普鲁士蓝纳米颗粒标记的间充质干细胞：体外细胞活力、增殖、迁移、分化、细胞骨架和蛋白质表达的评估

背景

间充质干细胞是一种成体干细胞，具有抗炎、再生潜力，可以迁移到受损组织中以帮助受损功能的恢复[1]。它们可以在特定的微环境下分化成多种细胞类型，并且很容易从成人和胎儿组织中收集 [2]。因此，间充质干细胞 (MSC) 由于这些优异的特性而被用作再生医学和肿瘤学治疗的有前途的工具 [3, 4]。然而，移植到体内后 MSC 的命运仍不清楚，在体内非侵入性 MSC 追踪对于评估移植的效率及其命运、特性和定位是必要的 [5]。近来，磁共振成像（MRI）作为一种有效的技术被广泛应用于体外和体内研究间充质干细胞的结构和功能信息[6]。

在过去的几年中，多个纳米粒子被用于标记 MSC，作为一种有前途的细胞非侵入性成像工具，以记录其在体内和体外的分布和命运，甚至用于治疗肿瘤 [7]。例如，超顺磁性氧化铁 (SPIO) 纳米粒子和量子点 (QD) 已被用于标记细胞多年 [8, 9]。并使用荧光磁性纳米粒子（FMNPs）标记MSCs，实现胃癌细胞在体内的靶向成像和协同治疗[10]。对于这些新标签，需要对细胞毒性进行仔细和完整的分析，因为一切都有毒性剂量，可能会干扰下游细胞功能 [11]。例如，MRI造影剂氧化铁纳米颗粒归因于ROS的产生并可能导致细胞死亡[12]。

最近，普鲁士蓝纳米粒子 (PBNPs) 已被证明具有作为 MRI 造影剂的潜力 [13,14,15]。普鲁士蓝被认为是一种实用、经济、安全、环保的药物，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床治疗放射性暴露。重要的是，PBNPs 在水和生物模拟环境（如血清）中具有高度分散性和稳定性，1 周内不会出现聚集现象 [16]，并且具有良好的光热稳定性，可以在实际应用中重复使用 PBNPs [17]。例如，梁等人。 [13]首先证明了在近红外区域具有强吸收的 PBNPs 可以作为一种优秀的造影剂来增强光声成像。可以用低成本的化学试剂通过简单的方法制备尺寸均匀、胶体稳定性好的PBNPs。

PBNPs 已被用于标记一些肿瘤细胞作为研究中的 MRI 试剂 [18]，但关于 PBNPs 在 MSCs 中的应用报道很少。在这里，我们报告 PBNP 标记的间充质干细胞在体外表现出正常的细胞活力、增殖、迁移、细胞骨架、分化和蛋白质表达。如果这在体内成为现实，并确定 PBNP 标记的 MSC 的定向病灶内递送是否与细胞追踪思想一样重要，则需要进一步的工作。

方法

细胞培养

小鼠 MSCs C3H10T1/2 购自南京凯基生物技术有限公司。 Inc. 在补充有 10% 胎牛血清（FBS；以色列）和 1% 青霉素-链霉素（Hyclone，美国）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM；Hyclone，美国）中在 37°C 和 5% CO2 饱和度下培养细胞，每 3 天更换一次培养基。传代4次后用于实验。

PBNP 的制备

在典型的合成中，首先在 60°C 搅拌下将 2.5 mmol 柠檬酸 (490 mg) 添加到 20 mL 1.0 mM FeCl3 水溶液中。在 60°C 下，向该溶液中滴加 20 mL 1.0 mM K4[Fe(CN)6] 水溶液，其中含有 0.5 mmol 柠檬酸 (98 mg)。立即形成清澈的亮蓝色分散体。 30 分钟后，使溶液冷却至室温，同时在室温下继续搅拌 5 分钟。然后，将等体积的乙醇加入到分散体中并以 10,000 rpm 离心 20 分钟，从而形成纳米颗粒颗粒。后者再次加入等体积乙醇离心分离。

