131I 标记的抗 VEGFR2 靶向介孔二氧化硅纳米颗粒在甲状腺未分化癌中的抗肿瘤作用

背景

甲状腺未分化癌（ATC）仅占所有甲状腺癌的 2% 左右；然而，它是一种局部侵袭性肿瘤，具有很高的远处转移率。一般来说，ATC 患者的中位生存期约为 6 个月，由于侵袭性区域疾病侵犯颈部组织和淋巴结和/或肺转移引起血管灾难和气道塌陷，只有 20% 的患者在诊断后存活 1 年 [1] , 2]。 Radioiodine-131 ( ¹³¹ I) 在分化型甲状腺癌 (DTC) 转移灶的诊断和治疗中起重要作用 [3,4,5]。但是，常规的 ¹³¹ I 治疗方式不适合 ATC，因为其非碘浓缩特性[6]。

血管生成是促进癌细胞存活、生长、迁移和转移的主要因素。血管内皮生长因子 (VEGF) 是血管生成中重要的调节细胞因子，在 ATC 的发生发展中起重要作用。 VEGF 在血管生成中的公认作用意味着已成功开发放射性标记配体，例如靶向 VEGF 受体 (VEGFR) 的贝伐单抗，用于使用正电子发射断层扫描 (PET) 和单光子发射计算机断层扫描进行早期和灵敏的病变检测。 SPECT) 成像技术。 VEGFR-2在血管内皮细胞中发挥VEGF的大部分功能，通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路、内皮血管迁移、促进血管生成和血管生长而负责增殖[7, 8] ]。与正常甲状腺组织相比，来自上皮来源的 ATC 细胞中 VEGF 的表达上调 [9,10,11]。已经开发出抗 VEGF 策略来抑制新血管的生长并使肿瘤缺乏必要的氧气和营养。多项临床前研究已开发出针对 ATC 中 VEGFR2 的药物，并取得了不同程度的成功 [12,13,14,15]。然而，与这些抗癌药物相关的主要挑战之一是它们的低生物利用度和低效递送至靶位点。许多抗癌药物是疏水性的，需要生物相容性药物递送系统来提高其生物利用度并便于静脉给药。

纳米颗粒，包括基于金属、聚合物和脂质的纳米颗粒，可用于将治疗剂与显像剂结合。靶向配体/部分，例如肽、抗体、放射性核素或抗体片段，可以连接到纳米粒子上以提高它们的治疗效果。对于癌症治疗，纳米粒子可以通过增强的渗透性和保留效应在肿瘤区域积聚，并能够以更局部的方式递送治疗剂。多年来，在材料科学和工程中，二氧化硅被认为是一种通用且相对安全的材料，因为它提供了多种可用的物理和化学修饰，以及良好的生物相容性 [16]。美国食品和药物管理局 (FDA) 承认二氧化硅“总体安全”[17, 18]。在各种二氧化硅基材料中，介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs）作为一类纳米材料脱颖而出，具有许多独特的优点，如无毒、良好的表面渗透性、高表面积、可调的孔结构、优异的物理化学稳定性、和可化学修饰的表面，所有这些都使它们成为各种化学试剂和/或治疗药物的潜在宿主 [19]。类似地，介孔碳纳米材料已被证明是药物递送方面的出色纳米载体 [20,21,22]。近年来，MSNs 领域的努力集中在结合治疗和成像能力。用成像探针标记纳米粒子是实现其体外和体内跟踪的宝贵工具。目前，靶向治疗是 ATC 治疗的一种令人鼓舞的策略 [23, 24]。

受 VEGFR 靶向治疗和分子成像在癌症研究中的关键作用以及 MSN 提供的优势的启发，在本研究中，我们开发了一种基于 MSN 表面工程的抗 VEGFR2 靶向潜在治疗诊断纳米平台，用于同步无创 SPECT 成像和体内增强 ¹³¹ 我治疗效果。我们的目的是确定 ¹³¹ I标记的抗VEGFR2靶向MSNs在ATC荷瘤裸鼠模型中具有抗肿瘤功效，随后进行了广泛的体内、体外和离体研究。

材料和方法

材料

Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco（美国加利福尼亚州）。抗生素（青霉素 G、链霉素和制霉菌素）购自鼎果生物科技有限公司（中国北京）。十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、原硅酸四乙酯 (TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)、二甲亚砜 (DMSO)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)、N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和异硫氰酸荧光素 (FITC) 购自 Sigma-Aldrich（德国）。钠 ¹³¹ 我是从 Atomic Hitech（中国北京）购买的。抗 VEGFR2 抗体购自 Abcam Co. Ltd.（英国）。

