⁶⁴Cu标记AGuIX纳米探针：PET引导放疗与HepG2肿瘤小鼠模型中的放射增敏

摘要

肝癌放疗受限于肝脏对电离辐射的低耐受性，使放射增敏剂成为降低所需剂量的关键。AGuIX纳米颗粒——超小、钆基载体——独特适合递送放射性同位素或荧光团用于SPECT、PET、荧光成像和多模态成像，其高原子序数亦赋予肿瘤增敏特性。理解其生物分布和药代动力学对量化放疗期间肿瘤保留至关重要。本研究利用其内在DOTA螯合剂高效用⁶⁴Cu标记AGuIX。生物分布数据显示⁶⁴Cu-AGuIX在裸鼠HepG2异种移植瘤中显著富集，表明其作为肝细胞癌（HCC）影像引导放疗诊疗一体化探针的前景。透射电镜确认纳米颗粒进入HepG2细胞。辐射实验显示，AGuIX注射1 h后照射的肿瘤中¹⁸F-FDG摄取显著降低，概念验证了AGuIX作为肝癌放疗的PET可见放射增敏剂功能。

背景

肝细胞癌（HCC）位居全球常见恶性肿瘤前列，2012年新发782,500例、死亡745,500例，其中70-90%为HCC。多数患者确诊时已属晚期，仅20-25%病例有根治机会。因此放疗成为HCC多学科治疗的关键组成。然而，正常肝组织限制剂量升级，辐射性肝病（RILD）风险严重。优先在肿瘤组织富集的放射增敏剂可在较低剂量下增加肿瘤细胞杀伤，从而减轻正常组织毒性。

AGuIX是一种新型钆基纳米颗粒（~5 nm直径），2013年首次报道，快速经肾清除，可功能化放射性或荧光标记用于SPECT、PET、MRI或荧光成像。高钆含量赋予AGuIX肿瘤增敏能力，在多种细胞系体外实验中显示增敏增强比（SER）为1.1-2.5。因AGuIX肝脏背景低却因增强渗透与滞留（EPR）效应显示高肿瘤摄取，成为HCC放射增敏的有吸引力候选者。

尽管AGuIX在MRI引导放疗方面有大量临床前研究，其药代动力学仍不完全明确。精确生物分布数据对优化给药方案和预测治疗窗口至关重要。正电子发射体⁶⁴Cu（T₁/₂=12.4 h）提供时间灵活性，可成像快速和缓慢清除的试剂。本文首次报道⁶⁴Cu标记AGuIX在HepG2肿瘤负荷裸鼠中的体内生物分布和PET成像，并用¹⁸F-FDG PET/CT评估其放射增敏效应。

方法

一般信息

AGuIX纳米颗粒（亚5 nm、脱水、球形）购自Nano-H（法国里昂），无菌DEPC处理水复溶。人HCC HepG2细胞（ATCC）在含10% FBS的MEM中培养。⁶⁴Cu同位素来自威斯康星大学。雄性BALB/c无胸腺裸鼠（6周龄，16-18 g）用于实验，方案经弗吉尼亚大学机构动物护理与使用委员会批准。

透射电镜（TEM）

AGuIX（0.5 mM）与HepG2细胞孵育1 h，0.1 M PBS洗涤离心。细胞沉淀用4%甲醛和1%戊二醛固定供TEM成像。

⁶⁴Cu放射性标记

AGuIX（10 µmol）与100 µL 0.5 M NH₄OAc（pH 5.5）混合孵育5 min。加入1-3 mCi ⁶⁴CuCl₂（0.1 N HCl），37 °C孵育1 h。产物经3 kDa Amicon超滤纯化。放射化学纯度经iTLC（20 mM柠檬酸）确认，持续>98%。比活度3-10 MBq µmol⁻¹，每次合成终产物活度50-100 MBq。

肿瘤模型

HepG2细胞（5×10⁶）重悬于0.1 mL HBSS皮下注射至裸鼠右侧腹。约2周后肿瘤可触及。

⁶⁴Cu-AGuIX生物分布

十只小鼠（5雄4雌）腹腔注射~0.9 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX（0.2 mL）。注射后9、21、40 h处死，收获器官（心、肌、肺、肾、脾、肝、肿瘤），称重并用γ计数器计数。数据以单位克组织注射剂量百分比（% ID/g）表示。

微PET成像

每只肿瘤负荷小鼠腹腔注射22.2 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX。异氟烷麻醉下于9 h和21 h采集PET扫描，使用SuperArgus系统（Sedecal，西班牙）。

