制备的。 SEM 图像（图 2a）显示 PFOB/SPIOs@PLGA NPs 具有均匀的球形形态和光滑的表面。如 TEM 所示（图 2b），PFOB/SPIOs@PLGA NPs 的核和壳之间的电子密度存在明显差异，表明 PFOB 封装在 NPs 内部。此外，如更高放大率的插图所示，在 PFOB/SPIOs@PLGA NPs 的壳和液体 PFOB 核心区域中，SPIO 的存在被证明为深灰色斑点。根据DLS测量，PFOB/SPIOs@PLGA NPs的平均直径约为248.3 nm，多分散指数为0.037，zeta电位约为- 14.7 mV。因此，PFOB/SPIOs@PLGA NPs 可以很容易地吸收带正电荷的 PAH 从而随后附着平均尺寸为 5-7 nm 的带负电荷的 Au 纳米粒子，它们被用作种子以在 PFOB 表面周围成核金纳米壳的生长/SPIOs@PLGA NPs 通过播种程序。

Her2-GPH NPs 的表征。 一 SEM（标度 =2 μm）和b PFOB/SPIOs@PLGA NPs的TEM（尺度 =200 nm）图像； c SEM（标度 =1 μm）和d Her2-GPH NPs的TEM（比例 =100 nm）图像； e EDS元素映射图像显示了Her2-GPH NPs中C、O、Fe、F、Br和Au元素的分布

Her2-GPH NPs 是通过将抗 Her2 抗体通过 SH-PEG-COOH 连接到 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs 来制备的。在这个过程中，经典的碳二亚胺技术被用来激活聚乙二醇化的 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs 的羧酸基团，并促进氨基与抗体的共价键合 [31]。如 SEM 和 TEM 图像（图 2c、d）所示，Her2-GPH NPs 保持明确的球形形态，表面粗糙，在表面可以清楚地看到直径为数十纳米的致密 Au NPs。 NPs，这表明金纳米壳的成功制造。 Her2-GPH NPs 的 EDS 元素映射（图 2e）和元素分析结果（图 3a）清楚地揭示了大量的 Au 元素和 Fe、F 和 Br 元素的存在，表明 SPIO 和 PFOB 的成功封装和金纳米壳的形成。此外，通过ICP-AES评估Her2-GPH NPs中Au和Fe元素的含量分别为67.71 ± 7.34% wt.%和2.13 ± 0.52% wt.%。

Her2-GPH NPs 的表征。 一 Her2-GPH NPs的EDS元素分析； b Her2-GPH NPs 在不同制备阶段的紫外-可见吸收光谱； c 尺寸分布和d Her2-GPH NPs的Zeta电位

此外，还检查了不同制备阶段 Her2-GPH NPs 的 UV-Vis 吸收光谱（图 3b）。 PFOB/SPIOs@PLGA NPs在400~800 nm范围内没有明显的吸收峰，而Au NPs在约520 nm处显示出等离子体共振峰。 PFOB/SPIOs@PLGA@Au NPs 和 Her2-GPH NPs 都表现出一个连续的宽峰，范围从 600 到 900 nm（NIR 区域），因为附着的 Au 种子通过播种过程变得足够大以形成簇。 NIR 区域的宽吸收光谱确保 Her2-GPH NPs 可以作为 NIR 光热治疗的光吸收剂。此外，与 PFOB/SPIOs@PLGA NPs 相比，Her2-GPH NPs 的尺寸分布增加了 282.3 nm，多分散指数为 0.18（图 3c）。 zeta电位为- 31.3 mV（图3d），表明其稳定性良好。

光热性能测量

Her2-GPH NPs溶液在近红外激光(808 nm, 1 W/cm ² )，并且每 10 s 用一个红外热像仪监测温度变化。激光照射 10 min 后，不同浓度的 Her2-GPH NPs 溶液的热成像颜色发生变化，表明温度随着 Her2-GPH NPs 浓度的增加而升高（图 4a）。光热温度测量与成像数据一致。可以观察到，NPs 溶液的温度随着暴露时间和浓度的增加而升高（图 4b）。具体而言，在浓度为 0.2 mg/mL 时，Her2-GPH NPs 溶液的温度升高为 18.5 °C，而去离子水仅升高 1.2 °C。根据之前的研究[32]，为了杀死癌细胞，温度必须升高到热疗温度范围（40-47 °C）。然而，由于体外热损失，约 10 °C 的温度升高不足以诱导细胞死亡 [33]。 Her2-GPH NPs 可以在相对较低的浓度下将温度升高约 18 °C，从而具有通过高温杀死癌细胞的潜力。此外，为了验证 Her2-GPH NPs 的光热稳定性，在激光照射前后收集了样品的紫外-可见近红外吸收光谱。并且激光照射前后吸收光谱几乎没有变化（图4c），确保Her2-GPH NPs可以作为癌症PTT的有效光吸收剂。