特征

将纳米颗粒分散在乙醇中，形成悬浮液，沉积在碳涂层铜网上，干燥至少 24 小时。使用透射电子显微镜 (TEM)（JEOL-100CXII，日本）在 200 kV 的加速电压下确定纳米颗粒的形态。使用 Zetasizer (Nano ZS90, UK) 使用动态光散射 (DLS) 测量样品的 zeta 电位和流体动力学直径。 MSNs的孔径分布和表面积通过Brunauer-Emmett-Teller（BET）和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）分析（ASAP2020M，美国）表征。

细胞培养

人 ATC 细胞系 FRO [25]（购自北京协和北京医学院基础医学研究所细胞资源中心）在 37°C 的加湿培养箱中与5% CO2 和 95% 空气，并辅以 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。隔日换液，细胞汇合后胰蛋白酶传代。每次实验前将细胞预培养至约80%汇合。

二氧化硅纳米粒子的制备和表面改性

MSN 和胺化的合成

MSN 的合成如之前报道的 [26]。简而言之，在 70°C 下连续搅拌下，将 50 毫克 CTAB 加入圆底烧瓶中的 25 毫升水、5 毫升乙醇和 100 微升 2 M NaOH 溶液的混合物中。然后，将 200 μL TEOS 添加到混合物中并反应 1 小时。然后将反应溶液离心并用乙醇以 10,000 rpm 洗涤五次。接下来，将产物重新悬浮在 10 mL 乙醇中。去除 CTAB 模板后，将产物重新悬浮在 5 mL DMSO 和 100 μL APTES 中，将其逐滴添加到所得混合物中以通过胺化修饰二氧化硅表面。搅拌过夜后，离心分离沉淀，乙醇洗涤5次，即得MSNs-NH2。

BSA-MSNs-Anti-VEGFR2的合成

将 5 毫克牛血清白蛋白 (BSA) 和 50 μL 抗 VEGFR2 抗体加入上述产物 (MSNs-NH2, 50 mg) 中并在搅拌下反应 2 小时。将混合物用水洗涤五次，然后将 1.1mg NHS 和 1.6mg EDC 添加到混合物中并在室温下在 5mL 水中搅拌过夜。离心分离沉淀物，水洗5次，成功获得BSA-MSNs-anti-VEGFR2。

¹³¹ I 纳米粒子的放射性标记

用 ¹³¹ 对制备的纳米粒子进行放射性标记 我使用氯胺-T 方法（表示为 ¹³¹ I-BSA-MSN 和 ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2，分别）[27]。简而言之，大约 100 μg BSA-MSNs 或 BSA-MSNs-anti-VEGFR2 用 100 μL 磷酸盐缓冲液 (PB) 和 74 MBq ¹³¹ 稀释 我被加了。然后将氯胺-T（100 μL；5 mg/mL 在 PB 中）添加到混合物中。振荡和孵育 60 秒后，通过添加 100 μL 焦亚硫酸钠（PB 中 5 mg/mL）停止反应。离心管用于从低分子量化合物中分离标记的 BSA-MSNs 和 BSA-MSNs-anti-VEGFR2。 ¹³¹ 的标记率和放射化学纯度 用薄层色谱法测定I标记的纳米颗粒。

体外细胞摄取：共聚焦显微镜研究

首先，MSNs-anti-VEGFR2 和 MSNs 用 FITC 标记 [28]。简而言之，将 MSNs-NH2（100 毫克）加入到 1 毫升 FITC 酒精溶液（1 毫克/毫升）中，并在搅拌下静置 4 小时。 FITC 标记的 MSNs (FITC-MSNs) 通过离心获得并在真空中干燥。 FITC-MSNs-anti-VEGFR2也可以用同样的方法获得。

FRO细胞在6孔板中接种过夜，然后5 × 10 ⁵ 每个孔中的细胞与 FITC-MSNs 和 FITC-MSNs-anti-VEGFR2 分别在 37°C 下孵育 1 小时和 6 小时。细胞用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤 3 次，然后用 70% 乙醇固定 20 分钟。此外，细胞用 PBS 洗涤 3 次，细胞核用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色 45 分钟，然后用多聚甲醛（PBS 中 4%）固定。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）（Zeiss LSM 510，USA）获取共聚焦显微镜图像。

