氧化石墨烯杂交 nHAC/PLGA 支架促进 MC3T3-E1 细胞的增殖

背景

结合三维多孔支架和骨细胞的骨组织工程作为治疗功能障碍或丢失组织的一种有吸引力的方法已被广泛研究 [1]。可生物降解的支架模仿骨骼的性质，在容纳细胞、控制细胞粘附和增殖以及促进骨骼再生方面发挥着重要作用 [2]。到目前为止，包括静电纺丝、计算拓扑设计 (CTD) 和固体自由形式制造 (SFF) 的集成以及冷冻干燥在内的各种方法已被应用于制造不同的三维 (3D) 多孔结构 [3,4,5 ,6,7]。静电纺丝能够制造具有复杂结构（对齐的弹簧状纤维）和成分的纳米纤维或微纤维支架[7]。但是，它的生产效率有点低。 CTD 和 SFF 的集成允许设计具有多孔结构和更好机械性能的 3D 解剖支架。但这种方法需要很强的专业知识[4]。与这两种方法相比，冷冻干燥法可以通过在真空下将冷冻液相升华来制造多孔结构，从而以更简单的工艺制造多孔结构[8]。

自然骨骼具有复杂的分层结构，主要有两种成分，即胶原蛋白和羟基磷灰石 [9,10,11]。在骨组织工程中，制造一种理想的骨细胞外基质仿生体以适应细胞粘附和增殖以治疗功能障碍仍然是一个挑战[12]。基于纳米羟基磷灰石/胶原蛋白 (nHAC) 的可生物降解支架模拟天然骨骼，可提供更好的生物相容性、细胞亲和力和生物可吸收性 [13]。然而，胶原蛋白的缺点，包括较差的机械性能和快速降解性能，仍然是其在骨组织工程中应用的障碍[14]。可生物降解的脂肪族聚合物，如聚乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)，具有高机械强度、出色的生物相容性、生物降解性和在有机溶剂中的良好溶解性，是构建用于骨组织工程的 3D 多孔支架的理想补偿材料 [15] , 16]。含有胶原蛋白和合成聚合物的混合多孔支架结合了胶原蛋白和聚合物的优点并克服了它们的弱点，广泛用于骨修复和再生 [17,18,19]。例如，廖等人。开发了一种由 nHAC 和聚乳酸 (PLA) 制备的骨支架，以促进骨再生 [17]。牛等人。已制备nHAC/聚（L-乳酸）/壳聚糖微球复合支架以增强成骨细胞增殖[19]。

最近，氧化石墨烯 (GO) 是一种单原子厚度的新型碳片 [20, 21]，因其具有良好的生物相容性而在生物领域引起了极大的兴趣。 GO 杂交支架能够丰富支架的机械性能和细胞行为，如细胞扩散和增殖 [22, 23]。罗等人。据报道，将 GO 掺入 PLGA 纳米纤维增强了间充质干细胞 (MSC) 的增殖和成骨分化 [20]。景等人。据报道，在热塑性聚氨酯中添加 1.0% 的 GO 可以促进瑞士小鼠成纤维细胞的增殖 [24]。与添加化学交联剂（京尼平、戊二醛、碳二亚胺等）相比。 ) [25, 26], 具有一定的细胞毒性, 为了提高复合支架的力学性能, 少量的 GO 杂交支架显示出良好的生物相容性。因此，GO与nHAC/PLGA的杂交有望成为一种新型的骨组织人工支架。

在这项研究中，多孔纳米羟基磷灰石/胶原蛋白/聚（乳酸-乙醇酸共聚物）/氧化石墨烯（nHAC/PLGA/GO）支架，其中包含不同重量比的 GO（0.0、0.5、1.0 和 1.5 wt %) 已被制造和表征。杂交支架显示多孔结构。 GO的添加改变了杂交支架的亲水性和机械性能。为了研究 nHAC/PLGA/GO 支架对骨组织工程的影响，将 MC3T3-E1 细胞培养在多孔杂交支架上。结果表明，1.5 wt% GO掺杂的杂交支架有利于细胞粘附、生长和增殖，进一步表明nHAC/PLGA/GO支架可被视为骨组织工程的一个有前景的候选材料。