Her2-GPH NPs 的光热效应。 一 近红外热像和b 近红外激光 (808 nm, 1 W/cm ^{2) 照射后不同浓度的 Her2-GPH NPs 的温度变化} ,10 min); c 光热照射试验前后的紫外-可见-近红外吸收光谱

体外细胞毒性测定

众所周知，NPs 的生物相容性是生物医学应用中的主要问题之一，应首先确定。因此，CCK-8 测定用于评估 Her2-GPH NPs 在乳腺癌 MDA-MB-231 和 SKBR3 细胞中的细胞毒性，如图 5a 和 b 所示。与对照相比，Her2-GPH NPs处理的MDA-MB-231和SKBR3细胞在10-200 μg/mL的浓度范围内24 小时的存活率保持在90%以上，表明该细胞毒性低，生物相容性好。产生的纳米颗粒，可以保证其在进一步细胞实验和临床研究中的安全性。

a 的细胞活力 MDA-MB-231 和 b SKBR3 细胞在不同剂量的 Her2-GPH NPs（0、10、20、50、100、200 μg/mL）下持续 12 h 和 24 h（数据表示为平均值 ± SD，n =4)

体外受体特异性靶向研究

共聚焦激光扫描显微镜

异硫氰酸荧光素（FITC）被广泛用作免疫检测的绿色荧光探针，它可以很容易地结合多种单克隆抗体。因此，我们选择了 FITC 标记的抗 Her2 抗体，通过免疫荧光检测可以更直观地观察 NPs 与抗体的连接。为了验证抗her2抗体与GPH NPs的结合，将GPH NPs和Her2-GPH NPs放置在培养皿上（Φ =20 mm) 用于 CLSM 分析。如图 6 所示，在明场中可以清楚地观察到 Her2-GPH NP 和 GPH NP。 GPH NPs无荧光信号，而Her2-GPH NPs在FITC和合并通道中呈现亮绿色荧光，证实抗her2抗体与GPH NPs结合成功。

Her2-GPH NPs和GPH NPs在明场、FITC荧光和合并通道的共聚焦显微图像（比例尺 =5 μm）

我们利用 LSCM 来确认体外 Her2-GPH NPs 的靶向特异性。从图 7 可以看出，与非靶向组 (b) 相比，与靶向 Her2-GPH NPs (a) 孵育的 SKBR3 细胞在细胞膜表面呈现亮绿色荧光信号，表明 NPs 携带 Her2 抗体能有效结合 Her2 阳性细胞 [34]。为了清楚地观察 SKBR3 细胞中 Her2-GPH NP 的分布，我们提供了明亮的图像 (a1)、FITC 荧光图像 (a2)、核图像 (a3) 和它的叠加图像 (a4)。由于NPs的孵育时间短，它们主要分布在细胞膜表面并聚集成黑点。在竞争研究中，当 SKBR3 细胞用过量的游离抗 Her2 抗体预处理，然后与 Her2-GPH NPs 孵育时，荧光信号可以忽略不计（图 7c）。这些结果表明 Her2-GPH NPs 的靶向行为是受体介导的，可以被过量的游离抗 Her2 抗体阻断 [26]。此外，在相同条件下用Her2-GPH NPs处理的MDA-MB-231细胞中检测到很少的荧光（图7d），这证实了Her2-GPH NPs与过度表达Her2受体的SKBR3细胞特异性结合。

SKBR3 细胞与靶向 Her2-GPH NPs (a /a1 –a4 , e ) 和非靶向 GPH NPs (b , f )，游离 Her2 抗体预处理的 SKBR3 细胞与 Her2-GPH NPs (c , g )，以及与 Her2-GPH NPs 一起孵育的 MDA-MB-231 细胞 (d , h ）。 a1 明场图像； a2 DAPI频道的形象； a3 FITC通道的形象；和 a4 合并通道的图像（比例尺 =10 μm）