时间依赖性细胞摄取

为了测量纳米颗粒的时间依赖性细胞碘 131 摄取，1 × 10 ⁵ 每孔细胞用 3.7 MBq/mL 游离 Na ¹³¹ 培养 我， ¹³¹ I-BSA-MSN 或 ¹³¹ I-BSA-MSNs-抗-VEGFR2，分别。然后用 1 mL 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 缓冲溶液尽快洗涤细胞，用胰蛋白酶分离，并在 1 mL HBSS 中重新悬浮 1、2、3、5、7 和 9 小时。使用γ计数器（LKB gamma 1261，澳大利亚）测量放射性。所有实验均进行3次以获得准确数据。

动物模型

Balb/c 裸鼠（雌性，约 4 周龄，体重 15-20 g）购自北京协和医学院北京实验动物研究中心，饲养在无特定病原体条件下，相对湿度（30-70 %) 和温控 (20–24 °C) 环境，位于中国天津医科大学实验动物中心。所有动物处理程序均按照天津医科大学总医院伦理委员会批准的方案进行。皮下注射5 × 10 ⁶ 诱导FRO肿瘤异种移植 将 50 μL PBS 中的 FRO 细胞注入小鼠右肩。

体内成像

当荷瘤裸鼠饲养1-2周，肿瘤体积达到直径约10mm时，将小鼠随机分为三组（Na ¹³¹ 我， ¹³¹ I-BSA-MSN 和 ¹³¹ I-BSA-MSNs-抗-VEGFR2)。每组收到 7.4 MBq ¹³¹ 我通过瘤内注射评估 ¹³¹ 的器官定位 I 标记的纳米粒子。分别在注射药物后 1、2、3、7、14 和 21 天进行闪烁成像。每次扫描前，裸鼠用 4% 水合氯醛 (150 μL) 麻醉，俯卧，然后使用 SPECT/CT 扫描仪（Discovery NM/CT 670，美国）成像。为避免甲状腺组织暴露于不必要的辐射和成像，在实验前 1 天，将高氯酸钠 (0.05 毫克/毫升) 添加到所有小鼠的饮用水中并维持 1 周。

组织分布

在肿瘤内注射 7.4 MBq ¹³¹ 后 24 和 72 小时 I标记的纳米粒子，每组小鼠（n =3/组）颈椎脱臼处死，取心、脾、肾、肝、肠、肺、肿瘤组织称重。使用γ计数器（LKB gamma 1261，澳大利亚）测量各器官的放射性，放射性表示为每克组织注射剂量的百分比（%ID/g）。

体内 ¹³¹ 我疗法

与体内成像类似，三组的小鼠被瘤内注射了剂量为 74 MBq (50 μL) 的 ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2, ¹³¹ I-BSA-MSN 和 Na ¹³¹ 当肿瘤体积达到直径约 10 毫米时。给予相同体积的生理盐水作为对照组。使用以下公式估计肿瘤体积：体积 =4π/3（1/2长× 1/2宽× 1/2高）[15, 29]。每 3 天测量一次肿瘤体积和动物体重。如果小鼠体重减轻超过 20% 或濒临死亡，则对其实施安乐死。

组织学检查

实验结束后，处死小鼠，分离出心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺四组的肿瘤和正常组织，进行组织病理学研究。简而言之，使用两次二甲苯孵育（每次 56°C 30 分钟）对 5 毫米厚的石蜡切片进行脱蜡，然后在乙醇中再水化。然后将切片在蒸馏水中的 10% 蔗糖中浸泡过夜。此后，将切片在 0.1 M PBS，pH 7.4 中洗涤，在甲醇中的 1.2% 过氧化氢中温育 30 分钟，并在 0.1 M PBS，pH 7.4 中漂洗 15 分钟。然后将肿瘤载玻片在潮湿室中在室温下用抗 VEGFR2 抗体稀释 1:100 孵育过夜。用 PBS 洗涤 3 次后，将载玻片与 DAKO-REALTM En-Vision™ 检测系统孵育 60 分钟，然后使用二氨基联苯胺显色并用 Mayer 苏木精复染。所有图像均使用奥林巴斯显微镜获取。