结果与讨论

nHAC/PLGA/GO 复合支架的结构

图 1 说明了 nHAC/PLGA/GO 支架的制造过程。制造过程的细节显示在实验部分。在制造 nHAC/PLGA/GO 复合支架之前合成 nHAC。 nHAC 粉末的扫描电子显微镜 (SEM) 图像显示了其纳米结构。还显示了 nHAC 的相应能量色散 X 射线光谱 (EDS) 光谱（附加文件 1：图 S1），它揭示了 Ca、Cu、P、C 和 O 的存在。铜信号应该是支持样品。因此，nHAC 由 Ca、P、C、O 组成，nHAC 粉末的 Ca:P 摩尔比为 1.41，低于羟基磷灰石 (HA) (1.66)。这表明合成的 HA 是缺钙型 [27]，这将导致 nHAC 的硬度、弹性模量和韧性降低。为了提高复合支架的机械性能，将 PLGA 和 GO 添加到 nHAC 粉末中。图 2a 显示了具有不同 GO 量的制造的 nHAC/PLGA/GO 支架的光学概览。样品是直径为 14 毫米的圆柱体。很明显，没有 GO 的复合支架是白色的。随着GO的增加，复合支架变得越来越暗。 SEM 显示了不同 nHAC/PLGA/GO 支架的详细形态（图 2b-e）。它显着地表明所有支架都形成多孔结构，并且四种不同支架的表面非常粗糙。为了表征这些孔的信息，我们使用自动表面积和孔隙率测试仪进行评估。孔分布的结果如图 2f 所示。四个支架孔的大小在 0 到 200 纳米之间。而且四个支架中几十纳米的孔比几百纳米的要多。据报道，生物材料支架的孔隙率对体外和体内的骨形成至关重要 [28]。为了优化与周围组织的整合，用于成骨的支架应模仿骨骼的形态、结构和功能 [4]。因此，nHAC/PLGA/GO 复合支架的 3D 多孔结构对于骨再生至关重要。还显示了四个复合支架的大尺寸 SEM 图像（附加文件 1：图 S2），它说明了不同表面的概览结构。

nHAC/PLGA/GO支架制备工艺示意图

一 合成的具有不同 GO 量的 nHAC/PLGA/GO 支架的光学图像。 b –e b 的 SEM 图像 nHAC/PLGA，c nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%)，d nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) 和 e nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%) 支架。 f nHAC/PLGA/GO 的孔分布（0、0.5、1.0 和 1.5 wt%）

nHAC/PLGA/GO 复合支架的物理化学和机械特性

合成过程的机理可以通过各种单一物质和复合材料的 X 射线衍射 (XRD) 和傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 光谱来揭示（图 3）。如图 3a 所示，根据粉末衍射文件（PDF 卡片编号 09-0432），无机相被确定为 HA，因为 XRD 图中不存在来自其他 Ca-P 材料的峰。与 nHA 相比，nHAC 的宽衍射峰意味着小晶粒尺寸和低结晶度。与 nHAC 类似，具有不同 GO 量的 nHAC/PLGA/GO 图案也具有低结晶度。然而，在 nHAC/PLGA/GO 复合材料中没有出现 GO 的峰值，这可能是因为与本体相比，GO 的数量很少。图 3b 显示了各种单一物质和复合材料的 FT-IR 光谱。从图 3b 中可以观察到典型的胶原蛋白带，例如 N-H 拉伸在 3336 cm ^-1 酰胺A； C–H 在 3079 cm ⁻¹ 处拉伸 酰胺B； C=O 在 1656 cm ⁻¹ 处伸展 对于酰胺 I； 1548 cm ⁻¹ 处的 N–H 变形 对于酰胺 II 和 1238 cm ^-1 处的吸收峰 对于酰胺 III。随着 nHAC 的形成，酰胺 A 从 3336 cm ^-1 移动 到大约 3411 厘米 ⁻¹ ，酰胺 B 减弱，酰胺 I、酰胺 II、酰胺 III 从 1656、1548 和 1238 cm ^-1 移动 到 1654、1542 和 1240 厘米 ⁻¹ ， 分别。因此，它证实了胶原蛋白和 HA 之间的化学反应。此外，1033、601 和 563 cm ^-1 处的峰值 是 (PO4) ³⁻ 的典型峰 组，这表明由于商品化的 HA 仅具有 (PO4) ³⁻ 的特征峰，因此在胶原蛋白上新形成了 HA 在 1033、603 和 565 厘米 ⁻¹ . PLGA 在 2996 和 2944 cm ^-1 附近的特征峰 被分配到 -CH2, 1752 cm ^-1 被分配到 C=O、1183 和 1093 cm ⁻¹ 被分配到 C-O，清晰可见。与 PLGA 支架相比，nHAC/PLGA 支架的峰值从 1752 和 1183 cm ^-1 移动 到 1760 和 1187 厘米 ⁻¹ 分别展示了 PLGA 和 nHAC 电源之间的化学反应。与 nHAC/PLGA 支架相比，GO 掺杂的 nHAC/PLGA 支架的峰值从 1760 cm 移动到 1762 cm ^-1 ;发生红移，表明GO与nHAC/PLGA发生化学反应。

