氨基末端 HBP 修饰的 rGO 的光热/pH 双响应给药系统和肿瘤细胞的化学光热疗法

介绍

近红外 (NIR) 照射下的光热疗法 (PTT) 因其副作用小和侵入性小而引起了对肿瘤抑制的关注 [1]。近红外光 (700~1100 nm) 可穿透更深的身体组织而没有太多吸收，不会对健康组织或细胞造成任何损害 [2, 3]。因此，在近红外激光照射下，光热剂可以通过其光热转换能力提高植入位置的温度。此外，所应用的光热剂需要良好的生物相容性、光热转换效率和稳定性。

近年来的研究中，设计并制备了多种材料作为 PTT 剂来治疗肿瘤组织，例如贵金属（金纳米棒 [4]、金纳米片 [5]）、半导体纳米材料（CuS [6]、MoS2 [7] ]、FeS [8])、有机材料（聚多巴胺 [9]、聚吡咯纳米颗粒 [10]）、碳纳米材料（碳纳米管 [11]、碳纳米颗粒 [12] 和石墨烯 [13]）。作为一种很有前途的碳纳米材料，石墨烯由于其特殊的二维纳米片，获得了超高的比表面积和高载药效率的巨大潜力，因此被广泛用于通过 PTT 方法抑制肿瘤 [14, 15]。然而，通过尿素和水合肼等常规方法制备的还原氧化石墨烯（rGO），水热法总是表现出高度疏水性，不利于在人体组织的水现象中的应用[16]。

在这种情况下，我们提出了使用具有还原能力的水溶性聚合物制备亲水性 rGO 的新想法。在我们之前的工作中，我们合成了端氨基超支化聚合物（NHBP），并试图用它来处理金属氧化物纳米粒子，制备出亲水性强且无明显团聚的金属纳米球，如 HBP 修饰的银纳米粒子及其在抗氧化中的应用。 -细菌领域[17, 18]。

为了提高肿瘤抑制能力，通常将抗肿瘤药物负载在光热剂上以制造载药系统[19]。一方面，光热剂在近红外激光照射下可以呈现出PTT效应。另一方面，由于提高了分子运动速度，升高的温度可以加快药物递送速度。因此，载药光热剂可以发挥化学-光热协同治疗肿瘤抑制作用[20, 21]。在此，我们使用端氨基 HBP 制备亲水性 rGO（NrGO，图 1），并表征了其理化性质和光热能力。之后，将抗肿瘤药物（doxorubicin，DOX）掺入NrGO，然后在体外测试不同条件下的给药行为和抑瘤效果。

DOX@NrGO制备及化学光热治疗示意图

方法/实验

材料

氧化石墨烯（GO，0.8~1.2 nm 厚，0.5~5 μm 宽）由 XFNANO Co., Ltd. 提供。 DOX 购自华丰联合科技有限公司。 Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基（DMEM），胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶、青霉素 (100 U/ml) 和链霉素 (100 μg/ml) 均购自 Thermo Fisher Scientific Inc. 甲基噻唑基四唑 (MTT)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) )和碘化丙啶(PI)购自碧云天生物技术有限公司，其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，未经进一步纯化。

氨基封端超支化聚合物 (NHBP) 的制备

氨基封端的超支化聚合物是我们之前的工作[16]合成的。将四亚乙基五胺（94 毫升，0.5 摩尔）加入配备有氮气保护和磁力搅拌的 250 毫升三颈圆底玻璃烧瓶中。将反应混合物用加热磁力搅拌器搅拌并用冰浴冷却，同时将丙烯酸甲酯（43ml，0.5mol）的甲醇（100ml）溶液滴加到烧瓶中。然后，将混合物从冰浴中取出并在室温下再搅拌 4 小时。将混合物转移到茄形烧瓶中进行自动旋转真空蒸发，油浴升温至150℃，静置4h至得到淡黄色粘稠状HBP水垢，重均分子量约为7759 .