统计分析

所有数据均表示为平均值 ± 标准偏差（SD），并使用SPSS（社会科学统计包）12.0 for windows（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析。使用 Kaplan-Meier 曲线和对数秩检验进行数据分析。所有的统计检验都是双尾的，一个 P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

纳米粒子的特性

通过 TEM 和 DLS 分析和确定纳米粒子的特性（图 1a-c）。 TEM 图像表明 MSNs 具有均匀的球形形态，DLS 图像表明 MSNs 尺寸为 108 ± 5.9 nm。 BSA 修饰和/或抗 VEGFR2 靶向不会改变纳米粒子的形态，与未修饰的 MSN 相比，仅导致溶液中轻微的聚集趋势，这可能是由纳米复合物的表面积增加引起的。 BSA-MSNs-anti-VEGFR2的直径略微增加到163 ± 4.6 nm，MSNs的平均zeta电位为- 23.91 mV，BSA-MSNs-anti-VEGFR2变为28.45 mV。 zeta 电位的变化和表面改性后尺寸的增加表明在每个步骤中在 MSN 的表面上成功添加了 BSA 和抗 VEGFR2（表 1）。氮吸附-解吸等温线进一步证实了 MSN 的结构特征。 MSNs 具有明确的介孔结构，表面积为 630.2 m ² /g，平均孔径为 2.8 nm（图 1d）。对 BSA-MSNs-anti-VEGFR2 纳米颗粒的稳定性进行了数周的监测，没有观察到明显的聚集。 ¹³¹ 的比例 I 标记约为 50-75%。

纳米粒子的特性。 MSN 的特征 (a ), BSA-MSN (b ), BSA-MSNs-anti-VEGFR2 (c )，以及 MSNs 的氮吸附-解吸等温线和 Barrett-Joyner-Halenda (BJH) 孔径分布曲线 (d ）。透射电子显微镜图像显示均具有规则（均匀球形）形态。动态光散射图像显示它们都是均匀的，平均尺寸分​​别为 108 nm、139 nm 和 163 nm。 BET和BJH分析显示典型的IV型等温线，与介孔结构一致

构建纳米粒子的吸收

使用共聚焦显微镜检测 BSA-MSN 和 BSA-MSN-抗 VEGFR2 与靶人 ATC 细胞系 FRO 细胞的结合（图 2）。免疫荧光显示靶向和非靶向 MSN 均可有效结合 FRO 细胞。与 BSA-MSNs 或 BSA-MSNs-anti-VEGFR2 孵育 1 小时后，细胞中出现可见荧光，并在孵育 6 小时后保持并增强。与 BSA-MSNs-anti-VEGFR2 相比，BSA-MSNs 也可以与细胞结合，但我们发现肿瘤细胞滞留很小，绿色荧光信号较弱。该结果表明通过抗VEGFR2抗体的修饰增强了纳米颗粒的靶向能力。

吸收构建的纳米粒子。共聚焦激光扫描显微镜图像显示，对于 BSA-MSNs 和 BSA-MSNs-anti-VEGFR2，不同制剂在 1 和 6 小时的细胞内化。两组的 1 小时荧光信号在 6 小时时增加。此外，在两个时间点，抗VEGFR2靶向组的结合绿色荧光均强于非靶向组

时间依赖性细胞摄取

为了测定 Na ¹³¹ 的放射性碘吸收 我， ¹³¹ I-BSA-MSN 和 ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 随着时间的推移， ¹³¹ 在 FRO 细胞中获得 I 定时活动测量值。如图 3a 所示， ¹³¹ 在与 ¹³¹ 孵育 3 小时后，我对该细胞系的摄取达到了最大水平 I-BSA-MSN 和 ¹³¹ 5 小时后 I-BSA-MSNs-抗-VEGFR2。此外， ¹³¹ 的放射性碘吸收 I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2高于 ¹³¹ I-BSA-MSN。

时间依赖性细胞摄取和组织分布。 一 关于时间依赖性细胞摄取的数据表示为三组的平均值 ± SD。 b ¹³¹ 生物分布数据比较 瘤内注射 Na ¹³¹ 后 24 和 72 小时，ATC 荷瘤小鼠的肿瘤和主要器官中的 I 我， ¹³¹ I-BSA-MSN 和 ¹³¹ I-BSA-MSNs-抗-VEGFR2。抗VEGFR2靶向组在瘤内注射后24小时和72小时的肿瘤组织放射活性（分别为32.2 ± 2.8% ID/g和23.0 ± 1.8% ID/g）显着高于非靶向组（26.1 ±1.8% ID/g）分别为 2.5% ID/g 和 12.3 ± 1.2% ID/g）（所有 P <0.05)。数据也表示为三组的平均值 ± SD

