基于原子力显微镜的软骨分化人类脂肪干细胞纳米显微镜：纳米结构和整合素 β1 表达

背景

骨关节炎 (OA) 是老年人常见的退行性关节疾病 [1]，退行性 OA 的特征是关节软骨的进行性破坏。软骨高度有组织，没有血管、神经或淋巴组织 [2]。细胞外基质 (ECM) 主要由胶原蛋白 II 和糖蛋白组成，对软骨稳态非常重要。由于软骨是无血管的，其自我更新的能力是有限的。尽管 OA 治疗（手术和非手术）可以快速缓解 OA 患者的症状，尤其是疼痛，但它们无法恢复关节软骨的正常结构和功能 [3]。未来，治疗可能包括使用干细胞和支架的组织工程来修复缺陷和退行性关节软骨 [4]。间充质干细胞是多能基质细胞，具有成骨、成脂、成软骨和生肌潜能，取决于生长因子组合 [5]。间充质干细胞分化分析表明，Wnt/β-catenin、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR)、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K) 和其他途径在分化中发挥重要作用 [6,7,8]。然而，诱导软骨分化的潜在机制仍然难以捉摸。对于细胞外信号激活细胞内信号通路的机制尤其如此。我们发现整联蛋白 β1 在软骨分化过程中发生变化。因此，我们假设整合素 β1 可能在人脂肪干细胞 (hADSc) 软骨形成分化中发挥重要作用，因为它参与了各种组织分化信号通路。本次研究的重点是Wnt/β-catenin信号通路。

大量研究表明，细胞与细胞外环境之间的相互作用受跨膜蛋白，特别是整联蛋白家族成员的调节 [9]。整联蛋白由非共价键合的 α 和 β 链的异二聚体跨膜糖蛋白组成 [10]。理论上，有 64 种已知的整联蛋白，其中仅发现了 24 种。整联蛋白在细胞-细胞粘附、ECM-细胞粘附、细胞信号传导和肌动蛋白细胞骨架的组织中起着至关重要的作用 [11]。 ECM 在组织稳态中起着重要作用，ECM 调节整合素。整合素介导许多基本过程，包括细胞粘附、迁移、增殖、分化、细胞死亡、伤口修复、组织发育和器官发生。在间充质干细胞软骨分化过程中，整合素 β1 的表达与 SOX 信号通路和胶原蛋白 II 相关。本研究的重点是整合素 β1 二聚体，因为它是软骨异源二聚体中最突出的 β 二聚体，并且已知与许多不同的 α 二聚体相互作用 [12]。分化簇29（CD29）是一种整合素β1亚基，与极晚期抗原受体相关，几乎在所有细胞和组织类型上都有表达。

在这里，原子力显微镜 (AFM) 用于帮助我们测量 hADSc ​​软骨分化过程中的变化。作为一种分辨率非常高的扫描探针显微镜，AFM 为在纳米级检测流体中单个细胞的形态和细胞膜提供了新的机会。同时，结合原子力显微镜（AFM）的单分子力谱（SMFS）系统用于测量活细胞上的配体-受体结合。 SMFS系统对细胞膜受体的变化更为敏感，结合力图像可视化。在这项工作中，整合素 β1 功能化的 AFM 尖端探测了整合素 β1 配体 - 受体的结合。应用原子力显微镜，发现软骨分化可改变 hADSc ​​细胞形状并增加细胞粗糙度。该应用提供了一种通过直接测量整合素 β1 配体-受体相互作用和细胞表面超微结构改变来评估软骨分化的方法，以可视化方式改进细胞表面研究和筛选。软骨分化改变膜的组成和结构，以及细胞内细胞骨架的相互作用。这些细胞形态、超微结构和配体-跨膜受体结合的变化可作为评估软骨分化机制的有用标志物。