照射与¹⁸F-FDG PET/CT

十二只小鼠分三组（n=4）。基线PET成像于尾静脉注射16.4±4.7 MBq ¹⁸F-FDG后30 min进行。各组分别接受生理盐水、1 mg或10 mg AGuIX腹腔注射，1 h后照射。照射条件：250 kV、8 mA、2 mm Al滤光片（1.2 Gy min⁻¹）共6 Gy；次日重复。第二次照射24 h后进行第二次¹⁸F-FDG PET扫描（11.1±1.0 MBq）。测量肿瘤和正常肝脏标准摄取值（SUV_max），归一化肝脏SUV_ave得T/L比。

统计分析

所有实验三重复。数据呈均值±SE。双尾不配对t检验或单因素方差分析评估显著性（p<0.05为显著）。

结果与讨论

虽然对比增强MRI可检测AGuIX，但PET提供更优的灵敏度和定量准确性，能检测低于MRI阈值的纳摩尔浓度。本文证明⁶⁴Cu标记AGuIX提供清晰肿瘤勾画和在HepG2异种移植瘤中延长保留，支持其用于PET引导放疗。

TEM研究

HepG2细胞与0.5 mM AGuIX孵育1 h导致细胞质摄取，在×6 500和×52 000倍下可视化（图1）。纳米颗粒保持良好分散形态，指示细胞稳定性和相容性。

AGuIX在HepG2细胞内的定位。a. TEM图像（×6500）显示摄取。b. 放大视图（×52000）显示细胞质分布。

放射性标记

通过内置DOTA一步螯合⁶⁴Cu至AGuIX，放射化学收率>98%。所得比活度3-10 MBq µmol⁻¹，每次合成终产物活度50-100 MBq。

生物分布研究

腹腔注射后，⁶⁴Cu-AGuIX表现出稳健肿瘤摄取（9、21、40 h分别为7.82±1.50、8.43±6.23、6.84±1.40 % ID/g）。非靶器官保留<1 % ID/g，确认快速清除。肾脏摄取显著较低（~5 % ID/g），低于静脉注射报道，可能因持续腹腔吸收。这些数据支持⁶⁴Cu-AGuIX作为量化工具指导放射增敏剂给药。

肿瘤负荷小鼠⁶⁴Cu-AGuIX生物分布（% ID/g，9、21、40 h）。均值±SD，n=3。

微PET成像

9 h观察到清晰肿瘤信号，21 h背景活性下降后对比度更高（图3）。数据佐证生物分布发现，展示PET引导治疗规划的实际可行性。

肿瘤负荷小鼠微PET图像。上排（冠状面）和下排（横断面）于注射后9 h和21 h。红箭头指示肿瘤。

照射异种移植瘤的¹⁸F-FDG PET/CT评估

所有照射小鼠肿瘤¹⁸F-FDG摄取均降低。SUV_max比值（B/A）为：生理盐水1.03±0.03、1 mg AGuIX 1.04±0.04、10 mg AGuIX 1.24±0.02。10 mg组肿瘤-肝脏摄取比较1 mg和生理盐水组显著增加（p<0.001），确认剂量依赖性放射增敏。1 mg AGuIX与生理盐水无差异，提示临床获益需更高剂量。

照射前后¹⁸F-FDG PET图像：生理盐水（左）、1 mg AGuIX（中）、10 mg AGuIX（右）。图像共享相同色标。

定量分析：T/L（B）-照射前肿瘤/肝脏SUV_ave；T/L（A）-照射后；T/L（B/A）-两者比值。展示1 mg和10 mg AGuIX组。

静脉注射放射性标记AGuIX可导致高肾摄取，腹腔给药缓解此暴露，实现持续肿瘤保留且肾脏暴露极小。未来剂量学研究将阐明器官特异性辐射耐受并支持临床转化。

结论

我们成功用⁶⁴Cu放射性标记AGuIX，纯度>98%，在HepG2异种移植瘤中实现>40 h持续的显著肿瘤摄取。PET成像展示清晰肿瘤勾画并提供治疗规划定量读出。用¹⁸F-FDG PET的放射增敏研究确认10 mg腹腔剂量AGuIX增强HCC模型中6 Gy放疗疗效。这些发现验证AGuIX作为影像引导放疗的双功能诊疗一体化纳米探针，并凸显临床应用前全面剂量学研究的必要性。