MicroRNA-499-5p 靶向 Sox6 缓解脓毒症诱导的肺损伤

摘要

背景

MicroRNA（miRNA）参与脓毒症病理过程。本研究旨在探讨 miR-499-5p 靶向性别决定区 Y 相关高迁动率族盒 6（Sox6）对小鼠脓毒症诱导肺损伤的保护作用。

方法

建立盲肠结扎穿刺（CLP）脓毒症肺损伤模型。检测肺组织湿/干重比（W/D）、miR-499-5p、Sox6、Caspase-3、Caspase-9 表达；评估肺损伤评分、胶原纤维、肺纤维化程度；TUNEL 染色检测细胞凋亡；支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织中炎性因子、氧化应激指标检测；失/得功能实验验证 miR-499-5p 与 Sox6 靶向关系。

结果

脓毒症模型小鼠肺组织 W/D 比升高、Sox6 上调、miR-499-5p 下调。上调 miR-499-5p 或敲低 Sox6 均可改善肺组织病理，降低肺损伤评分、胶原纤维、纤维化程度、TUNEL 阳性细胞、Caspase-3/9 蛋白表达，减少 BALF 及肺组织炎性因子，抑制氧化应激。双荧光素酶报告基因实验证实 miR-499-5p 直接靶向 Sox6 3'UTR。

结论

高表达 miR-499-5p 通过耗竭 Sox6 减轻肺组织细胞凋亡、抑制脓毒症肺损伤炎症反应，是脓毒症肺损伤的潜在生物标志物和治疗靶点。

引言

脓毒症是感染引发的全身性炎症反应，导致多器官功能障碍，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）为常见并发症。肺是脓毒症中最脆弱的器官，脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）高发。肺泡毛细血管通透性受损导致缺氧，肺细胞凋亡是关键致伤因素。目前除支持治疗和抗生素外，缺乏有效疗法，死亡率居高不下。miRNA 为 18–24 nt 内源性非编码小 RNA，通过结合靶基因 3'UTR 调控表达。miR-499-5p 为肌球蛋白编码 miRNA 新成员，血清水平可指示脓毒症器官衰竭，参与脓毒症心肌细胞凋亡。Sox6 属 SRY 相关 HMG 盒家族转录因子，在多组织发育中调控祖细胞向成熟细胞过渡。既往研究显示 Sox6 升高参与脓毒症心肌凋亡，Sox2/4 在小细胞肺癌高表达，但 Sox6 与脓毒症肺损伤关系尚不明确。本研究旨在阐明 miR-499-5p 靶向 Sox6 对脓毒症肺损伤的保护机制。

材料与方法

动物实验伦理

符合 NIH 实验动物护理指南，经威海市立医院、齐鲁医学院伦理委员会批准。

实验动物

SPF 级 BALB/c 雄性小鼠（6–8 周，18–22 g），山东大学实验动物中心购入。24 ± 2 ℃，12 h 明暗循环，自由饮食饮水，适应性饲养 7 天。

CLP 建立脓毒症肺损伤模型

随机分假手术组（n=8）和模型组。术前 12 h 禁食，1% 呋喃妥因钠（70 mg/kg）腹腔注射麻醉。正中切开腹部 1 cm，取出盲肠避开肠系膜血管，1-0 丝线结扎盲肠远端 1/2 处，16 号穿刺针对侧穿刺，挤出少量肠内容物，复位缝合。假手术组仅取出盲肠复位。术后皮下注射 1 mL 0.9% NaCl，分笼饲养。

体内转染

建模前 1 h 气管滴注转染复合物（50 μL）：模型组、miR-499-5p agomir 组、agomir NC 组、si-Sox6 组、si-NC 组、miR-499-5p agomir + oe-Sox6 组、miR-499-5p agomir + oe-NC 组（各 n=8）。麻醉后 45° 仰卧固定，暴露气管滴注，垂直旋转小鼠使复合物均匀分布于肺部。监测呼吸心跳，异常即停止。序列购自上海 GenePharma。转染后饲养 1 天处死取材：右肺下叶石蜡切片病理，中叶称湿重后 56 ℃ 烘干 72 h 称干重算 W/D 比，上叶液氮保存测 mRNA/蛋白，左肺灌洗 3 次（0.4 mL 生理盐水/次）收集 ~1 mL BALF，离心上清 -80 ℃ 保存测炎性因子。另设 3 组（n=10）观察 7 天生存率（Kaplan-Meier 法）。

病理染色与评分

H&E 染色：美肺协会评分系统（肺泡充血、出血、中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚/透明膜形成），0–4 分。Masson 染色：Ashcroft 半定量评分（0–8 分），胶原纤维蓝、细胞核蓝黑、细胞质红。TUNEL 染色（Roche 试剂盒）：凋亡细胞核褐色，凋亡指数 = TUNEL 阳性细胞百分比。免疫组化：Caspase-3、Caspase-9、SOX6 抗体（Abcam），Image Pro Plus 6.0 分析。

分子生物学检测

RT-qPCR：OMEGA 试剂盒提 RNA，RevertAid 逆转录，FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）扩增，2^−ΔΔCt 法定量。U6 为 miR-499-5p 内参，GAPDH 为其他基因内参。Western blot：RIPA 裂解，BCA 定量，10% SDS-PAGE，PVDF 膜转印，5% 脱脂奶封闭，一抗孵育（Sox6、Caspase-3/9、TNF-α、IL-1β、IL-6、GAPDH），HRP 二抗，ECL 显影。ELISA（Boster 试剂盒，450 nm）测 BALF 中 IL-1β、IL-6、TNF-α。氧化应激指标：肺匀浆上清测 MPO、MDA、SOD、GSH-Px、CAT（南京建成生物试剂盒）。双荧光素酶报告基因实验：TargetScan 预测 miR-499-5p 与 Sox6 3'UTR 有 4 个结合位点，构建 WT/MUT 报告载体，TC-1 细胞（小鼠肺上皮细胞）共转染，Promega 双荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性。