NHBP-Reduced GO (NrGO) 的准备

首先将 GO 分散在去离子水中，并与适当的 HBP（GO 和 NHBP 的重量比为 1:10、1:20 和 1:30）混合超声 10 分钟，保持搅拌并在 90°C 下反应 1 小时。然后将所得物（标记为NrGO-10、NrGO-20和NrGO-30）离心并用去离子水洗涤3次。

DOX-Loaded NrGO (DOX@NrGO) 的准备

将制备的 NrGO 悬浮液以 1:1 的重量比分散在 DOX 溶液中，并在室温下搅拌 24 小时。然后，将复合溶液离心并洗涤以收集DOX@NrGO。

测量

通过透射电子显微镜（TEM，JEM-2100，JEOL，日本）表征表面形态。进行傅里叶变换红外（FTIR，Nicolet iS10，Thermo Scientific，America）光谱来说明 GO 和 NrGO 之间的化学成分变化。所有光谱均在 400~4000 cm ^-1 的波长范围内测量 分辨率为 4 cm ⁻¹ .通过 Zeta 电位-粒度分析仪（NanoBrook 90plus Zeta，Brookhaven，USA）研究表面电位和粒度。 NrGO 在 NIR 区域的吸收通过 UV-vis (Evolution 300, Thermo Fisher, USA) 研究，波长范围为 400~900 nm，分辨率为 1 cm ^-1 .

通过使用近红外激光装置（SFOLT Co., Ltd., Shanghai, China）和热电偶温度计（DT-8891E，深圳永佳机械工业有限公司，中国）测量光热性能。在 808 nm 激光照射下测量 NrGO 的光热性能。激光的光斑面积约为 0.25 cm ² ，并实时监测被测样品悬浮液的温度变化。在此，应用纯水和 GO 悬浮液作为对照组：（1）将 0.2 ml 纯水、GO 和 NrGO（NrGO-10、NrGO-20 和 NrGO-30）悬浮液放入 0.25 ml Eppendorf 管中，然后加入 NIR激光以 1 W/cm ² 的功率密度照射 5 分钟； (2) 辐照不同浓度（100、200 和 300 μg/ml）的 0.2 ml NrGO-30 悬浮液（1 W/cm ² ) 5 分钟； (3) 0.2 毫升 NrGO-30 悬浮液 (200 微克/毫升) 以不同的功率密度 (1、1.5 和 2 W/cm ² ) 5 分钟； (4) 0.2 毫升 NrGO-30 (200 微克/毫升) 悬浮液被辐照 (1 W/cm ² ) 三个开/关周期。

将收集到的DOX@NrGO分成三组进行不同处理，考察药物的给药行为：（1）分散于pH =7.4的PBS溶液中，标记为对照组； (2)分散于pH =4.0的PBS溶液中，标记为酸性基团； (3)分散于pH =7.4的PBS溶液中，用NIR激光照射，标记为NIR基团。将上述三组（每组设三个平行）装入截留分子量为8000的透析袋（5ml）中，然后放入装有20ml相应PBS溶液的离心管中。之后，将所有管置于37°C 100 rpm摇床中，在预定时间点取出每管10 ml PBS溶液用于药物释放分析，并加入等体积的相应新鲜PBS。此外，NIR 组的处理方式是在每个预定时间点后用 NIR 光照射 5 分钟。所有提取液均采用紫外-可见分光光度法分析，得到药物释放曲线。

通过 MTT 测定研究了 NrGO 对肿瘤细胞 (HeLa) 的细胞毒性。简而言之，将HeLa细胞以5 × 10 ³ 的密度接种在96孔板中 细胞每孔并保持孵育直至孔的 80% 被覆盖。然后，将旧培养基更换为含有 NrGO（3.125、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml）的新鲜培养基，将不含 NrGO 的培养基设为对照组。孵育 24 和 48 小时后，MTT 测定用于通过方程式测量相对细胞活力。 (1):

其中ODsample和ODcontrol分别代表不同浓度NrGO处理细胞和对照组细胞的吸光度值。

然后，通过在 NIR 照射下用 DOX@NrGO（3.125、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml）处理 HeLa 细胞来研究化学光热协同治疗。与 DOX@NrGO 孵育 4 小时后，将 HeLa 细胞用 NIR 激光照射 5 分钟，然后再继续孵育 20 小时。之后，再次通过MTT测定测试细胞活力。细胞观察，分别用DAPI和PI染色HeLa细胞，在CLSM和荧光显微镜下观察。