一 XRD 和 b 不同组分的红外光谱

通过定量纳米机械原子力显微镜（QNM-AFM）[29,30,31,32,33,34]表征了具有不同GO量的nHAC/PLGA/GO支架的纳米结构和机械性能，该显微镜能够自发提供形态和刚度，广泛用于检测各种材料的机械性能，包括骨骼 [30]、牙齿 [35]、角膜 [36] 等。 图 4a-d 显示了四种复合材料的断层扫描脚手架。由于扫描区域的限制，AFM 图像仅显示局部表面结构。因此，多孔结构不明显。然而，AFM 图像也显示出与 SEM 图像相似的粗糙表面形态。粗糙度对细胞增殖和分化有重要影响。表面粗糙的表面有利于细胞增殖和分化[37,38,39]。从形态学（图 4a-d）导出的线轮廓（图 4e-h）显示了不同线方向的最大高度差异。清楚地表明，最大高度差范围从~ 200 到~ 600 nm。相应的刚度分布（图 4i）显示四种不同支架的杨氏模量分别为 7.53 ± 1.25、8.34 ± 1.00、9.15 ± 0.85 和 10.20 ± 1.28。GPa为了清楚地显示刚度差异，还给出了相应的条形图（图 4j）。尽管具有少量 GO 量差异的 nHAC/PLGA/GO 支架的杨氏模量没有显着差异，例如，具有 0.0 和 0.5 wt% GO 量的 nHAC/PLGA/GO（7.53 ± 1.25 和 8.34 ± 1.00） GPa)，0.5 和 1.0 重量％（8.34 ± 1.00 和 9.15 ± 0.85GPa），1.0 和 1.5 重量％（9.15 ± 0.85 和 10.20 ±0.85 和 10.20 ±1.00 和 10.20 ±0.85 GPa），sc 的杨氏 PL/GA 的杨氏 PL/GA 模量稍大的 GO 量差异（0.0 wt% 和 1.5 wt%）有显着差异（7.53 ± 1.25 和 10.20 ± 1.28 GPa）。这表明nHAC/PLGA/GO支架的力学性能随着GO量的增加而增加。

a 的 AFM 图像 nHAC/PLGA，b nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%)，c nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) 和 d nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%) 支架。 e –h 来自形态学图像的线轮廓。 我 通过 QNM-AFM 测量的四种不同支架的刚度分布。 j 杨氏模量与 GO 量的条形图。 k 固滴法测得四种支架的相应接触角

支架的亲水性在与细胞相互作用中起着关键作用。 GO的加入不仅提高了复合支架的力学性能，而且改变了四种支架的疏水性。图 4f 显示了不同 nHAC/PLGA/GO 支架的接触角。 nHAC/PLGA 支架的接触角为 ~ 125.1°，而对于具有不同 GO 量（0.5. 1.0 和 1.5 wt%）的 nHAC/PLGA/GO，分别为 ~ 113.4°、~ 103.4° 和 ~ 101.4°。随着 GO 量的增加，由于羟基和带负电荷的基团，如 GO 表面上的羧酸基团，复合支架的接触角略有下降 [40]。因此，GO可以为3D nHAC/PLGA支架提供显着的生物活性。

一般来说，组织工程支架不仅需要展示生物相容的形态和特性，还需要多孔结构和物理强度[41]。由于溶剂的升华，冻干的 3D nHAC/PLGA/GO 支架具有多孔结构。支架表面的官能团，包括羟基 (OH)、环氧基 (C-O-C) 和羧基 (COOH) [40] 具有良好的亲水性。 PLGA和GO的加入提供了足够的体力。因此，3D nHAC/PLGA/GO支架可能是组织工程的一个有前途的候选者。