流式细胞术

通过 FCM 进一步定量评估 Her2-GPH NPs 对细胞的结合率。如图 7 所示，靶向 NPs 与 SKBR3 细胞（e）的结合率显着高于 MDA-MB-231 细胞（h）（86% ± 3.72% vs 2.31% ± 0.36%，P <0.001)，表明 Her2-GPH NPs 对 Her2 阳性细胞的特异性靶向能力。此外，Her2-GPH NPs与过量游离抗Her2抗体预处理的SKBR3细胞几乎没有靶向结合（图7g），靶向抑制组与靶向组之间存在显着差异（3.16% ± 0.41） % vs 86% ± 3.72%, P <0.001)。综上所述，FCM结果进一步有力地证明了Her2-GPH NPs具有识别并结合过表达Her2受体的SKBR3细胞的特异性靶向能力，其靶向行为是受体介导的。

体外美国成像和定量分析

体外溶液超声成像

在我们的研究中，使用 Mylab Twice 超声系统单元在不同模式下体外评估 Her2-GPH NPs 溶液的 US 成像效果。从图 8a 中观察到，充满 Her2-GPH NPs 溶液的管子在 2D 灰度和 CEUS 模式下都显示出强烈的点状回波。相比之下，去离子水表现为回声。此外，随着 Her2-GPH NPs 浓度的增加，超声对比度增强信号逐渐增加。如 TIC 所示，随着 NPs 浓度的增加，Her2-GPH NPs 的平均信号强度逐渐增加，并与 CEUS 结果保持一致。浓度为 2 mg/mL 的药剂比 0.1 mg/mL 的 NPs 具有显着更强的对比增强信号（82 ± 0.69 dB vs 27 ± 6.7 dB，P <0.01)，表明更高浓度的 NP 会产生更强的反向散射。以上表明 Her2-GPH NPs 在体外具有令人满意的对比度增强效果，并且这种对比度增强是浓度依赖性的。此外，还研究了浓度为 2 mg/mL 的 Her2-GPH NPs 的超声成像时间长度（图 8b）。 Her2-GPH NPs 在 2 min 前表现出细腻的对比度增强信号，并且信号强度随着时间的推移逐渐减弱。但5 min内仍有明显增强信号，满足临床超声造影要求。传统的充气微泡作为 UCA 可以通过超声下的非线性振荡增强血液的后向散射信号，但由于其在血管内成像方面的局限性和稳定性差而不适用于组织分子评估 [35]。与充气剂相比，液态碳氟化合物填充的 PLGA 纳米胶囊具有声学稳定性，循环半衰期延长 [16]。此外，我们之前的研究发现，Au 纳米壳由于其原子序数和密度高而具有良好的反射特性 [36]。因此，我们将PFOB填充PLGA纳米胶囊的超声共振特性与Au纳米壳的良好回声相结合，显着增强了Her2-GPH NPs的体外后向散射信号。

一 Her2-GPH NPs 在不同浓度 (0, 0.1, 1, 1.5, 2 mg/mL)。 b Her2-GPH NPs (2 mg/mL) 的体外超声图像随时间变化

针对美国的乳腺癌细胞成像

Her2-GPH NPs 对乳腺癌细胞的靶向超声成像能力使用 Mylab Twice 超声系统单元在 2D 灰度模式下进行评估。如图 9a 所示，NPs 处理的细胞和对照细胞在凝胶中均显示出均匀的高回声带，边界清晰。可以清楚地观察到，用 Her2-GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞的回声带比非靶向和对照 SKBR3 细胞的回声带更亮和更密集。然而，在用靶向或非靶向 NPs 处理的 MDA-MB-231 细胞中没有观察到显着的回波信号差异。我们根据定义的 ROI 进一步量化了图像的平均灰度值，结果如图 9b 所示。靶向Her2-GPH NPs处理SKBR3细胞的灰度值显着高于SKBR3非靶向组和对照组（P <0.01)。此外，与用相同 NPs 处理的 MDA-MB-231 细胞相比，用靶向 Her2-GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞显示出更高的灰度值（P <0.05)。这些结果表明Her2-GPH NPs可以特异性结合Her2阳性SKBR3细胞，具有增强靶细胞超声分子成像效果的潜力。