PBNP 的表征

使用红外分光光度计 (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10) 测量合成的 PBNP 的红外光谱。通过透射电子显微镜（TEM；JEM 2100F）检查合成的 PBNP 的形态。使用振动样品磁强计 (VSM; Lakeshore 7307) 研究了 PBNP 的场相关磁化。使用 Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD) 进行 X 射线衍射 (XRD) 分析。 PBNPs的多分散指数由Zetasizer Nano ZS测定。

标记的 C3H10T1/2 细胞的 PBNPs 和超微结构的细胞内分布

进行透射电子显微镜 (TEM) 以评估 PBNPs 的细胞内分布。除去培养基后，用PBS冲洗细胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化。然后，将细胞转移到 1.5-mL EP 管中进行离心（2000 rpm，5 分钟）。然后去除上清液，用0.25%戊二醛和1%锇酸固定细胞。再次冲洗细胞后，将细胞分别在 50% 乙醇、70% 乙醇、90% 乙醇、90% 丙酮和 100% 丙酮中脱水 20 分钟。然后，将细胞在 4°C 下嵌入过夜。然后进行3%醋酸铀-柠檬酸双染色切片。最后通过TEM采集图像。

进行扫描电子显微镜 (SEM) 以评估标记的 C3H10T1/2 细胞的超微结构。去除培养基后，用 PBS 冲洗细胞并用 3% 戊二醛预冷 4°C 固定过夜。然后，将细胞用 PBS 冲洗两次并用 1% 锇酸在 4°C 下固定 1 小时。再次冲洗C3H10T1/2细胞后，将细胞在升序酒精（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和100%乙醇）中脱水2 ×每次 10 分钟。然后，将细胞分别浸入 70%、80%、90%、95% 和 100% 的乙腈溶液中 15 分钟。然后，进行真空干燥和金的喷涂。最后，通过扫描电镜采集图像。

PBNPs 的细胞活力分析

使用MTT（Sigma，USA）评估细胞活力。将细胞以1 × 10 ³ 接种于96孔板中 在 37°C 和 5% CO2 气氛下每孔培养细胞。孵育过夜后，将培养基更换为 100 μL 含有不同浓度 PBNP（0、5、10、20、40 和 80 μg/mL）的新鲜培养基，然后再培养细胞 1 至 3 天。去除培养基，并将细胞与 20 μL MTT (5 mg/mL) 在 37°C 下孵育 4 小时。通过轻轻摇动将沉淀的紫色染料晶体溶解在 150 μL 的二甲基亚砜（DMSO；Sigma-Aldrich，USA）中 10 分钟。使用酶标仪在 490 nm 波长处测量光密度 (OD) 值。细胞结果以活细胞百分比表示。

增殖分析

与 MTT、MTS、WST-1 和 XTT 相比，RTCA 允许对整个实验期间进行分析，并且不需要对细胞培养实验产生负面影响的标记 [19]。因此，xCELLigence 系统（Roche/ACEA Biosciences）被用于实时测量细胞增殖。简而言之，将细胞以 5 × 10 ³ 接种到 E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA) 150 μL 完全培养基的每孔细胞。生长 24 小时后，将培养基更换为含有不同浓度 PBNP 的新鲜培养基，并再培养 96 小时。该系统测量电阻抗，这是由细胞附着在微电极集成细胞培养板上 [20] 产生的，以通过 RTCA-DP 仪器实时提供有关细胞数量和活力的定量信息 [21]。在接下来的 4 天内，每 15 分钟定期测量一次细胞增殖。

