在 HepG2 荷瘤裸鼠中评估新型 64Cu 标记的治疗诊断钆纳米探针

背景

肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。 2012年新诊断肝癌78.25万例，肝癌死亡74.55万例，其中70%～90%为HCC[1]。大多数 HCC 患者在首次诊断时被归类为晚期或末期，因此只有 20-25% 的患者适合根治性治疗 [2, 3]。因此，肝癌的治疗需要综合的多学科综合治疗，其中放疗是临床上可行的主要技术[4]。

HCC 患者放疗的主要限制之一是对周围正常肝组织的放射相关毒性。随着剂量的增加，放疗并发症的发生，包括放射诱发的肝病（RILD），对患者的生命构成严重威胁[5]。避免这一问题的策略之一是使用可在肿瘤组织中积累的放射增敏剂来增加肿瘤细胞对放射的敏感性，从而使肿瘤细胞更有可能被较低剂量的放射杀死[6]。

2013 年，Mignot 等人。构建了一种新型的多功能钆纳米粒子 AGuIX，它的直径很小（约 5 nm），据报道可通过肾脏快速排泄 [7]，并且可以与放射性或荧光标记结合用于 SPECT、PET、MRI，或荧光成像。由于这些纳米粒子携带大量钆（原子序数为 64），因此可用作肿瘤放疗增敏剂 [8]。多项研究表明，AGuIX纳米粒子在体外增加了各种肿瘤细胞（包括抗辐射细胞系）中肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。在 1.1 到 2.5 的范围内观察到致敏增强率 (SER) [8]。由于增强的渗透性和保留（EPR）效应，AGuIX 的肝脏背景与大多数肿瘤模型中 AGuIX 的高肿瘤摄取相比要低得多，这种类型的纳米颗粒有很大的潜力被开发成 HCC 的理想放疗增敏剂[9].

这些 AGuIX 纳米粒子主要用于 MRI 引导的放射治疗 (RT)；然而，AGuIX 的药代动力学尚未完全了解。为了定量确定放射治疗的剂量效应，定义这些纳米颗粒的生物分布和药代动力学至关重要。 ⁶⁴ Cu 是正电子发射断层扫描 (PET) 中最常用的放射性同位素之一，具有衰变特性 (T 1/2 =12.4 h)，使其能够灵活地对小分子和大的缓慢清除蛋白质和纳米粒子进行成像。在这项研究中，我们用 ⁶⁴ 放射性标记了 AGuIX Cu 用于初步评估其在携带 HepG2 肿瘤的裸鼠中的体内生物分布，以更准确地测量其在肿瘤微环境中保留的程度和持续时间。为了进一步使用 AGuIX 作为辐射增敏剂在荷荷 pG2 荷瘤裸鼠中进行概念验证研究，我们使用了 ¹⁸ F-FDG PET/CT，一种经过临床验证的肿瘤代谢成像技术，用于监测治疗反应并评估放疗前后 HepG2 肿瘤的葡萄糖代谢。

方法

一般信息

脱水、球形和亚 5 nm 钆纳米粒子 (AGuIX) 获自 Nano-H (Lyon, France)，无需纯化即可使用。纳米粒子由通过内置 DOTA 螯合剂连接到聚硅氧烷壳的钆原子组成。纳米颗粒在无菌、经 DEPC 处理的水（Invitrogen，美国）中再水化，并在 4°C 下储存，直至根据制造商的说明使用。醋酸甲地孕酮购自 Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA)。人 HCC 细胞系 HepG2 获自美国典型培养物保藏中心（美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚大学，弗吉尼亚州，美国）。 ⁶⁴ Cu同位素购自威斯康星大学。其他化学品和试剂购自 Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO, USA)，无需进一步纯化或加工即可使用。 6 周龄雄性 BALB/c 无胸腺裸鼠，体重在 16 至 18 克之间，购自 Charles River。该动物研究获得了弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。

透射电子显微镜 (TEM)

将上述溶液中浓度为 0.5 mM 的 AGuIX 纳米颗粒与 HepG2 细胞孵育 1 小时 [10]。然后，残留的纳米颗粒用 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水洗涤并通过离心纯化。使用 4% 甲醛和 1% 戊二醛在 0.1 M Pb 中对含有纳米颗粒的细胞沉淀进行染色以进行成像。