结果与讨论

理化表征

与NHBP反应后，GO溶液由棕色变为黑色，表明GO成功还原为rGO并可分散于水中。如图 2a、b 所示，分别展示了 GO 和 NrGO-30 的 TEM 图像，而在 NrGO 上未发现明显的脆化或团聚，表明 HBP 处理不会在还原反应中引起任何形态变化。根据图 3 中的 FT-IR 光谱，NrGO-30 的透射率曲线与 NHBP 的透射率曲线非常相似。值得注意的是，1725 cm ⁻¹ 处的峰值 GO 的还原反应后消失，这被认为是 C=O 从羧基吸振[22]。根据端氨基NHBP的分子结构，还原性氨基与GO反应，在1633 cm ^-1 处产生新的FT-IR峰 ，它应该是来自酰胺键的 C-N。 zeta 电位结果如图 4 所示，显然，所有 NrGO 样品均为正电位，而 GO 为负电位，表明 GO 的羧基与 HBP 的氨基反应。 UV-vis-NIR 光谱（图 5）用于说明 NrGO 的 NIR 吸收；不同原料配比的 NrGO 样品的曲线显示出相似的趋势，在 NIR 区域有高吸收，有利于在 PTT 中的应用。而GO和HBP溶液在NIR区域几乎没有吸收，表明GO和NHBP成功制备了光热剂。此外，还测量了 NrGO 的纳米尺寸（图 6），随着​​ NHBP 比例的提高，纳米尺寸没有明显变化。

GO (a ) 和 NrGO (b ）。插图为对应浓度为1 mg/ml的样品分散体的光学照片

GO、NrGO和NHBP的FT-IR光谱

GO和NrGO样品的Zeta电位测试

GO、HBP和NrGO样品的UV-vis-NIR光谱

NrGO样品的纳米尺寸测量

光热特性测量

基于获得的 NrGO，在 808 nm 激光照射下研究了光热性能。如图 7 所示，水、GO 和 NrGO 的加热曲线呈现不同的趋势。纯水的温度几乎没有增长，GO仅升高到5°C以下，而NrGO提高到40°C，NrGO-20和NrGO-30甚至达到了45°C以上。 NrGO可以吸收NIR激光触发光热行为，光热转换效率随着HBP比的提高而提高；因此，选择 NrGO-30 来完成以下调查。如图 7b、c 所示，达到的温度随着 NrGO 浓度或激光功率的增加而升高，后一个因素影响更大。 41-43°C被证明适合抑制肿瘤细胞，对正常细胞几乎没有负面影响；因此，制备的 NrGO 可以在低剂量和激光粉末的情况下满足 PTT 的要求。然后，测试光热稳定性并显示在图 7d 中，三个开/关循环后没有明显差异。因此，NrGO 在 NIR 区域获得了很好的光热性能。为了确认 NrGO 在 NIR 激光照射前后的吸收稳定性，UV-vis 光谱如图 8 所示。显然，NIR 照射后曲线没有变化，表明 NIR 照射不会影响 NrGO 的吸收。

光热性能测量。 一 水、GO 和 NrGO 样品 (200 μg/ml) 在 808 nm 激光照射 (1 W/cm ² ) 下的加热曲线 ）。 b 不同浓度 NrGO-30 在 808 nm 激光照射下的加热曲线 (1 W/cm ² ）。 c NrGO-30 (200 μg/ml) 在 808 nm 激光照射下不同功率密度的加热曲线。 d NrGO-30 (200 μg/ml) 在 808 nm 激光照射下循环照射 3 次 (1 W/cm ² ) 的温度变化曲线 )

近红外激光照射前后NrGO的UV-vis-NIR光谱

给药行为测试

将 DOX 加载到 NrGO 上后，进行药物递送实验。由于肿瘤组织处于微酸性环境，研究了近红外辐射和pH值的影响。在本文中，分别应用 pH 值为 7.4 或 4.0 的 PBS 来模拟正常或肿瘤组织。如图 9 所示，在低 pH 值和 NIR 照射下，药物递送速率明显加快。一方面，NrGO 的氨基在低 pH 值下会被电离，然后在低 pH 值条件下 DOX 与电离氨基之间的排斥力会提高，从而加速药物递送并表现出 pH 敏感性。此外，DOX 在低 pH 条件下的良好溶解性也可以提高药物递送速率 [23]。另一方面，随着近红外激光照射，局部温度升高，分子运动速度加快。因此，DOX@NrGO在药物递送行为中具有pH/光热敏感性，有利于控制肿瘤组织中的药物递送速率，发挥化学-光热协同治疗作用。