细胞迁移实时监测

使用实时细胞侵袭和迁移 (RT-CIM) 分析系统 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA) 测量 C3H10T1/2 细胞迁移。由于细胞从上腔室通过膜迁移到下腔室，当细胞接触并粘附到传感器时，细胞具有增加阻抗的能力，因此“细胞指数”读数。简单地说，细胞以 4 × 10 ⁴ 的密度接种在上室 在不同浓度的 PBNP 存在下，每孔在无血清培养基中。 CIM 板的下室装有 165 μL 完全培养基，其中含有 10% FBS。 RTCA DP 仪器每 10 分钟监测一次细胞迁移，持续 100 小时。细胞指数（CI）用于反映结果。 CI 的值源自电阻抗的变化，因为活细胞与微孔板中的生物相容性微电极表面相互作用，以有效测量细胞数量、形状和粘附。迁移的细胞数越多，细胞指数越大。

通过 Transwell 检测进行细胞迁移调查

用不同浓度的PBNPs培养48 h后，细胞密度为2 × 10 ⁶ 细胞/厘米 ² 在 Transwell 室（8 μm 孔径；BD FalconTM，美国）中在 37°C 和 5% CO2 下培养 24 小时。培养后清洁内腔，将内腔底部迁移的细胞固定并用0.1%结晶紫染色。每个步骤之后用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。使用倒置相差显微镜（CK2，Olympus，Japan）在不同视野下对迁移的细胞进行拍照。

体外细胞分化

C3H10T1/2 细胞标记或未标记的 PBNP 被诱导分化为脂肪细胞或骨细胞的两个下游细胞谱系。细胞在六孔板中汇合后，将细胞培养在成骨诱导培养基（10% FBS/DMEM，含有 10 nM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸酯，Sigma）或成脂诱导培养基（10% FBS/DMEM 含有 1 μM 地塞米松、0.5 mM 异丁基甲基黄嘌呤、10 μM 胰岛素，Sigma）。 3 周后，细胞用 PBS 洗涤，用 4% 聚甲醛固定，并用茜素红或油红 O (Sigma) 染色。使用倒置相差显微镜（CK2，Olympus，Japan）在不同视野下对诱导细胞进行拍照。

F-肌动蛋白可视化的免疫荧光分析

MSC 与不同浓度的 PBNP 在 24 孔板中培养 48 小时。细胞用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，用 0.2% Triton-100 透化 5 分钟，用 PBS 中的 1% BSA 在室温下封闭 30 分钟，然后用鬼笔碱（1:100，Thermo Fisher Scientific ，美国）和 DAPI（1:800，Thermo Fisher Scientific，美国）在室温下放置 30 分钟。荧光显微镜在 Nikon eclipse Ti-S 显微镜上使用 NIS 元素软件进行

Western Blot 分析的蛋白质表达

通过蛋白质印迹分析评估细胞的蛋白质表达。将 MSC 用含有不同浓度 PBNP（0、25、50 μg/mL）的培养基在六孔板上培养 24 小时，用冰冷的 PBS 洗涤两次，并在 100 μl PIPA 缓冲液（Beyotime）中刮除蛋白酶抑制剂和原钒酸钠（Beyotime，中国）。 30 分钟后，将样品在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度离心 10 分钟，然后使用 BCA 试剂盒（Beyotime，中国）测定样品的蛋白质浓度。相同量的蛋白质在 10% SDS-PAGE 凝胶（Beyotime，中国）中进行电泳，并转移到 PVDF 膜（GE Healthcare）上。膜在室温下用含有 Tween20 (TBST) 的 Tris 缓冲盐水中的 5% 牛奶封闭 2 小时，然后与抗 β-连环蛋白 (1:1000, CST, USA)、抗波形蛋白 (1:1000 , Abiocode) 和抗 β-肌动蛋白 (1:1000, CST, USA) 在 4 °C 下过夜。将膜洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后与适当的二抗在室温下孵育 2 小时。使用 ECL 和 ECL-plus（Beyotime，中国）检测信号，并使用增强化学发光的 Image Lab™ 软件暴露于 Molecular Image® ChemiDoc™ XRS+ 系统（Bio-Rad Inc.，美国）。