组织分布

¹³¹ 的组织分布 使用 γ 测量裸鼠中的 I 在肿瘤内注射相应药物后 24 和 72 小时计数器（图 3b）。结果显示，三组在 24 和 72 小时的正常组织中具有相似的辐射积累。随着时间的推移，所有组的放射性逐渐下降，并且主要在肿瘤中积累。此外， ¹³¹ 两组在注射后24小时和72小时肿瘤组织中的积累 I 标记的纳米粒子远高于 Na ¹³¹ I 组，在 24 小时时为 11.6 ± 0.9% ID/g，并在 72 小时时急剧下降至 2.1 ± 0.08% ID/g。然而，注射后24小时和72小时，抗VEGFR2靶向组在肿瘤中的浓度分别为32.2 ± 2.8% ID/g和23.0 ± 1.8% ID/g，显着高于非靶向组。目标组（分别为 26.1 ± 2.5% ID/g 和 12.3 ± 1.2% ID/g，所有 P <0.05).

体内成像

确定 ¹³¹ I 纳米颗粒的吸收和分布观察 ¹³¹ 的停留时间 在体内肿瘤组织中，在瘤内注射相应药物后的不同时间点获得 FRO 荷瘤小鼠的代表性 SPECT/CT 图像（图 4a）。结果表明，Na ¹³¹ I组在注射后2天迅速从肿瘤中排出，注射后3天未见。相比之下， ¹³¹ 的两组 即使在注射后 2 周，I 标记的纳米粒子的血液清除速度也较慢，并且在肿瘤组织中的积累较多，尤其是在抗 VEGFR2 靶向组中。值得注意的是，注射后3周，靶向组的放射性明显强于非靶向组。

体内成像，体内 ¹³¹ I 治疗和生存分析。 一 瘤内注射相应药物后不同时间点获得的 ATC 荷瘤小鼠的 SPECT/CT 融合图像和三维图像。 Na ¹³¹ 中放射性积累 在注射后 3 天未看到 I 组，但在抗 VEGFR2 靶向组中即使在注射后 3 周时也很明显。肿瘤体积 (b ), 体重 (c ) 变化，以及 Kaplan-Meier 生存曲线 (d ) 在 FRO ATC 异种移植模型 (n =6/组）。与非靶向组相比，靶向组的肿瘤生长和体重减轻明显受到抑制，Na ¹³¹ I，或生理盐水组，分别。数据表示为三组的平均值 ± 标准差，均为P < 0.05。此外，与非靶向组（34 天）或 Na ¹³¹ 相比，靶向组的中位生存时间（41 天）显着延长 I（25 天）组（所有 P < 0.01)

体内 ¹³¹ 我疗法

图 4b 显示了四组中随时间变化的平均肿瘤体积。注射前的肿瘤体积用作初始参考。除了 ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2组，各组肿瘤逐渐生长，尤其是Na ¹³¹ 我和生理盐水组。在第 24 天，Na ¹³¹ 中的平均肿瘤体积 I组和生理盐水组分别为296.6 ± 24.2%和278.3 ± 19.3%，而 ¹³¹ 组为198.7 ± 13.2% I-BSA-MSNs 组在第 30 天。有趣的是，我们观察到抗 VEGFR2 靶向组的体积在注射后第 9 天后缓慢减少，并且在观察结束时几乎下降到初始参考值。

图 4c 显示了四组体重的变化。 Na ¹³¹ 组体重逐渐下降 观察期间I组和生理盐水组。然而，其他两组仅在第一周体重减轻，在以后的时间点恢复，尤其是抗VEGFR2靶向组。

生存分析

在这项研究中，我们使用生存概率作为另一个指标来评估 ¹³¹ 的治疗效果 I 标记的纳米粒子。图 4d 显示了用盐水、Na ¹³¹ 处理后的 Kaplan-Meier 存活曲线 我， ¹³¹ I-BSA-MSN 或 ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 在 ATC 荷瘤裸鼠模型中。肿瘤在生理盐水和Na ¹³¹ 中进展迅速 I 组，中位生存时间分别为 27 天和 25 天。对数秩检验的分析表明， ¹³¹ 的中位生存时间 I-BSA-MSNs 组（34 天）与 Na ¹³¹ 相比显着延长 I 组 (P < 0.001）。此外，我们发现抗 VEGFR2 靶向组（中位生存时间，41 天）的治疗结果显着优于非靶向组（P <0.01).