DOX@NrGO在不同条件下的体外药物释放曲线

NrGO 的细胞毒性

生物相容性是生物材料的基本要求；因此，在体外实验中通过 MTT 法初步测试了不同浓度 NrGO 的细胞毒性。如图 10a 所示，24 h 的 MTT 检测结果表明，当 NrGO 浓度达到 50 μg/ml 时，细胞活力保持在 80% 以上，这可以证明 NrGO 具有良好的生物相容性，被认为是有前景的肿瘤生物相容性 PTT 剂抑制作用。

一 不同浓度的 NrGO 细胞毒性测试 24 小时和 48 小时。 b DOX@NrGO不同处理对肿瘤细胞的抑制作用研究

DOX@NrGO 对肿瘤细胞的协同抑制

基于NrGO的生物相容性，体外研究了DOX@NrGO的肿瘤抑制作用。为了检测光热行为的影响，近红外激光以0.5 W/cm ² 的功率密度照射相应的肿瘤细胞5 min .如图 10b 所示，当肿瘤细胞用 DOX@NrGO 处理 24 小时后，细胞活力随着浓度的增加而明显下降，表明释放的 DOX 可以抑制肿瘤细胞增殖。此外，当应用NIR照射时，存活率下降得更快，表明升高的温度和DOX释放率可以起到化学光热协同治疗作用。

用 DAPI 染色后，在共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 下观察细胞，细胞核被染成蓝色，不同处理的图像分别显示在图 11a-c 中。用 NrGO 培养的细胞在培养板上大量过度扩散（图 11a），而用 DOX@NrGO 处理时数量减少（图 11b），表明释放的 DOX 可以抑制肿瘤增殖。值得注意的是，近红外激光照射区域的肿瘤细胞被有效破坏并脱落，导致图像上出现暗区（图 11c）。

用 NrGO (a) 处理后 DAPI（蓝色）染色的细胞核的 CLSM 图像 ), DOX@NrGO (b ) 和 DOX@NrGO+NIR (c ）。 (× 400)

此外，PI用于观察化学光热协同处理后肿瘤细胞的抑制情况，PI是一种将死细胞染色为红色荧光的小分子染料。如图 12 所示，图 12a 在未进行处理时很少观察到死细胞（图中红点），而在化学光热处理后，暴露区域外的肿瘤细胞受到 DOX 和高温以进一步降低细胞活力（图 12b）。综上所述，DOX@NrGO被证明是肿瘤治疗的理想候选者。

不同处理下肿瘤细胞的 PI 染色。 一 控制。 b DOX@NrGO+NIR

结论

总之，通过GO与氨基封端的HBP的简单反应，设计并成功制备了新型亲水性NrGO。各种表征表明，NrGO 获得了稳定且出色的光热性能。 DOX 加载后，药物递送呈现 pH 和光热双重响应行为，在低 pH 值和 NIR 照射下可以加速。此外，体外细胞毒实验结果表明，所制备的 NrGO 具有良好的生物相容性。由于其优势，基于化学-光热协同治疗可以有效抑制肿瘤细胞，抗肿瘤药物NrGO在肿瘤治疗中获得了良好的应用。

缩写

CLSM：

共聚焦激光扫描显微镜

DAPI：

4',6-二脒基-2-苯基吲哚

DOX：

阿霉素

DOX@NrGO：

加载 DOX 的 NrGO

FTIR：

傅里叶变换红外

开始：

氧化石墨烯

HBP：

超支化聚合物

MTT：

甲基噻唑基四唑

NHBP：

氨基封端的HBP

近红外：

近红外

NrGO：

端氨基超支化聚合物还原氧化石墨烯

PI：

碘化丙啶

PTT：

光热疗法

rGO：

还原氧化石墨烯

SEM：

扫描电镜

TEM：

透射电子显微镜