通过 MRI 进行细胞标记效率的细胞成像研究

MSCs 用不同浓度（25 和 50 μg/mL）的 PBNPs 处理，对照细胞用不含 PBNPs 的完全培养基培养 48 h，用 PBS 缓冲液洗涤 3 次，胰蛋白酶消化，收集，然后嵌入 1 mL 1 % (w /v ) 用于成像研究的琼脂糖溶液。此外，用 50 μg/mL PBNP 标记的 MSC 诱导成骨分化 14 天，然后检查 MRI 信号效应。 T2加权成像是使用倒置恢复梯度回波序列进行的，TE =23 ms，TR =400 ms，NEX =2.0，切片厚度2 cm，FOV 20 × 20 cm，矩阵大小384 ×× 256.

统计分析

结果表示为一式三份进行的至少三个独立实验的平均值 ± SD。使用单因素方差分析 (ANOVA) 和 Student t 比较治疗组 测试被使用。 p <0.05 被认为是显着差异。

结果与讨论

PBNP 表征

使用透射电子显微镜 (TEM) 来表征直径为 20-25 nm 的 PBNP（图 1a）。对于形态，PBNPs 显示出立方体结构。图 1b 显示了合成的 PBNP 的红外光谱。 PBNPs表现出典型的Fe ³⁺ 吸收峰 -CN 在 2085.23 nm 附近，这与 PBNPs 一致。场相关磁化测量进一步用于研究 PBNP 的磁性。图 1c 显示了室温下 PBNP 的磁化曲线，这证明了 PBNP 的超顺磁性。图 1d 显示了 200、220、400 和 420 处的衍射峰，这与 PBNP 的 XRD 图案相吻合。此外，PBNPs的多分散指数为0.16，表明粒径分布均匀。

PBNP 表征。 一 PBNP 的形态。 b PBNPs 的紫外可见吸收光谱。 c PBNP 的场相关磁化。 d PBNPs的XRD图

PBNPs 的细胞摄取和细胞毒性

为了进一步证实 PBNP 对 MSC 的细胞摄取，研究了用和不用 PBNP 处理的上述 C3H10T1/2 细胞的细胞微形态。图 2 显示了在使用和不使用 PBNP 孵育 48 小时后 C3H10T1/2 细胞的 SEM 和 TEM 图像。从 SEM 图像来看，与对照 C3H10T1/2 细胞相比，标记的 C3H10T1/2 细胞的超微结构没有明显变化。从 TEM 图像来看，未与 PBNPs 孵育的对照 C3H10T1/2 细胞表现出典型的细胞微形态，具有明显的细胞微结构。然而，在与 PBNPs 孵育后，在 C3H10T1/2 细胞的细胞质中清楚地观察到 PBNPs 的随机分布。一些 PBNPs 似乎位于细胞质内的囊泡中。尽管在 C3H10T1/2 细胞的细胞质中观察到 PBNPs 的随机分布，但细胞内摄取的确切机制尚不清楚。我们提出 C3H10T1/2 细胞中 PBNP 的内化可能通过与先前研究表明的类似机制发生，该研究报告称，包括普鲁士蓝-聚（l-赖氨酸）、金、银和金属氧化物在内的不同无机纳米粒子可以很容易通过内吞作用被细胞吸收 [15, 22, 23]。

C3H10T1/2 细胞与不同浓度的 PBNP 孵育 48 小时后的 SEM 和 TEM 图像。 一 SEM 图像。 b TEM 图像。 ↑，细胞内分布的PBNPs