⁶⁴ 铜放射性标记

AGuIX 纳米粒子用 ⁶⁴ 进行放射性标记 铜同位素。我们首先将 200 μl AGuIX 纳米颗粒溶液（10 μmole AGuIX）与 100 μl 0.5 M NH4OAc 缓冲液（pH =5.5）混合。孵育 5 分钟后， ⁶⁴ 加入 1–3 mCi 加入溶于 0.1 N HCl 的 CuCl2，并将反应混合物在 37°C 下孵育 1 小时。然后通过3k Amicon Ultra Centrifugal Filter (Merck Millipore)过滤对反应混合物进行灭菌。放射化学纯度通过 iTLC 测定，使用 20 mM 柠檬酸作为流动相，如前所述 [11]。

肿瘤模型

HepG2 细胞在含有 1 mM 丙酮酸钠、1 mM 非必需氨基酸和 10% FCS（Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA）的 MEM 中生长。细胞保持在空气/二氧化碳 (19/1) 的湿润气氛中，每 2-3 天传代一次。

HepG2 细胞 (5 × 10 ⁶ ) 收集在 0.1 ml HBSS 中，然后使用 27 号针头将这些细胞悬液皮下注射到每只裸鼠的右侧。接受细胞注射的裸鼠的耳朵被标记以进行识别。一般来说，注射HepG2细胞2周后实体瘤开始可见。

⁶⁴ 荷瘤小鼠体内的生物分布 铜-AGuIX

荷瘤裸鼠（5雄4雌）随机分为三组，腹腔注射 ⁶⁴ Cu-AGuIX，活性约为 0.9 MBq，体积为 0.2 mL。在注射后 9、21 和 40 小时，在异氟烷吸入麻醉下通过颈椎脱臼处死小鼠。解剖感兴趣的器官（心脏、肌肉、肺、肾、脾、肝和肿瘤等）并称重，并从心室腔中取出 100 μL 血液。通过使用γ计数器（CRC-7，Capintec Inc.，NJ，USA）测定每个样品的活性。计算放射性在不同组织器官中的分布，并表示为每克注射剂量的百分比（% ID/g）。

⁶⁴ 的微PET成像 裸鼠中的 Cu-AGuIX

⁶⁴ 将 0.2 mL 盐水中的 Cu-AGuIX (22.2 MBq) 腹膜内注射到每只荷瘤裸鼠中。每只动物俯卧在 PET 系统（SuperArgus，Sedecal，西班牙）的床上。在注射 ⁶⁴ 后 9 和 21 小时的不同时间段获取 PET 图像 Cu-AGuIX在4%~5%异氟醚麻醉诱导下和1%~2%维持麻醉下,均由氧平衡。

辐照设置和 ¹⁸ 异种移植物的 F-FDG PET 评估

为了评估放射治疗期间 AGuIX 的放射增敏作用的 PET 成像研究，将 12 只携带 HepG2 肿瘤的裸鼠分为三组，每组随机分配四只小鼠。对于基线 PET 成像，小鼠注射了 ¹⁸ F-FDG (16.4 ± 4.7 MBq) 通过尾静脉并在全身麻醉下保持 10 分钟的 PET 静态成像在 30 分钟 p.i. （注射后）使用小动物 PET 扫描仪（Madiclab，山东，CN）。 PET图像使用3D OSEM算法重建，体素尺寸为0.91 × 0.90 × 0.90 mm，视野中心的空间分辨率为1.3 mm。

对于辐照研究，每组接受尾静脉注射 0.1 mL 生理盐水、1 mg (0.1 mL) AGuIX 和 10 mg (0.1 mL) AGuIX。在注射后 1 小时，使用 X 射线源（X-RAD 320，Precision X-Ray，North Branford，CT，USA）照射这些裸鼠，该源在 250 kV 和 8 mA 下操作，2- mm 铝过滤器，剂量率为 1.2 Gy/min，总剂量为 6 Gy。第二天，对小鼠重复相同的照射方案。在两次照射治疗后 1 天，这些小鼠用 ¹⁸ 成像 F-FDG (11.1 ± 1.0 MBq) PET 使用与第一次 PET 扫描相同的协议。通过在肿瘤区域（Madiclab，山东，CN）中绘制感兴趣区域（ROI）来确定标准摄取值最大值（SUVmax）。

统计分析

所有实验一式三份进行，结果表示为平均值 ± 标准误差（SE）。使用双尾未配对 t 计算统计显着差异 检验或单向方差分析； p <0.05(*) 和 <0.01(**) 的值被认为是显着的。