方法

细胞培养和试剂

在本研究中，如前所述 [13] 从三名手术患者（平均年龄 20 岁）中分离细胞。从所有患者获得知情同意。本研究的伦理批准获得暨南大学第一附属医院（补充表）。将细胞维持在基础培养基中，其中包括低葡萄糖 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基（DMEM，Life Technologies，CA，USA），辅以 10% 热灭活胎牛血清（FBS，Life Technologies，CA，USA），100 单位/ ml 青霉素（Life Technologies，CA，USA）、100 μg/ml 链霉素（Life Technologies，CA，USA）、0.11 mg/ml 丙酮酸钠（Life Technologies，CA，USA）和 L-谷氨酰胺（Life Technologies，CA，美国）。细胞在含有 5% CO2 的加湿培养箱中保持在 37°C，每 3 天更换一次培养基。

体外分化

对于软骨形成诱导，第四至第八代 hADSc ​​以高细胞密度（2 × 105/10 毫升）接种，并在含有 DMEM/F12 的软骨形成培养基中培养，并辅以 1% FBS、1% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ ITS) + 补充剂（Cyagen，广州，中国），10 ng/ml 转化生长因子-β1 (TGF-β1)（Peprotech，Rocky Hill，New Jersey，USA），100 ng/ml 胰岛素样生长因子-1（ IGF-1)（Peprotech, Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, USA）、10-7 M 地塞米松（Sigma, St. Louis, MO, USA）和 50 μg/ml 抗坏血酸（Sigma, St. Louis, MO） ， 美国）。每 2 天更换一次培养基，新加入 TGF-β1 和 IGF-1。阿尔新蓝和甲苯胺蓝染色评估软骨形成。

为了诱导成骨和成脂分化，第四代至第八代细胞分别用成骨和成脂培养基处理 2 周。成骨培养基由补充有 10-7 M 地塞米松（Sigma，St. Louis，MO，USA）、50 μg/ml 抗坏血酸（Sigma，St. Louis，MO，USA）和 10 mmol/l β-甘油的 DMEM 组成磷酸盐（Sigma，St. Louis，MO，USA）。茜素红染色评估成骨作用。

脂肪生成培养基由补充有 0.5 mmol/l 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (Sigma, St. Louis, MO, USA)、1 μmol/l 氢化可的松 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 的 DMEM 组成， 0.1 mmol/l 吲哚美辛（Sigma, St. Louis, MO, USA）。油红O染色评价成脂分化。

通过流式细胞术鉴定 hADSc ​​表面抗原

hADSCs 用胰蛋白酶消化，然后用 DMEM 冲洗两次，然后重新悬浮，细胞密度为 2 × 10 ⁷ 细胞/毫升。细胞悬液 (50 μl; 1 × 10 ⁶ 细胞）加入 1.5 ml 环氧环氧化物管中，然后与抗 CD34、抗 CD44、抗 CD45、抗 CD73、抗 CD90、抗 CD106、抗 HLA-DR 和抗 CD105 抗体一起孵育在 37°C 下避光 20 分钟。抗 CD34、抗 CD44 和抗 CD45 购自 CST (Beverly, MA, USA)；其他抗体获自 Abcam（剑桥，马萨诸塞州，美国）。然后，将细胞悬液以× 500g离心 5 分钟，然后去除上清液并将细胞重新悬浮在 200 μl 染色缓冲液中。在流式细胞术分析之前，所有步骤重复两次。

免疫印迹分析 (IB)

如前所述收集细胞用于免疫印迹[14]。所用的一抗是抗 β-连环蛋白 (ab32572)、抗整合素 β1 (ab30394) 和抗胶原蛋白 II (ab34712)，从 Abcam (Cambridge, MA, USA) 获得。抗 β-肌动蛋白 (8H10D10, 1:2000)、抗 GSK-3β (27C10, 1:1000) 和抗 SOX (92G2, 1:1000) 从 Cell Signaling Technology (CST, Beverly, MA,美国）。 HRP 偶联二抗 (1:1000–1:3000) 购自 CST。

