SOX2调控CCAT1/miR-185-3p/FOXP3通路控制宫颈癌干细胞增殖与自我更新

摘要

已有研究阐述长链非编码RNA（lncRNAs）在宫颈癌（CC）中的作用。本研究旨在探讨性别决定区Y框蛋白2（SOX2）/结肠癌相关转录本1（CCAT1）/微小RNA-185-3p（miR-185-3p）/叉头框蛋白3（FOXP3）轴对宫颈癌干细胞增殖和自我更新能力的影响。检测CC组织和细胞中miR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3表达。验证SOX2/CCAT1表达与CC患者临床病理特征关系。在CD44⁺HeLa细胞中进行失/得功能实验探讨生物学功能和自我更新能力。最终验证SOX2、CCAT1、FOXP3、miR-185-3p间关系。CC组织和细胞中miR-185-3p表达降低，SOX2、CCAT1、FOXP3表达升高。SOX2和CCAT1表达与CC肿瘤大小、淋巴结转移（LNM）和国际妇产科联盟分期（FIGO分期）相关。下调SOX2或CCAT1、上调miR-185-3p抑制CD44⁺HeLa细胞增殖、侵袭、迁移、成球数并促进凋亡。SOX2可结合CCAT1影响miR-185-3p表达，FOXP3被miR-185-3p靶向。

引言

宫颈癌（CC）是女性第四大死因，2018年全球估计57万新增病例、31.1万死亡。这种复杂疾病涉及遗传效应、病毒感染等多种因素。随着HPV联合检测和HPV疫苗推广，宫颈上皮内瘤变和癌症早期诊断降低了CC发病率、发病率和死亡率。早期CC患者推荐手术：保留生育功能手术、锥切、广泛气管切除、盆腔淋巴结清扫、盆腔放疗、近距离放疗。因晚期CC患者转移复发，预后仍差。因此仍迫切需要鉴定新有效预后标志物和治疗策略改善CC治疗。

性别决定区Y框蛋白2（SOX2）是SOX家族转录因子关键成员，主要表达于胚胎和成体干细胞，也在肿瘤干细胞表达。研究显示SOX2通过刺猬信号通路调控CC放射抵抗。另一研究证实SOX2对维持CC细胞系癌干细胞亚群至关重要。长链非编码RNA（lncRNAs）是长度≥200核苷酸RNA分子。结肠癌相关转录本1（CCAT1）位于人类8q24.21染色体，被视为结肠癌遗传突变"热点"。研究报道CCAT1加速CC细胞增殖侵袭。Jia等报道CCAT1显著增强CC细胞增殖、迁移、侵袭。另一研究揭示CCAT1通过降低微小RNA-185-3p（miR-185-3p）破坏肠道屏障加重炎症性肠病恶性程度。miRNA可通过降低mRNA、抑制翻译反向调控基因表达。体外实验显示miR-185-3p调控鼻咽癌放射抵抗。另一研究暗示miR-185参与卵巢癌顺铂耐药。叉头框蛋白3（FOXP3）属FOX蛋白家族转录因子，首见于调节性T（Treg）细胞，在Treg细胞维持和过程中起关键作用。研究报道FOXP3与CC淋巴管生成相关。另一研究揭示FOXP3水平与CC FIGO分期和肿瘤大小显著相关。本研究因此考察SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3轴对CC干细胞增殖和自我更新能力影响。

材料与方法

伦理批准与知情同意

涉及人类实验遵循赫尔辛基宣言原则。经吉林大学第一医院机构审查委员会批准。所有参与者签署知情同意书。

研究对象

2016年12月至2018年12月从CC患者获取39例CC组织及对应邻近正常组织，液氮保存。纳入标准：(1)病理活检、宫颈涂片细胞学、碘实验、阴道窥器、宫颈椎切除确诊CC；(2)术前2周未接受放化疗。排除标准：(1)接受任何放化疗；(2)不同意样本采集；(3)免疫系统疾患。