为了评估 MSC 中的细胞毒性和细胞活力测定，进行了 MTT 方法。将细胞在 37°C 下在 5% CO2 下与悬浮在 DMEM 中的不同浓度的 PBNP 孵育 1 至 3 天。进行了三个独立的试验，并报告了平均值和标准偏差。图 3 显示用 PBNP（5、10、20、40、80 μg/mL）处理的 MSC 在 24 至 72 小时时的生存力分别与对照细胞相关。结果表明，PBNPs对用与MTT相同量的PBNPs处理的细胞无毒。此外，使用 xCELLigence 仪器的实时增殖测定用于研究 MSC 的生长曲线。结果表明，这些 PBNP 浓度对 MSC 的生长曲线没有显着影响（图 4a），并且在处理 24、48、72 和 96 小时后对细胞活力进行计数并显示在图 4b 中。这些结果表明PBNPs对MSCs的增殖没有影响。

MTT法测定C3H10T1/2细胞在不同量PBNPs存在下的活力

通过 RT-CIM 测定法测定的 C3H10T1/2 细胞在不同量的 PBNP 存在下的增殖。 一 C3H10T1/2 细胞的生长曲线。 b C3H10T1/2细胞在24、48、72、96 h处理后的细胞活力

细胞迁移能力

使用 Transwell 测定和新技术 RT-CIM 测定系统测试了用不同浓度的 PBNP 处理的 MSC 的迁移。从 Transwell 分析来看，标记的细胞没有显示出明显的迁移变化。通过使用RT-CIM检测系统，实时监测细胞迁移，反映了更准确的数据，可以更准确地预测细胞迁移能力。从 RT-CIM 分析系统来看，虽然在标记开始时，标记的细胞比未标记的细胞迁移缓慢。但在 72 和 96 小时，标记细胞和未标记细胞之间的细胞迁移没有显着差异，表明高浓度的 PBNP 不影响 MSC 运动（图 5）。

C3H10T1/2 细胞在不同数量的 PBNP 存在下的迁移。 一 RT-CIM 法测定 C3H10T1/2 细胞的迁移。 b C3H10T1/2 细胞在 12、24、48、72 和 96 小时处理后的细胞指数。 c Transwell法测定C3H10T1/2细胞迁移率（放大倍数× 200）

体外细胞分化

通过茜素红和油红 O 染色研究标记和未标记的 MSCs 的多能性。图 6 显示标记的 MSC 可以像未标记的 MSC 一样成功分化为脂肪细胞和骨细胞。这些结果表明PBNPs没有干扰细胞的分化能力，保持了标记MSCs的多能性。

具有或不具有 PBNPs 的细胞的体外细胞分化。脂肪细胞油红 O 染色和骨细胞茜素红染色。标记后 3 周获得图像（放大倍数 × 200）

标记 PBNPs 对细胞骨架的影响

为了研究 PBNPs 对 MSCs 细胞骨架的影响，使用了 F-肌动蛋白的免疫荧光测定。与未标记的 MSC 相比，鬼笔环肽染色显示标记 48 小时后细胞骨架的红色肌动蛋白丝没有改变。 48 小时内标记和未标记细胞中肌动蛋白丝的完整性和分布的比较显示没有变化（图 7）。

C3H10T1/2 细胞在不同量的 PBNP 存在下的免疫荧光 48 小时（放大倍数 × 400）。 ↑，细胞骨架

Western Blot 分析

Wnt 信号通路在调节细胞增殖、分化、凋亡、组织形成和干细胞命运中发挥重要作用 [24]。因此，β-catenin 是 MSCs 的功能蛋白。此外，波形蛋白是间充质生物标志物，也是 MSCs 的功能蛋白 [25]。这两种蛋白质与间充质干细胞的生物学功能有关。通过蛋白质印迹分析评估β-连环蛋白和波形蛋白的表达。图8显示，与未用PBNP处理的MSC的表达相比，用不同浓度的PBNP处理48小时的MSC的β-连环蛋白和波形蛋白的表达没有显着变化。这些结果表明PBNPs不能改变MSCs中β-catenin和vimentin的表达，说明PBNPs处理后MSCs的生物学功能稳定。