免疫荧光

对于软骨分化，将细胞处理 0、6 和 12 天，消化并在 24 孔板（Costar353047，Corning，New York，USA）的玻璃上培养 24 小时。细胞用冰冷的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 洗涤两次，在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。封闭后，将细胞与与整联蛋白 β1 反应的一抗孵育 1 小时，然后与 Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠 IgG（H + L）（CST #4408，MA，USA）一起在黑暗中孵育 1 小时), 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI, Sigma, MO, USA)。对于鬼笔环肽染色，封闭后，将细胞用 0.2% Triton X-100 透化 30 分钟，然后将细胞与 DAPI 和鬼笔环肽-Alexa Flour 573（Life Technologies，CA，USA）一起孵育 1 小时。洗涤3次后，用激光扫描共聚焦显微镜（ZEISS，LSM 700，Oberkochen，Germany）评估软骨分化过程中整合素β1的亚细胞定位和丝状肌动蛋白（F-actin）的变化。

AFM 技巧准备

具有弹簧常数 (0.06 N/m) 的 Si3N4 尖端 (DNP-10, Bruker Corp) 被抗 CD29 抗体化学修饰如下 [15]。吸头用丙酮、紫外线和食人鱼溶液（H2SO4:H2O2 =3:1，v /v ) 不同的时间（5 分钟、30 分钟和 10 分钟）。用纯净水彻底冲洗后，通过与 1% 3-APTES（Sigma，St. Louis，MO，USA）的乙醇溶液一起孵育 30 分钟形成吸头。吸头用超纯水洗涤 3 次，并用 2.5% 戊二醛（Sigma，St. Louis，MO，USA）溶液处理 1 小时。多余的戊二醛用水洗涤3次。最后，将吸头插入抗整合素 β1 溶液 (1 mg/ml) 中，并在 4°C 下孵育过夜。修饰后的探针在实验前用PBS洗涤。

AFM 测量

AFM（Bioscope Catalyst，Bruker，USA）用于研究软骨分化过程中的 hADSc ​​形态和超微结构变化。在 PBS 中测量 AFM 尖端的精确力常数。为了评估形态和超微结构，用 PBS 洗涤细胞数次。然后，将 4% 多聚甲醛溶液加入到 3.5 cm ² 培养皿 15 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，将细胞储存在 4°C 的 PBS 中备用。在接触模式下，尖端的弹簧常数范围为 4.2 到 5.8 N/m。 hADSc ​​的形态学和超微结构图像是在室温下通过 AFM 在 PBS 中拍摄的。 hADSc ​​细胞核周围的超微结构图像是在接触模式下获得的。 Nanooscope 分析软件用于评估（第 0、6、12 天）组中至少 15 个不同细胞的超过 15 个不同 10 × 10 μm 图像的细胞表面超微结构。在不同的软骨形成时期（0、6 和 12 天）分析了整合素 β1 修饰的 AFM 尖端和活 hADSc ​​的 CD29 受体之间的结合力。在AFM系统（Bioscope Catalyst，Bruker，USA）的接近-收缩模式下测量结合力。为了研究整合素 β1 - 活细胞分离事件，整合素 β1 抗体修饰的尖端以 500 nm/s 的进退速度使用。功能化尖端的力常数为 0.058 ± 0.006 N/m。细胞上的阈值力为 800 pN。在力测量实验之前，将抗整联蛋白 β1 抗体 (100 μg/ml) 添加到细胞中 30 分钟。整合素 β1 阻断和裸探针也用作对照，以检测整合素 β1 抗体修饰的尖端和细胞之间的非特异性破裂力。为了量化整合素 β1 配体-受体结合概率，通过整合素 β1 抗体功能化探针测量特异性相互作用力曲线。在一次实验中测量了超过 400 条力曲线，结果总结自至少三个独立实验。因此，在每个比较实验中，使用仪器的 Nanoscope 分析软件从 30-40 个不同的细胞中获得了大约 1200 条原始力-距离曲线。通过对至少三个独立实验的力值求平均值，确定了软骨形成诱导对整合素β1配体和细胞表面CD29受体之间相互作用力的影响。