细胞培养

众所周知，用于骨组织的支架应具有生物相容性、细胞增殖性和免疫反应性 [21]。 nHAC/PLGA/GO含有天然骨成分（胶原蛋白和HA），具有合适的力学性能和亲水性，是骨组织工程的理想选择。为了研究这些支架的细胞增殖，在这项工作中培养了 MC3T3-E1 成骨细胞。图 5 显示了通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 测定评估的细胞活力与培养时间的关系。在所有组的整个培养期间，细胞的增殖持续增加。更具体地说，MC3T3-E1 在 nHAC/PLGA/GO（0.5 和 1.0 重量％）支架上的细胞增殖在第 1 天显着降低，而在 nHAC/PLGA/GO（1.5 重量％）支架上的细胞增殖与nHAC/PLGA 支架。随着时间的增加，nHAC/PLGA/GO (1.5wt%) 支架上 MC3T3-E1 的细胞增殖在第 3、5 和 7 天显着增加。 然而，nHAC/PLGA/GO 上 MC3T3-E1 的细胞增殖(0.5 和 1.0 wt%) 支架与 nHAC/PLGA 支架相比没有显着差异。

MC3T3-E1细胞在不同支架表面的比较；双星号表示 p <0.01，样本数N =4

SEM 还捕获了不同支架上细胞生长、增殖的证据。图 6 显示了分别培养 1、3、5、7 天后四种不同支架上成骨细胞的表面形态。在第 1 天，所有细胞均匀地隔离分布在四个不同的支架上。随着时间的推移（第 3、5 和 7 天），所有细胞组都生长、增殖并开始在不同的支架上整合，形成一大层细胞。与不同支架上的细胞形态相比，nHAC/PLGA/GO支架表面上的细胞比nHAC/PLGA支架表面上的细胞大得多且被拉伸。根据SEM图像，不同量（0.5、1.0和1.5wt%）的nHAC/PLGA/GO上的细胞扩散、细胞间粘附情况无显着差异。

一 –p 在四种不同支架上培养 1、3、5 和 7 天的 MC3T3-E1 细胞的 SEM 图像。所有图像中的比例尺均为 50 μm。白色星号代表 MC3T3-E1 成骨细胞

细胞毒性测试

GO 的细胞毒性是其在生物学领域中的应用的一个重要问题。因此，我们评估了四种支架在 24 小时内的细胞毒性。结果如图7。nHAC/PLGA中成纤维细胞(NIH-3T3)的细胞活力为0.5,1，1.5%GO为99,101.11，97.86%与nHAC/PLGA相关，无显着差异与nHAC/PLGA相比，表明氧化石墨烯的增加0-1.5%是安全的。

HIH-373细胞在nHAC/PLGA中的相对活性(0.5, 1, 1.5 wt%)与nHAC/PLGA有关

表 1 总结了四种复合支架的力学性能和细胞培养性能。随着GO的增加，支架的杨氏模量相应增加。然而，只有 nHAC/PLGA 和 nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%) 的机械性能明显不同。四种支架的细胞活力与力学性能表现出相同的趋势，即所有组的 OD 值都随着细胞培养时间的增加而增加，但只有 nHAC/PLGA 和 nHAC/PLGA/GO (1.5 wt %) 组显示出显着差异。这表明支架的力学性能与细胞培养性能密切相关。结果可能是因为组织细胞可以感觉到并对其基质的刚度做出反应 [42,43,44,45]。调整底物的机械特性可以促进细胞反应，影响细胞表面相互作用以及细胞生长和活力 [46,47,48,49]。豪等人。发现支架的刚度增强了 MC3T3-E1 细胞的活性（细胞增殖和迁移）[50]。恩格勒等人。证明许多细胞类型响应中的一个重要物理因素是基材刚度 [51]。他们发现，与其他贴壁依赖细胞一样，源自大鼠主动脉（A7R5 系）的平滑肌细胞在“硬”基底上比在“软”基底上扩散得更多，并组织更多的细胞骨架和粘着斑。力学性能不仅影响细胞行为，而且影响组织活动。邓肯等人。研究了骨骼功能反应的机械转导和机械应变。他们发现机械负荷可以抑制骨吸收并增加体内骨形成[52]。因此，最坚硬的nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)支架可以促进MC3T3-E1细胞的增殖。