结果与讨论

虽然对比增强 MRI 已广泛用于基于 AGuIX 的图像引导放射治疗，但由于纳米颗粒药代动力学的较长时间测量，纳米颗粒浓度的检测极限是一个问题。 PET 具有更灵敏和更高的定量能力，可将浓度的动态范围扩展到低得多的纳摩尔浓度，而对比度增强 MRI 无法检测到这些浓度。在本报告中，我们描述了 ⁶⁴ AGuIX 的生物分布和药代动力学的标记和评估 Cu用于潜在的PET成像引导放射治疗。

TEM 研究

对于细胞孵育研究，根据已发表的数据选择浓度为 0.5 mM 的 AGuIX 纳米颗粒，并将 AGuIX 纳米颗粒与 HepG2 细胞孵育 1 小时 [10]。观察到 HepG2 细胞的细胞质吸收（图 1）。这一结果与之前发表的研究一致，其中 AGuIX 纳米颗粒与其他类型的细胞系一起培养 [12, 13]。我们还观察到AGuIX在HepG2细胞中表现出极好的分散形态，表明AGuIX在细胞中是稳定的。

AGuIX 在 HepG2 细胞内的定位。 一 . TEM 图像 (× 6500) 描绘了 AGuIX 被 HepG2 细胞吸收。 b . TEM放大图（× 52000）显示AGuIX纳米颗粒在细胞质中的分布

无线电标记

使用具有内置螯合剂 DOTA 的当前形式的 AGuIX 方便地在一步中进行标记，以获得> 98% 的放射化学产率。使用 iTLC 测试来识别保留在原始点中的放射性标记纳米粒子，标记导致比活性和放射化学纯度分别约为 3–10 MBq/μmol 和 98%。每次合成平均获得 50-100 MBq 的最终产物。

生物分布研究

⁶⁴ 腹腔注射Cu-AGuIX纳米颗粒，测定荷HepG2荷瘤裸鼠的生物分布，并与之前报道的进行比较。如图 2 所示，每个器官/组织中的生物分布表示为每克组织的给药活性（注射剂量）百分比（% ID/g）。结果清楚地表明 ⁶⁴ Cu-AGuIX 在肿瘤中积累并在感染后 9、21 和 40 小时保持良好。吸收率分别为 7.82 ± 1.50、8.43 ± 6.23 和 6.84 ± 1.40% ID/g。这种长期保留可能归因于细胞内 AGuIX 纳米颗粒的吸收，因此与 ⁶⁴ 细胞中的铜滞留。与其他报告 [11, 14] 一致，虽然使用了不同的同位素放射性标记和注射途径， ⁶⁴ Cu 放射性标记的纳米探针在其他正常器官和组织中表现出低得多的吸收（低于 1% ID/g）和快速清除。总的来说，这些数据表明 ⁶⁴ 的潜在用途 铜标记的 AGuIX 作为测量 AGuIX 的生物分布和药代动力学的工具，有助于指导将这些纳米颗粒用作放射增敏剂的放射治疗计划。在本研究中，由于本研究使用腹腔注射 [11, 14]，肾脏摄取量远低于其他报道。

⁶⁴ 的生物分布 携带 HepG2 肿瘤的裸鼠中的 Cu-AGuIX。在腹腔注射 ⁶⁴ 后 9、21 和 40 小时，每个组织/器官的放射性摄取以 %ID/g 表示 Cu-AGuIX（平均值±SD，n =3)

裸鼠中的微型 PET 成像

Micro-PET 成像显示 ⁶⁴ 的高摄取 在荷瘤裸鼠的肿瘤、肾脏和肝脏中观察到 Cu-AGuIX（图 3）。 ⁶⁴ 给药后肿瘤清晰可见 Cu-AGuIX 在 9 小时甚至更清晰，直到注射后 21 小时，因为背景降低。

肿瘤小鼠的微型 PET 图像。患有肿瘤的裸鼠的 PET 图像（上，冠状视图；下，横向视图）（红色箭头 ) 在腹腔注射 ⁶⁴ 后 9 小时（左）和 21 小时（右）获得 Cu-AGuIX