细胞筛选与培养

CC细胞系（SiHa、HeLa、CaSki、HCC94、C33A）和人宫颈上皮永生化细胞系H8购自上海伯乐生物科技有限公司。SiHa、HeLa、HCC94用高糖DMEM含10% FBS培养；CaSki、C33A、H8用RPMI-1640含10% FBS培养（37℃、5% CO₂）。每2天消化传代。

CC干细胞分选（CD44⁺HeLa细胞）

CC干细胞从HeLa细胞系通过悬浮培养分离。HeLa细胞用无血清Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）在超低吸附培养皿培养21天，每3-5天半定量换液。部分细胞悬浮成球，获HeLa成球细胞（SFCs）。鉴定分析球形细胞特性。胰蛋白酶消化调整至1×10⁶细胞/mL。加CD44抗体流式细胞术分选。CD44阳性HeLa为肿瘤干细胞，阴性为非干细胞。CC干细胞用DMEM/F12培养，添加20 ng/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）和B27，含1%青霉素链霉素。

细胞处理

CD44⁺HeLa细胞转染sh-SOX2、sh-SOX2 NC、sh-CCAT1、sh-CCAT1 NC、miR-185-3p mimic、mimic NC、sh-CCAT1+miR-185-3p inhibitor、sh-CCAT1+inhibitor NC。所有寡核苷酸序列由GenePharma（上海中国）提供。胰蛋白酶消化后接种6孔板（3×10⁶细胞/孔）。达60%融合度时换无血清培养基孵育1小时。用Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国）转染。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

组织细胞RNA用Trizol（Invitrogen）提取。1 μg RNA用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶试剂盒（Invitrogen）逆转录cDNA。cDNA加入实时PCR体系。引物由上海桑根生物工程有限公司设计（表1）。U6为miR-185-3p内参，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为SOX2、CCAT1、FOXP3内参。2^−ΔΔCt法分析结果。

Western Blot实验

提取细胞组织总蛋白。双氯乙酸试剂盒（AmyJet Scientific，武汉中国）测定蛋白浓度。蛋白加样品缓冲液煮沸5分钟，冰浴离心。10% SDS-PAGE电泳转膜。5%脱脂奶粉封闭1小时，一抗SOX2（1:1000，江苏瑞思坦生物科技）、FOXP3（1:1000，Abcam，美国）、GAPDH（1:1000，Cell Signaling Technology，美国）孵育，再加辣根过氧化物酶标记二抗，封口膜覆盖曝光。Bio-rad Gel Doc EZ成像仪（Bio-rad，美国）显影。ImageJ2x软件分析蛋白图像。

细胞计数试剂盒（CCK-8）实验

用CCK-8试剂盒（Beyotime，上海中国）实验。细胞（1×10⁴）接种96孔板培养。培养0、24、48、72小时后每孔加10 μL CCK-8溶液孵育1小时。全波长酶标仪（Multiskan Spectrum）450 nm测定光密度值。取6孔平均值。以时间为横坐标、相对细胞活力为纵坐标绘制生长曲线。光密度值代表细胞增殖。

流式细胞术

细胞（1×10⁶）1500 r/min离心，200 μL结合缓冲液重悬，依次加5 μL碘化丙啶（PI）、5 μL Annexin V-FITC，加400 μL缓冲液。流式细胞仪（BD Biosciences，美国）验证细胞凋亡率。

划痕实验

转染细胞消化制成细胞悬液。细胞悬液（1×10⁶细胞/mL）接种6孔板培养至80-90%融合。用10 μL无菌吸头沿刻度尺在6孔板均匀划横向和纵向划痕。换完全培养基持续培养。0小时和72小时显微镜观察细胞迁移并同位置拍照。