逆转录和实时 PCR

使用 TRIzol® Plus RNA 纯化试剂盒（Life Technologies，CA，USA），并使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒（Invitrogen）根据制造商的方案稍作修改，将 1 μg RNA 逆转录为 cDNA。使用 qRT-PCR 和基因特异性引物对整合素 β1 和 GAPDH 进行定量：5'-TGGAGGAAATGGTGTTTGC-3'（整合素 β1-有义）和 5'-CGTTGCTGGCTTCACAAGTA-3'（整合素 β1-反义）； 5'-CTGACTTCAACAGCGACACC-3' (GAPDH-sense) 和 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCAAAT-3' (GAPDH-反义)。对于实时 PCR，第一步实时 PCR（Applied Biosystems）使用 Fast SYBR@GREEN Master Mix（Life Technologies，CA，USA）进行。将目标基因表达标准化为 GAPDH 作为内标，并使用比较 2-ΔΔCT 方法计算。每个测定一式三份进行。

统计分析

所有实验至少进行 3 次，数据表示为平均值 ± 标准偏差 (SD)。通过t进行两组比较 测试。组平均值之间的显着差异通过单向方差分析确定，然后是 Bonferroni 和 Tamhane 的 T2 检验（不假设方差相等）。 p 的值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

hADSc ​​评估

间充质干细胞是多能基质细胞，具有成骨、成脂、成软骨和生肌潜能。有两种主要的方法可以识别 hADSc，即细胞表面 CD 标记物和分化能力 [16]。如附加文件 1：图 S1 和附加文件 2：图 S2 所示，衍生细胞是 hADSc。然后，通过 MTT 测定法测定第 3 代 hADSc ​​的细胞增殖（附加文件 3：图 S3）。

hADSc ​​软骨形成过程中诱导的形态和表面超微结构变化

AFM 总是用于检测纳米级的细胞形态和超微结构 [17]。细胞的形状与其特化的细胞功能和组织组织有关。在一些癌症研究中，AFM 可以作为一种高成像技术来分析形态变化以评估药物效果。此外，间充质干细胞形状在软骨形成诱导过程中发生变化 [18]。虽然细胞形状的变化似乎是分化所必需的，但关于细胞形态是否影响间充质干细胞分化的早期发育阶段知之甚少。因此，通过 AFM 评估 hADSc ​​软骨形成过程中的形态和膜超微结构变化，因为这些变化很重要 [19] 并且可以直接影响细胞的功能 [20]。在不同时间段的软骨分化过程中研究了 hADSc ​​的表面形态和超细结构（图 1 和图 2）。各对照组的形态和表面超微结构明显不同。在第 0 天，细胞呈细长的纺锤形，表面相对光滑。细胞膜结构是同质的。软骨诱导后，在第 6 天和第 12 天，观察到显着的细胞形态变化。大多数细胞逐渐收缩成多边形（图 1a），在软骨分化过程中平均细胞长宽比降低（图 1b）。大量研究表明，细胞形态的变化与细胞的细胞骨架一致[21]。我们还发现了软骨分化过程中细胞骨架的变化，这在后面的结果中得到了解释。

软骨形成过程中 hADSc ​​形态的特征。 一 在软骨分化的第 0、6 和 12 天获得整个 hADSc ​​的形态学图像。通过 Nanoscope 的高度和峰值力误差图像模型分析图像。 b 在第 0、6 和 12 天进行软骨分化处理后测量细胞的平均长宽比。 *p <0.05, **p <0.01

hADSc ​​膜超微结构在​​软骨分化过程中的特征。 一 在软骨分化 0、6 和 12 天后评估细胞膜超微结构的变化。 b 在 hADSc ​​软骨诱导 0、6 和 12 天期间测量细胞的表面粗糙度参数 Ra 和 Rq