¹⁸ F-FDG PET/CT 对有或没有 AGuIX 的辐照异种移植物的评估

为了评估使用或不使用 AGuIX 的不同放疗反应， ¹⁸ 进行 F-FDG PET/CT 成像以监测在两种不同剂量下注射或不注射 AGuIX 后的代谢变化。 ¹⁸ 的减少 在所有受过辐射的小鼠中都观察到异种移植物中的 F-FDG 摄取（图 3）。对于接受生理盐水、1mg AGuIX 和 10mg 的小鼠，放射致敏有效性的主要指标 SUVmax (B/A) 分别为 1.03 ± 0.03、1.04 ± 0.04 和 1.24 ± 0.02（图 AGu 4）。对于 10 毫克 AGuIX 组，与 1 毫克 AGuIX 组相比，T/L (B/A) 显着增加 (p <0.001，独立样本检验）和生理盐水组（p <0.001，独立样本检验）。接受 1 mg AGuIX 和生理盐水的组之间的 T/L (B/A) 没有显着差异（p =0.83，独立样本测试）（图 5）。这些结果表明，在接受 10 毫克 AGuIX 注射的受照射小鼠中，异种移植物的葡萄糖代谢主要受到抑制；尽管放疗可能会引起炎症，这也会导致 FDG 摄取。在本研究中，我们为所有组选择相同的放射剂量和相同的放疗后时间点，以抵消任何系统性错误。因此，RT 引起的炎症程度对于所有三组应该大致相同，并且炎症引起的对 FDG 摄取的贡献也应该大致相同。可以使用其他 PET 成像探头来避免这种担忧。尽管如此，这些发现提供了AGuIX可用作荷HepG2荷瘤小鼠的肿瘤放射增敏剂的概念证明。

¹⁸ 辐射前后小鼠的 F-FDG PET 图像。 ¹⁸ 对辐照前（左）和辐照后 1 天（右）的每个组中的 F-FDG PET 图像进行比较，三个组显示通过尾静脉注射生理盐水（左组）和 1 mg AGuIX 注射小鼠的图像（中图）和 10 毫克 AGuIX（右图）。每个图像都应用了相同的色阶

¹⁸ F-FDG PET 辐照前后定量评价。 T/L (B)，照射前SUVmax（肿瘤）与SUVave（肝脏）的比值； T/L (A)，照射后SUVmax（肿瘤）与SUVave（肝脏）的比值； T/L(B/A)，T/L(B)与T/L(A)的比值； AGuIX (1 mg)，注射 1 mg AGuIX； AGuIX（10 毫克），10 毫克 AGuIX 注射

最后，在考虑进入临床使用时，从核成像探头本身吸收的辐射剂量也是一个关键问题。目前形式的 AGuIX 纳米颗粒已经过体内代谢和毒性的彻底研究，并被 FDA 批准用于人体研究 [15]。通过标记 ⁶⁸ Ga（~ 1 小时衰变半衰期）或 ⁸⁹ Zr（78 小时衰变半衰期），通过静脉注射在小鼠体内进行的生物分布研究结果显示，从 ⁶⁸ 加到 ⁸⁹ 最晚可达 72 小时 锆 [11, 14]。虽然肾脏的快速排泄通常是有益的，但由于肾脏对辐射的敏感性，肾脏是否能够耐受这种高摄取以及长时间保留的机制尚不清楚。在这项研究中，在整个研究期间，肾脏摄取量约为 5% ID/g，低于肝脏和肿瘤中的摄取量。这种差异可能被认为是由于不同的注入途径。通过腹腔注射，AGuIX纳米颗粒被腹膜持续吸收，而通过静脉注射，纳米颗粒被肾脏快速排泄。由于每个器官和组织的辐射敏感性不同，最终确定可转化为临床使用的放射性治疗探针需要进一步详细的剂量学研究。

结论

⁶⁴ 已成功标记AGuIX纳米粒子 铜产量高。生物分布研究表明放射性示踪剂 ⁶⁴ Cu-AGuIX 在肿瘤中显示出高积累，并在裸鼠的 HepG2 异种移植物中长期保留，表明它们是用于 HCC 图像引导放射治疗的潜在治疗诊断纳米探针。 ¹⁸ 的显着减少 注射 AGuIX 的肿瘤裸鼠组放疗后 F-FDG 的摄取提供了证据，证明 AGuIX 可用作肿瘤放射增敏剂，以增强荷瘤小鼠的放疗。需要对剂量学进行进一步研究，以确定潜在转化为临床应用的辐射毒性。