组织病理学分析

评价 ¹³¹ 的抗肿瘤作用 I-标记的纳米粒子并测试MSNs对小鼠的潜在毒性，放疗后收集主要器官和肿瘤进行苏木精和伊红染色。荷瘤小鼠经 ¹³¹ 治疗后，重要器官未见明显病理改变 I 标记的纳米粒子（图 5a）。这表明在观察期内没有发生明显的全身毒性。此外，用 ¹³¹ 治疗的肿瘤 I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2显示肿瘤细胞变性和大量坏死，比 ¹³¹ 更明显 I-BSA-MSNs 组。然而，用Na ¹³¹ 治疗的肿瘤 I或生理盐水组充满了活的肿瘤细胞。肿瘤的免疫组织化学分析显示 VEGFR 的可见表达（图 5b）。

组织病理学分析。 一 ¹³¹ 治疗FRO ATC荷瘤小鼠主要器官的组织病理学分析 I 标记的纳米粒子。心、肝、肺、肾未见明显病理改变。 b 小鼠肿瘤的病理学检查（H &E 染色）和免疫组织化学分析。抗VEGFR2靶向组肿瘤细胞变性坏死的大碎片和 ¹³¹ 中小块低密度坏死 显示 I-BSA-MSNs 组。相比之下，在 Na ¹³¹ 中仅观察到存活的肿瘤细胞。 我和生理盐水组。免疫组织化学分析的显微照片显示 VEGFR 的可见表达。 Bar =200 μm

讨论

ATC 的预后仍然很差，目前还没有有效的治疗选择 [1, 2, 6]。靶向分子疗法作为一种新型疗法，已经改善了许多癌症的发病率和死亡率 [23, 24]。 VEGFR 对微血管形成至关重要，微血管形成促进大多数恶性肿瘤的生长，并允许肿瘤持续扩张 [9, 10]。 In this study, we evaluated the efficacies of Na ¹³¹ I, ¹³¹ I-BSA-MSNs, and ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 for the treatment of ATC in tumor-bearing nude mouse models. The results demonstrated that both anti-VEGFR2 targeted and non-targeted nanoparticles labeled with ¹³¹ I were effective in delaying the tumor growth of ATC and that the ¹³¹ I-labeling anti-VEGFR2 targeted MSNs was the most effective agent to inhibit the tumor growth in nude mice and prolonging median survival. This treatment modality might represent a novel therapeutic option for ATC.

VEGFR targeting with nanoparticles is rarely reported in the literature. Goel S et al. [19] confirmed that VEGFR targeting using VEGF121 conjugated, anti-VEGFR therapeutics-loaded MSNs represented a major advance for angiogenesis imaging and inhibition in human glioblastoma. A study performed by Gule indicated that inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR) and VEGFR2 in ATC using vandetanib causes significant tumor growth inhibition in vivo in an orthotopic xenograft model [15]. In the present study, using confocal microscopy, we found that both targeted and non-targeted nanoparticles could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells, and further confirmed that the targeting ability of the nanoparticles was enhanced via modification with the anti-VEGFR2 antibody, which result was consistent with that of the time-dependent cellular uptake experiment. Additionally, after intratumoral injection with the respective drugs, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I in the tumor-bearing nude mice at 24 and 72 h for the different groups. The radioactivity for all groups was mostly accumulated in the tumor and gradually decreased with time. Moreover, we found that the radioactivity in anti-VEGFR2 targeted group could be retained for longer time in the tumor in comparison with non-targeted group, which was also consistent with the results observed by confocal microscopy.