Transwell实验

转染细胞胰蛋白酶消化、1000 g离心、DMEM洗涤。完全水合Transwell小室置于含10% FBS-DMEM（600 mL/孔）24孔板。细胞悬液（5×10⁵细胞/mL，200 μL）加入上室（包被1:8 Matrigel 80 μL），下室加500 μL 20% FBS-DMEM。持续培养24小时，500 μL 4%多聚甲醛（PFA）固定，0.1%结晶紫染色。棉签擦去上室表面和边缘细胞。随机选5视野，倒置显微镜（Nikon Eclipse TE2000-S，日本）计数。

成球实验

低吸附6孔板含无血清悬浮培养基，每孔接种200细胞。2周后倒置显微镜（Nikon Eclipse TE2000-S）观察成球率，成球率=平均球数/接种细胞数×100%。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验

ChIP实验用ChIP试剂盒（Upstate，美国）。SOX2（1:1000，Re-stem Biotech，江苏中国）和正常兔IgG（12-370，Millipore，美国）抗体免疫沉淀交联蛋白-DNA复合物。CD44⁺HeLa细胞1% PFA固定孵育产生DNA-蛋白交联。超声将DNA打断成200-300 bp染色质片段。回收沉淀染色质DNA经RT-qPCR分析。

RNA Pull-Down实验

生物素标记miR-185-3p野生型（WT）和突变型（MUT）质粒（50 nM）分别转染CD44⁺HeLa细胞。转染48小时后特定细胞裂解液（Ambion，美国）裂解细胞。细胞裂解液（50 mL）分装。残余裂解液与预包被RNase-free和酵母tRNA（Sigma）的M-280链霉亲和素磁珠（Sigma，美国）孵育。随后冷裂解液洗涤两次、低盐缓冲液三次、高盐缓冲液一次。拮抗miR-185-3p探针作阴性对照。Trizol提取总RNA，RT-qPCR检测CCAT1水平。

双荧光素酶报告基因实验

利用https://jaspar.genereg.net/预测分析SOX2在CCAT1启动子区潜在结合位点E1、E2。合成含SOX2和CCAT1结合位点E1的CCAT1启动子序列，构建CCAT1 3'UTR WT（E1-WT）和CCAT1 3'UTR MUT（E1-MUT）载体。克隆入pmirGLO（Beyotime）。CCAT1-WT/pmirGLO或CCAT1-MUT/pmirGLO分别与sh-SOX2或sh-SOX2 NC共转染CD44⁺HeLa细胞2天裂解。荧光素酶检测系统（Takara，大连中国）测定荧光素酶活性。

生物信息学网站预测分析CCAT1和miR-185-3p结合位点。双荧光素酶报告基因实验验证CCAT1和miR-185-3p结合位点。构建含miR-185-3p结合位点CCAT1 3'UTR WT和MUT，与mimic NC和miR-185-3p mimics共转染CD44⁺HeLa细胞2天，裂解细胞，荧光素酶检测系统测定活性。相同方法验证miR-185-3p与FOXP3靶向关系。

统计分析

所有数据用SPSS 21.0（IBM，美国）评估。测量数据均值±标准差表示。两组差异用t检验，多组用单因素ANOVA后Tukey多重比较。分类变量用Fisher精确检验。P<0.05视为显著。

结果

CC组织中miR-185-3p表达降低，SOX2、CCAT1、FOXP3表达升高，SOX2和CCAT1表达与肿瘤大小、LNM、FIGO分期相关

检测SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3轴对CC干细胞增殖自我更新影响时，用RT-qPCR和Western blot检测CC组织和邻近正常组织中miR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3表达。结果显示（图1a-c）CC组织中miR-185-3p表达降低，SOX2、CCAT1、FOXP3表达升高。

分析SOX2/CCAT1表达与CC临床病理特征关系（表2）。CC中SOX2和CCAT1过表达与肿瘤大小、LNM、FIGO分期相关，提示肿瘤较大、有LNM、FIGO分期晚期CC患者SOX2和CCAT1表达更高。