蛋白质印迹显示了用和不用 PBNP 处理 48 小时的 MSC 的 β-连环蛋白和波形蛋白的表达。 ImageJ软件定量β-catenin和vimentin水平

体外 MRI

与其他干细胞一样，MSCs 具有分化骨骼、软骨、脂肪、肌肉和心脏细胞的潜力，这些细胞已成为再生医学的重要来源。跟踪 MSCs 的迁移和结果对于评估外源性 MSCs 在缺陷修复中的作用和结果非常重要。磁共振成像（MRI）有助于临床给药后观察MSCs，MRI造影剂是必要的。 PBNPs 用作有效的 T2 加权细胞 MRI 造影剂的潜力已被证明 [14]，其他一些研究也表明 PBNPs 的表面改性增强了其在 MRI 中的性能 [17, 26]。目前，PBNP 标记已用于多种细胞。杜蒙等人。描述 PBNPs 作为 MRI 和基于荧光的儿科脑肿瘤成像的药物 [27]；佩雷拉等人。开发了掺钆的 PBNP，用于胃肠道肿瘤的早期检测 [28]；和 Cano-Mejia 等人。将基于普鲁士蓝纳米颗粒 (PBNP) 的光热疗法 (PTT) 与抗 CTLA-4 检查点抑制相结合来治疗神经母细胞瘤 [29]。然而，关于 PBNP 标记的 MSCs 的相关报道很少。此外，标记PBNPs后是否对MSCs的细胞功能和活力有负面影响尚不清楚

为了研究 PBNP 是否具有增强细胞 T2 加权 MRI 对比度的能力，我们在有或没有 PBNP 的情况下培养了 MSC，并检查了 MRI 信号效应。为了监测标记的时间稳定性并研究当 MSC 分化时 PBNP 是否会失去其成像能力，我们将 MSC 与 PBNP 一起孵育并诱导 MSC 向成骨分化 14 天，然后检查 MRI 信号效应。如图 9 所示，与 PBNPs 孵育的 MSCs 颗粒显示出明显的 MRI 信号变暗效果，标记的 MSCs 的 SI 值与未标记的 MSCs 有明显差异。值得注意的是，标记的 MSC 在诱导分化时也显示出明显的 MRI 信号变暗效应。这些结果表明，PBNPs具有作为MSCs细胞成像的有效T2造影剂的潜力，并且即使在细胞分化后也能长期保留造影剂。

MSC 的 T2 加权 MRI 幻影。 一 横断面。 b SI值的定量分析。 **P <0.001 vs 对照

有许多已发表的用磁性纳米粒子 (MNPs) 标记的 MSCs 的数据，但 MNPs 的应用受到其细胞毒性的限制。在将 MNPs 递送至靶组织时，大部分 MNPs 常分布于肝脏和脾脏，因此 MNPs 的毒性不容忽视 [30]。例如，Costa C 发现 SPION 可以对神经元细胞和神经胶质细胞产生细胞毒性 [31]。正如我们上面提到的，PBNP 没有显示出可检测到的细胞毒性，并且对 MSC 的细胞特征（包括细胞骨架、细胞形态和功能蛋白）没有影响。因此，将在细胞毒性方面证明使用 PBNP 作为有效的 T2 加权细胞 MRI 造影剂的优势。

结论

总之，我们将 PBNPs 引入到间充质干细胞的追踪中，并研究了 PBNPs 标记后 MSCs 的存活、迁移潜力和细胞特性。此外，我们还证明了 PBNP 作为 MSC 细胞 MRI 的有效 T2 加权 MRI 造影剂的潜力。 PBNPs可以有效地用于MSCs的标记，并且不会影响MSCs的生物学特性。这一结论为MSCs的标记开辟了新的道路。

缩写

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

DMSO：

二甲亚砜

FBS：

胎牛血清

MRI：

磁共振成像

MSC：

间充质干细胞

近红外：

近红外

OD：

光密度

PBNP：

普鲁士蓝纳米颗粒

TEM：

透射电子显微镜

VSM：

振动样品磁力计