GO的细胞毒性是其在生物学领域应用的一个重要问题。到目前为止，已经出现了两种争论。一种说法是 GO 会诱导细胞毒性，其作用是浓度依赖性的。例如，查特吉等人。报道了对 GO 具有不同剂量依赖性的毒性反应 [53]。平托等人。据报道，只有低浓度的 GO 才能安全地掺入 PLA 中，以促进细胞粘附和增殖 [6]。其他人指出，甚至更高量的 GO 将具有良好的生物相容性并增强基材的机械性能和细胞行为。申等人。研究了 C2C12 骨骼肌成肌细胞在 PLGA-GO-胶原混合基质上比 PLGA、PLGA-胶原基质得到增强 [54]。和罗等人。报道了 GO 掺杂的 PLGA 纳米纤维支架可以增强 MSCs 的成骨分化 [22]。在本研究中，GO 是根据第一个参数选择的。有限的量加入到复合支架中，以达到非细胞毒性和增强的机械性能。 GO与nHAC/PLGA支架的结合显着增强了细胞生长、增殖。尽管 nHAC/PLGA 和 nHAC/PLGA 上的细胞数量与少量 GO，例如 nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%) 大致相同，但 nHAC/PLGA/GO 上的细胞数量(1.5 wt%) 支架高于 nHAC/PLGA 支架。这些结果表明 nHAC/PLGA/GO 支架具有生物功能性，能够增强 MC3T3-E1 细胞的生长和增殖。因此，优异的生物相容性和生物功能性使nHAC/PLGA/GO成为骨再生的有效支架。

生物材料的性质和制造工艺对支架特性非常重要 [28]。迄今为止，生物材料已被广泛研究，包括金属[55]、陶瓷[56]、玻璃[57]、化学合成聚合物[58]、天然聚合物[59]以及这些材料的组合形成复合材料[60] .改变复合支架的成分会导致支架的特性。例如，为了制造天然骨的仿生支架，本研究中使用了 I 型胶原蛋白。目前，胶原蛋白家族包括20多种不同类型的胶原蛋白，存在于皮肤、骨骼、软骨等部位。用其他类型的I型胶原蛋白代替，可以制造不同用途的复合支架。例如，II 型胶原蛋白是形成原纤维的胶原蛋白之一，也是软骨中主要的胶原蛋白类型。将 II 型胶原蛋白配合到支架中可能能够促进软骨骨再生 [61]。此外，适当退火的胶原蛋白可以进一步加强支架，这可能会产生具有功能结构的新型复合材料。除了生物材料的性质外，加工过程还决定了支架的功能，例如不同的加工方法。材料化学和加工决定了最大的功能特性以及细胞如何与支架相互作用。支架在骨组织工程中的特性和要求已被广泛研究，包括降解[62]、机械性能[63]、细胞因子传递[64]以及支架与细胞的组合[65]。

结论

总之，具有不同量 GO（0.0、0.5、1.0 和 1.5wt%）的 nHAC/PLGA/GO 支架是通过冷冻干燥方法制造的。制造的 nHAC/PLGA/GO 支架显示出多孔结构。此外，由于添加了 PLGA 和 GO，支架的机械性能和亲水性得到增强。体外研究表明多孔支架促进细胞吸附、生长和增殖。这些nHAC/PLGA/GO支架可能是骨组织应用的一个有希望的候选者。

方法

材料

纯化的冻干 1 型胶原蛋白购自天津赛宁生物工程技术有限公司。 PLGA 丙交酯：乙交酯比例为 75:25，Mw 为 95,000 g/mol，购自山东医疗器械厂（中国）。 GO购自上海阿拉丁生化科技有限公司。MC3T3-E1成骨细胞由上海中科院细胞库提供。胎牛血清 (FBS)、抗生素抗真菌剂、CCK-8 和 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 购自天津信王信科技有限公司。 1,4-二恶烷、磷酸盐缓冲盐水 (PBS, 0.1 M, PH 7.4)，所有其他化学品均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。