SPECT/CT is a powerful tool to provide both structural and functional imaging information for diseases, and can monitor the metabolism of radioactive drugs at different times post injection [30,31,32]. In the present study, we compared data on the tissue distribution of ¹³¹ I using SPECT/CT. The results showed that radioactive accumulation in the Na ¹³¹ I group was not seen at 3 day post-injection. However, higher accumulation in the tumor tissue was observed at 2 weeks post-injection for the two groups with ¹³¹ I-labeled nanoparticles, and at 3 weeks the radioactive signal in the anti-VEGFR2 targeted group was apparently stronger than that in the non-targeted group. We hypothesized that the passive tumor targeting of MSNs, which relies on unpredictable tumor extravasation and enhanced permeability retention effect, and positive targeting linked with anti-VEGFR-2, associated with VEGFR2 overexpression in ATC, played a key role in enhancing the retention of the nanoparticles in the tumors. This finding revealed that anti-VEGFR2 modification prolonged the retention time of ¹³¹ I in the tumor tissue compared with that of free Na ¹³¹ I and ¹³¹ I-BSA-MSN, which was also similar to the tissue biodistribution of ¹³¹ I measured by γ counter.

In the present study, we monitored the body weight change of nude mice after intratumoral injection with a single dose of 2 mCi ¹³¹ I, which showed that the body weight in the ¹³¹ I-labeled nanoparticle groups gradually increased at 1 week post-injection, especially for the anti-VEGFR2 targeted group. Similarly, we also observed the changes in tumor volume and found that the tumors in the Na ¹³¹ I or saline group grew rapidly, while the volume in ¹³¹ I-BSA-MSNs group increased slowly. Interestingly, the tumors in anti-VEGFR2 targeted group gradually decreased after 1 week post-injection, which was contrary to the body weight change. These results indicated that the anti-VEGFR2 modification could effectively inhibit the increase in tumor volume and thereby enhanced the efficiency of ¹³¹ I therapy. We considered that the tumor necrosis was caused by the beta rays emitted from ¹³¹ I, which resulted in tumor shrinkage and indirectly led to an increase in body weight. This effect, we speculated, began to appear mainly 1 week after injection of ¹³¹ I.

Our findings indicated that the treatment mediated by intratumorally injected ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 resulted in significant tumor growth delay, which was confirmed increased structural damage and massive necrosis in tumor tissue compared with that in the ¹³¹ I-BSA-MSNs group. Significantly, this higher antitumor activity was achieved without causing apparent systemic toxic effects, as indicated by the lack of significant pathological changes in the vital organs observed in tumor-bearing nude mice. Although further studies are needed to document both the acute and chronic toxicological effects, ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 exhibited several properties that made them a promising candidate for minimally invasive therapy for ATC.

In our pre-experiment, injection into the tail vein was performed and the results showed that the radioactivity was mainly distributed in the phagocytosis system. Intratumoral injection was used in some studies [29, 33, 34], and the operation is more convenient. Therefore, we used intratumoral injection as the injection method and also achieved better results. MSNs offer a promising approach to overcome the insolubility issue and deliver large payloads of hydrophobic small molecule drugs. Currently, we are investigating the potential for loading targeted anti-cancer drugs using MSNs. We will provide the results in the future publication.

Conclusions

In the present study, we successfully synthesized BSA-MSNs-anti-VEGFR2, with uniform spherical morphology, and which were radiolabeled with ¹³¹ I using the Chloramine-T method. The results showed that both targeted and non-targeted MSNs could efficiently bind to the cytoplasm and cytoplast of FRO cells. The radioactivity in ATC tumor-bearing nude mouse model was mostly accumulated in the tumor and could be retained a longer time in the ¹³¹ I-BSA-MSNs-anti-VEGFR2 group. Additionally, the tissue distribution of ¹³¹ I could be also imaged and validated using SPECT/CT. Moreover, tumor growth in the ATC tumor-bearing nude mouse model was significantly inhibited by the anti-VEGFR2 targeted MSNs compared with that achieved using non-targeted MSNs and the ¹³¹ I treatment with anti-VEGFR2 targeting MSNs significantly prolonged the survival of ATC tumor-bearing mice. Our data supported the view that such an approach may represent a more effective means to treat ATC.

缩写

APTES：

Aminopropyltriethoxysilane

ATC:

anaplastic thyroid cancer

BSA：

牛血清白蛋白

CLSM：

共聚焦激光扫描显微镜

CTAB：

Hexadecyltrimethylammonium bromide

DAPI:

4,6-Diamidino-2-phenylindole

DLS：

动态光散射

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle medium

DMSO：

二甲亚砜

EDC:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride

FBS：

胎牛血清

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HBSS:

Hanks’ balanced salt solution

MSNs:

Mesoporous silica nanoparticles

NHS:

N -hydroxysuccinimide

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

TEM：

透射电子显微镜

TEOS：

原硅酸四乙酯

VEGFR:

血管内皮生长因子受体