CD44⁺HeLa细胞中miR-185-3p表达降低，SOX2、CCAT1、FOXP3表达升高

接着检测人宫颈上皮永生化细胞H8和CC细胞系SiHa、CaSki、HeLa、HCC94、C33A中miR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3表达。结果提示（图2a-c）CC细胞系中miR-185-3p表达降低，SOX2、CCAT1、FOXP3升高。其中HeLa细胞SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3与H8细胞表达差异最大；筛选HeLa细胞分选，悬浮培养获HeLa-SFCs，流式细胞术鉴定分选前后细胞表面CD44表达。结果显示HeLa-SFCs中CD44阳性率显著高于分选前，提示CC干细胞分选成功（图2d）。分选干细胞命名为CD44⁺HeLa细胞。检测HeLa和CD44⁺HeLa细胞中miR-185-3p、SOX2、CCAT1、FOXP3表达（图2e-g）。结果显示CD44⁺HeLa细胞中SOX2、CCAT1、FOXP3表达上调，miR-185-3p下调。

下调SOX2和下调CCAT1抑制CD44⁺HeLa细胞增殖、迁移、侵袭、成球率并促进凋亡

随后在CD44⁺HeLa细胞中沉默SOX2和CCAT1探索其对CC干细胞增殖自我更新影响。CCK-8、流式细胞术、划痕、Transwell、成球实验检测显示（图3a-i），抑制SOX2和CCAT1抑制增殖、迁移、侵袭、成球率，促进凋亡。提示沉默SOX2或CCAT1抑制CC干细胞增殖和自我更新。

耗竭miR-185-3p逆转CCAT1下调在CD44⁺HeLa细胞中的作用

进而考察miR-185-3p是否参与CCAT1调控CC干细胞增殖自我更新过程。CD44⁺HeLa转染miR-185-3p mimic或共转染sh-CCAT1和miR-185-3p inhibitor。结果显示（图4a-i），上调miR-185-3p显著降低增殖、迁移、侵袭、成球率、提高凋亡率。miR-185-3p inhibitor可逆转CCAT1下调对CD44⁺HeLa细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、成球形成作用。

低表达SOX2和低表达CCAT1降低CD44⁺HeLa细胞FOXP3表达、升高miR-185-3p表达

随后检测转染sh-SOX2、sh-CCAT1、miR-185-3p mimic及sh-CCAT1+miR-185-3p inhibitor共转染后CD44⁺HeLa细胞SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3表达。sh-SOX2处理细胞SOX2、CCAT1、FOXP3表达降低，miR-185-3p升高。sh-CCAT1处理细胞CCAT1、FOXP3降低，miR-185-3p升高。miR-185-3p mimic处理细胞miR-185-3p升高、FOXP3降低。sh-CCAT1+miR-185-3p inhibitor连续转染细胞FOXP3升高、miR-185-3p降低（图5a-d）。

SOX2结合CCAT1影响miR-185-3p表达，FOXP3是miR-185-3p靶基因

利用https://jaspar.genereg.net/预测分析CCAT1启动子区转录因子潜在结合位点，显示SOX2和CCAT1在CCAT1启动子区有潜在结合位点（图6a）。ChIP-qPCR显示（图6b）：与IgG组相比，SOX2组在E1结合位点富集更多CCAT1启动子片段，证实SOX2结合CCAT1启动子E1位点，参与CCAT1调控。双荧光素酶报告基因实验显示（图6c）：共转染sh-SOX2和E1-WT细胞荧光素酶活性受抑，表明SOX2可结合CCAT1。

Jefferson网站预测CCAT1可结合miR-185-3p（图6d）。双荧光素酶报告基因实验显示（图6e）：导入miR-185-3p mimic和CCAT1-WT细胞荧光素酶活性降低，提示miR-185-3p可结合CCAT1。RNA pull-down实验验证CCAT1是否结合miR-185-3p。结果显示（图6f）：Bio-miR-185-3p-WT处理细胞CCAT1富集水平显著升高，Bio-miR-185-3p-MUT处理细胞CCAT1富集无显著差异。证明CCAT1可吸附miR-185-3p，从而影响miR-185-3p表达。