如图 2a 所示，细胞膜超微结构也发生了变化；颗粒变大且不均匀。先前的研究表明，Ra 和 Rq 是粗糙度值的制定者，用于评估不同处理的细胞膜的变化 [22]。 Rq 是关于均方根粗糙度，\( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{t-1}^N{\left( Zn-\overline{Z}\right)}^2 {N-1}} \); \( \mathrm{Rq}=\sqrt{\frac{\sum_{\mathrm{t}-1}^{\mathrm{N}}{\left(\mathrm{Zn}-\overline{\mathrm{Z }}\right)}^2}{\mathrm{N}-1}}; \) Ra 大约是平均粗糙度，\( \mathrm{Ra}=\frac{1}{N}{\sum}_{ t-1}^N1\mid Zi-\overline{Z}\mid \)。为了获得粗糙度，扫描尺寸为 10 μm × 10 μm。如图 2b 所示，在 hADSc ​​的软骨形成过程中，两个不同区域的 Ra 和 Rq 均增加。第 0 天细胞的 Ra 和 Rq 值较低，表明表面光滑（图 2b）。 Ra 和 Rq 的值随着软骨形成分化同时增加，显示出更大的异质性和细胞表面更粗糙（图 2a）。根据观察到的变化，软骨分化导致细胞形态和细胞高/宽比的变化（图 1a、b）。有研究表明ECM可以通过调节整合素来调节细胞粘附[11]。因此，增加的粗糙度值表明在软骨形成过程中 ECM 和细胞膜的超微结构发生了变化。这些数据表明软骨分化会影响细胞形态、细胞外基质和细胞膜结构。

hADSc ​​软骨形成过程中的细胞骨架变化

在干细胞分化过程中，细胞形态和膜结构的变化与细胞的细胞骨架有关，继而产生谱系特异性细胞特征[21]。如图 3a 所示，红色和蓝色荧光信号分别表示 F-肌动蛋白和 DAPI。在图 3a 中的软骨诱导过程中，细胞骨架发生了很大变化。一方面，在第 0 天组细胞骨架微丝沿细胞长轴排列，而当 hADSc ​​用软骨分化处理 12 天时，细胞骨架微丝呈放射状排列。另一方面，第0天组细胞微丝分布均匀，但微丝主要分布在软骨分化12天后hADSc的外周。

细胞骨架的组织和整合素 β1 在软骨分化 hADSc ​​上的位置。 一 通过共聚焦显微镜在 hADSc ​​的软骨形成过程中检测到细胞骨架的变化。 b 通过共聚焦显微镜在软骨分化过程中测量整合素 β1 的位置。细胞骨架和细胞核分别用 F-肌动蛋白和 DAPI 染色。红色和蓝色荧光信号分别表示 F-actin 和 DAPI

软骨分化改变了整合素 β1 与 hADSc ​​受体的结合概率

AFM也是研究配体与其受体结合力的有用工具，使细胞表面的膜受体信号转导清晰[23]。通过 AFM，整合素 β1 与其受体之间的变化以直观、简单和特定的方式进行测量。整合素β1配体-受体在活细胞上的相互作用是探索细胞膜结合过程的一种方式。 AFM 尖端功能化的过程是通过连接 APTES 和戊二醛将整合素 β1 耦合到 AFM 尖端。这些提示用于检测整联蛋白 β1 与细胞表面 CD29 受体的结合（图 4a）。单分子力谱（SMFS）用于评估个体活 hADSc ​​局部区域内的抗整合素 β1 活细胞分离力分布（图 4b）。代表性的力曲线如图 4c、d 所示，其描绘了单分子曲线（图 4c）和两对断裂峰值曲线（图 4d）。进行阻塞实验和裸 AFM 尖端实验以验证获得的力曲线的特异性。裸 AFM 针尖没有检测到特定的力峰值（图 4e）。裸 AFM 实验表明，hADSc ​​表面整合素 β1 配体-受体相互作用的非特异性结合概率小于 1%。对于封闭实验，将抗整合素 β1 抗体与细胞一起孵育 30 分钟，然后使用整合素 β1 功能化的尖端记录力曲线。阻断抗体将力曲线降低了 90%（图 4f）。在抗整合素 β1 抗体处理后，三组之间整合素 β1 配体 - 受体在细胞表面的结合概率没有差异（图 4g）。这些结果表明，抗体修饰的 AFM 尖端对于检测力非常有用，并且整合素 β1 功能化的 AFM 尖端具有特异性。