一 体外超声成像和b 用靶向 Her2-GPH NPs 或非靶向 GPH NPs 处理的 MDA-MB-231 和 SKBR3 细胞的灰度值分析。 MDA-MB-231 和 SKBR3 细胞作为对照（数据表示为平均值 ± SD，*P <0.05, **P <0.01, n =3)

体外 MR 成像和定量分析

T 2 Her2-GPH NPs的测量和MR成像

在 T 中对 SPIO 进行了深入研究 2 加权 MR 成像，因为它们能够缩短周围水质子的横向弛豫时间，这会导致 MR 信号强度降低，并能够提供目标病变的负对比度增强 [37, 38]。 T 在 0.5 T 磁场下评估了具有不同 Fe 浓度的 Her2-GPH NP 的 2 对比成像能力。图 10 a 显示了横向弛豫率 (1/T 2) 作为 Her2-GPH NPs 水溶液中铁浓度的函数的水质子。和松弛性 (r 2) 基于斜率计算为 441.47 mM ^-1 s ⁻¹ ，是基于SPIO的商用MR成像造影剂Feridex的2倍多（152 mM ⁻¹ s ⁻¹ ) 在相同的磁场强度下 [39]。 T 越高 2弛豫可能是由于聚合物基质内SPIO的聚集导致磁性NP的尺寸相对增大并增强了磁性相互作用[37, 40]。此外，T的信号强度 2加权MR成像随着铁浓度的增加而逐渐下降（图10b），这进一步证实了Her2-GPH NPs具有T的能力 2加权MR对比成像。

体外 MR 成像。 一 横向弛豫率 (1/T 2) Her2-GPH NPs 水溶液在 0.5 T 磁场中与铁浓度的函数关系。 b T 使用自旋回波序列获得的具有不同铁浓度的 Her2-GPH NP 的 2 加权 MR 图像。 c T 2 加权 MR 图像和 d Her2-GPH NPs (100 μg/mL) 和 GPH NPs (100 μg/mL) 与 MDA-MB-231 和 SKBR3 细胞孵育的信号强度。 MDA-MB-231 和 SKBR3 细胞作为对照（数据表示为平均值 ± SD，*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001, n =3)

乳腺癌细胞的靶向磁共振成像

Her2-GPH NPs对SKBR3和MDA-MB-231细胞的靶向MR成像效果通过体外T得到证实 2 加权 MR 成像。如图 10c 和 d 所示，用靶向 Her2-GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞表现出明显的负对比度增强，与对照细胞相比，信号强度降低了 48%（P <0.001)。然而，非靶向 GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞的 MR 信号强度几乎没有降低。此外，与对照组相比，Her2-GPH NPs或GPH NPs标记的MDA-MB-231细胞的信号强度没有明显变化（P> 0.05)。此外，与 MDA-MB-231 细胞相比，Her2-GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞显示出更高程度的信号强度降低（P <0.001)，可以用来区分两个细胞。以上结果共同表明Her2-GPH NPs可以增强T 通过受体介导的细胞特异性摄取的2加权MR成像[41].

体外靶向 PTT 评估

最初，钙黄绿素-AM/碘化丙啶 (PI) 染色用于视觉评估体外靶向光热细胞毒性。 Calcein AM 是一种非荧光活细胞染色剂，可渗透细胞膜并水解，在活细胞中产生绿色荧光钙黄绿素染料。碘化丙啶 (PI) 是一种死细胞染色剂，它与死细胞的 DNA 结合产生红色荧光 [33]。如图 11a 所示，当 NIR 激光照射或 Her2-GPH NPs 单独使用时，没有明显的死细胞，表明激光照射和 NPs 本身都没有细胞毒性。同样，用非靶向 GPH NPs 结合 NIR 激光处理的细胞几乎没有细胞死亡。相反，在激光照射下处理 Her2-GPH NPs 时可以观察到大量死细胞，这表明该试剂可以通过靶向光热效应诱导热细胞死亡。通过CCK-8测定进一步定量评估细胞活力。如图 11b 所示，与对照组相比，用 Her2-GPH NPs 和激光照射处理的 SKBR3 细胞的细胞活力降低 (62 ± 4.56%) (P <0.001)。此外，在激光照射 10 min 下，靶向 Her2-GPH NPs 组的细胞活力显着低于非靶向组（38 ± 4.56% vs 87.6 ± 4.06%，P <0.05).