nHAC 电源和 nHAC/PLGA/GO 复合支架的制备

以前曾报道过 nHAC 粉末的复合方法 [66,67,68]。简而言之，将胶原溶解在乙酸（0.5 mol/L）中，形成浓度为 4 g/L 的溶液。 CaCl2 和 H3PO4 (Ca/P =1.66)然后单独滴加溶液。滴速为每分钟100滴。将溶液轻轻搅拌并在 37°C 下用氨溶液滴定至 pH 9。24 小时后，通过离心和冷冻干燥收集 nHAC 沉积物。为了制备 nHAC/PLGA/GO 复合支架，使用超声波细胞破碎机将 GO 均匀分散在二恶烷中，最终浓度分别为 0.0、0.5、1.0 和 1.5 g/L。然后将 PLGA 添加到 GO 溶液中，形成 10% (m/v) 的最终浓度。然后将 GO/PLGA 溶液在室温下轻轻搅拌 12 小时。通过将 nHAC 能量以 1:1 的 nHAC:PLGA 重量比添加到 GO/PLGA 溶液中来形成最终溶液。然后将形成的 nHAC/PLGA/GO 溶液搅拌并超声处理 4 小时。 - 20℃冷冻过夜后，通过冻干去除二恶烷得到nHAC/PLGA/GO复合支架。

特征

复合支架涂有金，并在 SEM (JSM-7100F) 下观察。我们喷金 20 秒，用于制备电子显微镜样品。基质的形貌和机械性能通过空气中的原子力显微镜（AFM，Multimode VIII，Bruker，Germany）表征。使用 Gwyddion 和 Nanoscope 分析软件进行图像分析。 nHAC/PLGA/GO 复合支架的成分分析由 FT-IR 分光光度计 (VECTOR22, Bruker, Germany) 进行。所有光谱均以吸收模式记录在 1000–2200 cm ^-1 波长范围内 分辨率为 4.0 cm ⁻¹ 和16次扫描。使用接触角测量系统通过固着滴法（EasyDrop，型号 DAS30，kruss，德国）测量样品的接触角。使用 X 射线衍射仪 (D8 DISCOVER) 测量 XRD 图案。 Cu-Kα 辐射 (λ =0.154 nm) 为 40 kV 和 30 mA。测量的扫描速率为8°min ^-1 在 RT 处 5–80° 的 2θ 范围内。支架的孔隙率由自动表面积和孔隙率分析仪（ASAP 2460，Micromeritics，GA，USA）测量。

细胞培养

将 MC3T3-E1 成骨细胞在补充有 10% FBS 和 3% 抗生素-抗真菌溶液的 DMEM 中在 37°C 和 5% CO2 的细胞培养箱中培养。根据制造商的说明，使用 CCK-8 测试初始附着和增殖，其中活细胞的数量与 CCK-8 测定中获得的代谢反应产物成正比 [69]。简而言之，MC3T3-E1成骨细胞以2.5 × 10 ⁴ 的密度接种 嵌入 48 孔细胞培养物中的 nHAC/PLGA、nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%)、nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) 和 nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%) 基质上的每孔细胞数盘子。在培养期的最后 2 小时（1、3、5 和 7 天）将细胞与 CCK-8 溶液一起孵育，以便在 37°C 下在黑暗中增殖。使用 ELISA 读数器 (DNM-9602) 在 450 nm 波长处测量吸光度。

用于 SEM 测量的细胞样品用甲醛固定，然后样品通过梯度系列的乙醇（30、50、75、95 和 100%）在每个浓度下脱水 15 分钟。然后，通过使用二氧化碳分析仪（Hitachi，HCP-2）进行临界点干燥使样品干燥。 Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10 ⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO2 incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

统计分析

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p  < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p  < <0.01.

缩写

3D:

三维

AFM:

原子力显微镜

CCK-8:

Cell counting kit-8

CTD:

Computational topology design

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle media

EDS：

X-ray spectroscopy

FBS:

Fetal bovine serum

FT-IR:

傅里叶变换红外光谱

开始：

氧化石墨烯

HA:

Hydroxyapatite

MC3T3-E1:

Osteoblast cells

MSCs:

Mesenchymal stem cells

nHAC:

Nano-hydroxyapatite/collagen

NIH-3T3:

Fibroblast cells

PBS:

Phosphate-buffered saline

PLA:

Poly(lactic acid)

PLGA:

poly(lactic-co-glycolic acid)

QNM-AFM:

Quantitative nano-mechanical atomic force microscope

SD:

Standard deviation

SEM：

扫描电子显微镜

SFF:

Olid free-form fabrication

XRD：

X射线衍射