统计学分析

SPSS 21.0，数据为均数 ± 标准差。两组 t 检验，多组单因素 ANOVA + Tukey 事后检验。生存曲线 Kaplan-Meier 法。P < 0.05 为显著差异。

结果

脓毒症肺损伤模型中 W/D 比与 Sox6 升高、miR-499-5p 降低

生存曲线（图 1a）：假手术组 7 天生存率 100%，模型组下降，miR-499-5p 处理组改善。W/D 比（图 1b）：模型组升高（P<0.05）；miR-499-5p agomir 组和 si-Sox6 组降低（P<0.05）；miR-499-5p agomir + oe-Sox6 组升高（P<0.05）。miR-499-5p 表达（图 1c）：模型组降低，agomir 组升高（P<0.05）。Sox6 mRNA（图 1d）和蛋白（图 1e–g）：模型组升高，agomir 组和 si-Sox6 组降低，oe-Sox6 组逆转（P<0.05）。免疫组化确认蛋白水平一致变化趋势。

恢复 miR-499-5p 或耗竭 Sox6 改善肺病理、降低损伤评分与纤维化

H&E（图 2a）：假手术组结构完整；模型组、NC 组、oe-Sox6 组肺泡渗出、水肿、出血、炎性细胞大量浸润；miR-499-5p agomir、si-Sox6、oe-NC 组病变减轻。肺损伤评分和 Ashcroft 纤维化评分（图 2b、d）：模型组显著升高（P<0.05）；agomir 和 si-Sox6 组降低（P<0.05）；oe-Sox6 组逆转升高（P<0.05）。Masson 染色（图 2c）：假手术组少量蓝色胶原；模型组、NC 组、oe-Sox6 组胶原增多；agomir、si-Sox6、oe-NC 组胶原减少。

减少凋亡细胞及 Caspase-3/9 表达

Western blot、TUNEL、免疫组化（图 3）：模型组 TUNEL 阳性细胞、Caspase-3/9 蛋白升高（P<0.05）；agomir 和 si-Sox6 组降低（P<0.05）；oe-Sox6 组逆转升高（P<0.05）。

降低 BALF 及肺组织炎性因子

ELISA 和 Western blot（图 4）：模型组 TNF-α、IL-1β、IL-6 升高（P<0.05）；agomir 和 si-Sox6 组降低（P<0.05）；oe-Sox6 组逆转升高（P<0.05）。

调节氧化应激指标

氧化应激检测（图 5）：模型组 SOD、CAT、GSH-Px 活性降低，MDA、MPO 升高（P<0.05）；agomir 和 si-Sox6 组抗氧化酶活性升高、MDA/MPO 降低（P<0.05）；oe-Sox6 组逆转（P<0.05）。

miR-499-5p 直接靶向 Sox6

TargetScan 预测 miR-499-5p 靶向 SOX4/6。RT-qPCR 显示模型组 SOX2/4/6 均升高，SOX6 升高最显著；agomir 组 SOX2 无变化、SOX4 下降、SOX6 显著下降（附件图 S1）。双荧光素酶实验（图 6）：WT 载体 + miR-499-5p agomir 共转染显著降低荧光素酶活性（P<0.05）；MUT 载体或 NC 对照无显著变化（P>0.05），证实直接靶向关系。

讨论

脓毒症致休克和多器官功能障碍，ALI 为最早、最高发、进展最快、致死率高的并发症，缺乏有效疗法。既往研究证实 miR-218、miR-146a、miR-125b 等可减轻脓毒症肺损伤炎症，但 miR-499-5p 机制研究稀缺。Sox6 在脓毒症心肌凋亡中作用已知，肺损伤中角色待阐明。本研究发现：脓毒症肺损伤模型中 W/D 比、Sox6 升高，miR-499-5p 降低，与临床脓毒症患者 miR-499-5p 下调、肺癌组织 Sox6 上调文献一致。双荧光素酶实验首次在脓毒症肺组织中证实 miR-499-5p 直接靶向 Sox6。功能实证显示：恢复 miR-499-5p 或敲低 Sox6 均能改善病理、降低损伤评分和纤维化、减少凋亡（TUNEL、Caspase-3/9）、抑制炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、改善氧化应激（SOD/CAT/GSH-Px↑，MDA/MPO↓）。相关文献支持：miR-499-5p 抑制 NSCLC 增殖促进凋亡、Sox6 敲低减轻缺氧/复氧诱导凋亡及 Caspase-3、改善阿尔茨海默病海马病理和神经元凋亡、抑制高糖诱导肾系膜细胞凋亡和纤维化、降低 P19CL6 细胞 Caspase-3 活性和凋亡率；Sox6 低表达减轻阿尔茨海默病神经炎症；CLP-ALI 特征为炎症形态学改变、W/D 比升高、BALF 蛋白浓度升高、MPO/MDA 升高、SOD/GSH-Px/CAT 降低；miR-499-5p 过表达和 Sox6 低表达降低 MDA。综上，miR-499-5p/Sox6 轴通过抗凋亡、抗炎、抗氧化多途径保护脓毒症肺损伤。

结论

高表达 miR-499-5p 通过耗竭 Sox6 减轻肺组织细胞凋亡、抑制脓毒症肺损伤炎症反应，为脓毒症肺损伤治疗提供潜在生物标志物和治疗靶点。仍需临床研究验证其疗效。