体外靶向光热测定。 一 不同处理组（Her2-GPH NPs 组、激光组、GPH NPs + 激光组、Her2-GPH NPs + 激光组）中钙黄绿素-AM/PI 染色的SKBR3 细胞的共聚焦显微图像（比例尺 =100 μm）。 SKBR3 细胞作为对照。 b 处理后5组SKBR3细胞的相对细胞活力如图11a （数据表示为平均值 ± SD，*P <0.05, ***P <0.001, n =4); c SKBR3 细胞与不同浓度（0、50、100、150、200 μg/mL）的 Her2-GPH NPs 在有或没有 NIR 激光照射（808 nm，1 W/cm ² ）的情况下的细胞活力 , 10 min) (数据表示为平均值 ± SD, *P <0.05, ***P <0.001, n =4)

此外，我们使用 CCK-8 分析进一步定量评估了不同浓度 Her2-GPH NPs 的光热细胞毒性。如图 11c 所示，在没有 NIR 激光照射的情况下，用 Her2-GPH NPs 处理的 SKBR3 细胞的活力保持在 90% 以上，而激光照射的细胞的活力随着 Her2-GPH NPs 浓度的增加而显着降低。与相同浓度的非激光照射细胞相比，只有不到 20% 的激光照射细胞在 200 μg/mL 的浓度下保持活力（P <0.001)。这些结果进一步证实，相对较低浓度的Her2-GPH NPs足以提供足够的温度升高来杀死SKBR3细胞。

此外，我们以不同比例共培养SKBR3和MDA-MB-231细胞以模拟Her2在乳腺肿瘤组织中的异质表达。结果表明，Her2-GPH NPs光热诱导后总细胞活力随着SKBR3细胞比例的增加而降低，其他比例组的总细胞活力显着高于100%SKBR3细胞组（ <0.05)（附加文件 1：图 S1）。此外，在Her2-GPH NPs存在30 min的情况下，近红外激光诱导后的总细胞活力显着低于非激光照射细胞（P <0.05)，100% MDA-MB-231 细胞组除外。总之，Her2-GPH NPs 可以特异性结合 SKBR3 细胞，并具有通过光热效应诱导癌细胞死亡的巨大潜力。 SKBR3细胞光热热疗的可能机制应主要归因于癌细胞暴露在较高温度下，通过使细胞内蛋白质变性而抑制正常细胞的生长和增殖[42]。

结论

Her2-GPH NPs 是一种 Her2 功能化治疗诊断剂，它集成了双模式 US/MR 成像和靶向 PTT，已在体外成功设计、制造和研究。通过与抗 Her2 抗体结合，该试剂可以以高特异性和敏感性识别或结合过度表达 Her2 的乳腺癌 SKBR3 细胞。此外，通过 PFOB 和 SPIO 的共同加载，以及 Au 纳米壳 PLGA“壳核结构”的构建，由此产生的 Her2-GPH NPs 在体外 US 和 T 中提供了出色的对比度增强 2 -加权磁共振成像。此外，Au 纳米壳的形成使该试剂能够作为乳腺癌细胞中靶向 NIR PTT 的有效光吸收剂。我们的研究结果为乳腺癌协同诊断和辅助治疗的整合提供了初步探索性研究，仍需进一步的体内研究。

数据和材料的可用性

本文包含当前研究中生成和分析的数据集。

缩写

Au NP：

金纳米粒子

CCK-8：

Cell-counting kit-8

DAPI：

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚

DI：

去离子

DLS：

动态激光散射

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

EDC：

乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺

EDS：

能量色散X射线光谱

FCM：

流式细胞术

FDA：

食品药品监督管理局

FE-SEM：

场发射扫描电镜

FITC：

异硫氰酸荧光素

GPH NP：

金纳米壳磁性杂化纳米粒子

Her2：

人表皮生长因子受体2

HR-TEM (TEM)：

高分辨透射电子显微镜

HUVEC 细胞：

人脐静脉内皮细胞

ICP-AES：

电感耦合等离子体原子发射光谱

LSCM：

激光扫描共聚焦显微镜

MRI：

磁共振成像

近红外：

近红外

多环芳烃：

聚烯丙胺盐酸盐

PFOB：

全氟辛基溴

PLGA：

聚乳酸-乙醇酸共聚物

PTT：

光热疗法

PVA：

聚乙烯醇

SPIO：

超顺磁性氧化铁纳米粒子

TIC：

时间强度曲线

UCA：

超声造影剂

美国：

超声成像