使用整合素 β1 功能化 AFM 尖端对活体 hADSc ​​进行 AFM 力测量。 一 用于将整合素 β1 固定到 AFM 尖端的策略的示意图。 b 在整合素 β1 功能化的 AFM 尖端和活的 hADSc ​​之间测量的单分子力的示意图。 c, d 使用整合素 β1 修饰的 AFM 尖端在 hADSc ​​和 e 上获得的代表性力曲线 系统用整合素β1单克隆抗体溶液封闭后。 f 整合素 β1 功能化提示在第 0 天被整合素 β1 抗体阻断前后 hADSc ​​上的结合概率。g 在第 0、6 和 12 天被整合素 β1 抗体阻断后，CD29 功能化尖端在 hADSc ​​上的结合概率。 ***p <0.001, n.s. 无显着差异

结合力（破裂力）是配体与其受体之间的相互作用力[24]。质膜形态和表面超微结构的变化与细胞生物学的许多过程有关，如分化、凋亡和细胞迁移。在分化过程中，细胞骨架的变化被认为与整合素的变化有关，尤其是整合素β1。整合素 β1 (CD29) 在细胞与 ECM 的粘附和细胞间粘附中非常重要。它还可以与细胞内蛋白质相互作用，刺激与肌动蛋白细胞骨架相关的信号分子 [25]。在这项研究中，通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 和 AFM 观察了 hADSc ​​软骨形成过程中细胞骨架和细胞形态的变化。在软骨分化过程中，细胞骨架、形态和表面超微结构的变化可能是细胞状态的一个新的可靠指标。根据免疫荧光判断，整合素 β1（CD29 受体）分布在细胞表面（图 3b）。在分化的第 0、6 和 12 天评估了 hADSc ​​软骨形成过程中整联蛋白 β1 配体-受体复合物的结合强度和稳定性。每天总共记录 1200 条曲线，平均破裂力分别为 61.8 ± 22.2 pN、60 ± 20.2 pN 和 67.2 ± 22.0 pN（图 5a-c）。力大小的分布被分析为力平均值+ SD（图 5d）。第 0 天和第 6 天的力平均值没有显着差异。第 0 天和第 12 天的力平均值存在差异。结合力的大小在第 12 天增加。同时，第 0、6 和 12 天的破裂事件分别为 19.58 ± 1.74%、28.03 ± 2.05% 和 33.4 ± 1.89%（图 5e）。增加的结合概率也表明整合素 β1 (CD29) 在软骨分化中发挥重要作用，并可能通过信号通路为软骨分化提供信息。因此，在软骨分化过程中增加的整合素 β1 纳米域可能从根本上影响 CD29 配体 - 受体对活 hADSc ​​的结合强度。质膜形态和表面超微结构的变化伴随着整合素β1蛋白结构、构象、结合强度和细胞上整合素β1配体-受体复合物稳定性的变化。综上所述，整合素β1在hADSc成软骨分化过程中具有重要作用。

通过整合素 β1 功能化的 AFM 尖端在活体 hADSc ​​表面测量的结合力和结合概率。 a–c 在 hADSc ​​软骨形成分化 0、6 和 12 天期间获得的整合素 β1 抗体-受体结合力的直方图。 d 在 hADSc ​​软骨分化的第 0、6 和 12 天获得了整合素 β1 受体的结合力。 e 在 hADSc ​​的软骨分化过程中检测了 0、6 和 12 天整合素 β1 受体的结合概率。 *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001，n.s.无显着差异

hADSc ​​软骨分化过程中整合素 β1 的上调

大量研究表明，整合素家族成员在细胞分化中起重要作用。此外，整合素可以调节细胞外环境和细胞之间的相互作用，通过连接的蛋白质控制信号转导通路 [26]。先前的研究表明，结合概率会受到细胞表面跨膜蛋白（受体）的密度和构象的影响 [27]。整合素构象可以是对配体具有低亲和力的封闭式头盔，也可以是对配体具有高亲和力的开放式头盔 [28, 29]。整合素 β1 的表达在转录和翻译水平上均上调，胶原蛋白 II 表达增加，这是软骨细胞的特征（图 6a、b）。因此，无论构象如何，整合素β1表达的上调都与结合概率的增加一致。