Jefferson网站预测miR-185-3p与FOXP3靶向关系（图6g）。双荧光素酶报告基因实验验证（图6h）：FOXP3-WT与miR-185-3p mimic共转染CD44⁺HeLa细胞相对荧光素酶活性显著降低，FOXP3-MUT共转染miR-185-3p mimic不影响活性，提示miR-185-3p靶向FOXP3。

讨论

CC是全球女性第四高发恶性肿瘤，仅次于乳腺癌、结肠癌、肺癌。报道SOX2阳性表达CC细胞表现癌干细胞特征。研究报道CCAT1是CC相关关键致癌lncRNA，促进CC细胞生长侵袭。另一研究揭示miR-185-3p可预测鼻咽癌放射敏感性、调控癌细胞生长凋亡。报道循环抗FOXP3自身抗体反映宫颈病变持续进展，可能是CC早期预后潜在生物标志物。本研究旨在探索SOX2/CCAT1/miR-185-3p/FOXP3轴如何影响CC干细胞增殖自我更新能力。

基于研究发现，SOX2和CCAT1在CC组织细胞中高表达，与肿瘤大小、LNM、晚期FIGO相关。功能验证下调SOX2和CCAT1抑制CC干细胞增殖、迁移、侵袭、成球数、促进凋亡。类似本研究，SOX2表达趋于在CC升高。SOX2在源自癌干细胞CC细胞中也上调。过表达SOX2建议与多种癌症患者临床病理特征相关，不限于CC。如SOX2上调见于FIGO I-II期宫颈鳞癌患者。SOX2表达与口腔鳞癌LNM相关。关于SOX2癌症进展分子功能，观察性工作显示下调SOX-2抑制宫颈鳞癌细胞迁移侵袭。另一研究证实上调SOX2增强CC细胞克隆形成、增殖、成瘤性（体内外优于对照）。

关于SOX2和CCAT1调控关系，现有研究显示沉默SOX2显著降低CCAT1 mRNA水平。关于CCAT1癌症作用，研究显示CCAT1在CC组织中显著高表达于邻近正常组织。值得注意的是CCAT1过表达与CC肿瘤大小正相关。关于CCAT1癌细胞活性作用，研究强调过表达CCAT1加速CC细胞增殖、克隆形成、侵袭。有趣的是前人研究证实敲低CCAT1降低细胞活力、侵袭迁移能力。总之SOX2和CCAT1在其他癌症功能效应与CC相似。

随后研究揭示CCAT1可结合miR-185-3p，下调CCAT1和过表达miR-185-3p抑制CC干细胞增殖自我更新能力。报道CCAT1和miR-185-3p负相关。此外报道放射抵抗鼻咽癌病例miR-185-3p表达降低。关于miR-185-3p抑制癌细胞侵袭性功能，研究显示上调miR-185-3p抑制鼻咽癌细胞侵袭转移特性。Zou等建议恢复miR-185抑制乳腺癌细胞生长侵袭。有文章发现上调miR-185降低非小细胞肺癌细胞体外增殖、侵袭、克隆形成能力。体外增殖、侵袭、迁移及体内肿瘤生长被miR-185过表达抑制于非小细胞肺癌细胞。这些研究中miR-185-3p抗肿瘤角色与本研究一致。

进而揭示miR-185-3p靶向FOXP3，FOXP3作为CC过表达基因调控CC干细胞活性。事实上FOXP3作为结肠癌SOX2癌干细胞标志物调节因子，在CC中被研究显示上调。证实上调FOXP3促进肿瘤球形成、刺激非小细胞肺癌细胞干性。

结论

综上，我们首次探明SOX2转录激活CCAT1，从而抑制miR-185-3p调控FOXP3促进CC干细胞增殖自我更新，为CC治疗提供潜在途径。但本研究仍存在实验样本量相对较小局限，未来可开展临床研究进一步验证治疗CC疗效。

数据与材料可用性

不适用。