The role of integrin β1 and β-catenin/SOX pathway in regulating hADSc chondrogenic differentiation. 一 Protein integrin β1 was up-regulated during chondrogenesis of hADSc as assessed by western blotting. Cartilage differentiation up-regulated collagen II expression at different days. b The mRNA of integrin β1 was up-regulated during chondrogenic differentiation of hADSc. c Measurement of proteins associated with the β-catenin/SOX pathway during chondrogenic differentiation of hADSc for 0, 6, and 12 days. *p  < 0.05, **p <0.01

The Role of Integrin β1 in Chondrogenic Differentiation Regulated by the β-catenin/SOX Signaling Pathway

Previous studies have shown Wnt/β-catenin, PI3K, and mTOR signaling pathways to be related to integrin β1 [30,31,32]. Each is important in mesenchymal stem cell differentiation. Likewise, studies have demonstrated SOX and collagen II to be regulated by integrin β1 during chondrogenesis of hADSc. SOX is a hallmark component of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Hence, we hypothesized that chondrogenic differentiation was regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1. SOX, GSK-3β, β-catenin, and integrin β1 were all increased during chondrogenesis of hADSc (Fig. 6c), with integrin β1 inducing cell signaling. These data demonstrate chondrogenic differentiation to be regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1.

Prospective and Limitations

In this work, changes in cellular morphology, the structure of the membrane, and the binding probability of integrin β1 ligand–receptors were demonstrated to be useful image markers to evaluate the chondrogenic differentiation process. This is a new method for evaluation of morphology, membrane ultrastructure, and changes in transmembrane proteins during chondrogenic differentiation.这项研究存在局限性。 Although increased binding probability was related to the high expression of integrin β1, the conformation of integrin β1 during chondrogenesis was not investigated. Further work is necessary to determine the conformation of integrin β1 during chondrogenic differentiation. Integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway during chondrogenesis of hADSc. However, the relationship between integrin β1 and β-catenin/SOX signaling pathway is still not fully established. Further work is necessary to identify the exact role of integrin β1 in this pathway.

Conclusions

In the present work, a novel method (AFM) was employed to evaluate chondrogenic induction in hADSc. Cell surface ultrastructural changes were assessed by AFM imaging. AFM was used to investigate the binding force and binding probability between integrin β1 ligand and its receptors on the surface of hADSc by integrin β1-functionalized AFM tips. Based on AFM data, during chondrogenesis, cell morphology was changed from an elongated spindle shape to a polygonal shape with increased cell roughness. By use of integrin β1-functionalized AFM tips, the binding probability and force magnitude of integrin β1 ligand–receptor on the surface of hADSc were found to increase during chondrogenic induction. By immunoblot, integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway, which regulated the chondrogenesis of hADSc. Taken together, these results and the established methodology contribute to a better understanding of cell morphology and roughness. Further, the data provide thermodynamic and kinetic insight into the integrin β1 ligand-binding process, at the single-molecule level. This AFM method will be useful for investigation of signaling pathways in living hADSc during chondrogenesis. Changes in the cellular nanostructure, as well as structure of the membrane, and the binding probability of transmembrane proteins are useful markers to evaluate chondrogenic differentiation mechanisms. This AFM method can be used to understand the mechanism of mesenchymal stem cell differentiation in tissue engineering and will be useful for an enhanced understanding of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation.

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

CD:

Cluster of differentiation

DAPI:

4′,6-diamidino-2-phenylindole

DMEM：

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

ECM：

细胞外基质

F-actin:

Filamentous actin

FBS：

胎牛血清

hADSc:

Human adipose-deprived stem cells

IB:

Immunoblotting analysis

IBMX:

3-isobutyl-1-methylxanthine

IGF-1:

Insulin-like growth factors-1

ITS:

Insulin transferrin selenium

mTOR:

Mammalian target of rapamycin

OA：

Osteoarthritis

PBS：

Phosphate buffer solution

PI3K:

Phosphoinositide 3-kinase

标准差：

标准差

SMFS:

Single-molecule force spectroscopy

TGF-β1:

Transforming growth factor-beta1