肿瘤靶向和生物相容性 MoSe2 纳米点@白蛋白纳米球作为协同光热放射治疗的双模态治疗剂

背景

在全球范围内，女性乳腺癌的发病率非常高，并且以其低存活率和高转移和复发率而臭名昭著 [1,2,3]。手术切除、放疗 (RT) 和化疗是实践中常用的治疗策略，尽管这些疗法存在缺陷 [4]。放疗是一种非常有效的疗法，但对正常组织也有害。已经探索了 RT 以增强治疗效果，同时减少其有害影响。 RT 使用电离辐射（例如，γ 射线、X 射线）将水分子电离成活性自由基，从而局部破坏癌细胞中的 DNA，甚至在深层区域 [5]。由于据报道肿瘤微环境缺氧，这被认为是放疗的主要障碍之一 [6, 7]。鉴于这些缺点，据报道将放疗与其他方式的治疗策略相结合可有效增强治疗效果。迄今为止，光热疗法 (PTT) 作为一种微创癌症治疗方法已被广泛探索，因为它具有副作用少、特异性高、对正常组织副作用小的特点 [8,9,10,11,12,13,14,15 ]。然而，由于肿瘤抑制不完全，尤其是对于难以接近的肿瘤，单独的 PTT 通常是不够的，这可能会导致肿瘤复发 [16,17,18]。有趣的是，据报道 PTT 会导致近红外 (NIR) 诱导的热疗增加肿瘤内血液循环，随后增加肿瘤微环境中的氧气供应，导致细胞对 RT 更敏感 [19,20,21]。放疗与PTT结合可结合两者的优点，有利于提高癌症的治疗效果。

最近，二维 (2D) 层状过渡金属二硫属化物 (TMD)，如 MoS2、WS2、ReS2 等，已被用作 NIR 吸附剂或放射增敏剂，以提高 PTT 或 RT 的功效。到它们的物理特性 [7, 19, 21]。沉和合著者报告了自下而上制备均匀超薄 ReS2 纳米片的方法，用于图像引导的高效 PTT 和 RT [21]。除了这些 TMD，硒化钼 (MoSe2) 已被报道为 PTT 的 NIR 光热传感器 [22, 23]。由于单独的 PTT 有其缺点，因此有更多的理由利用 MoSe2 的特性，如放射增敏，以更好地治疗癌症。

在这项工作中，我们首先制备了超小 MoSe2 纳米点，然后将其与牛血清白蛋白 (BSA) 组装成纳米球 (NSs)，最后通过聚乙二醇 (PEG) 与肿瘤靶向分子叶酸 (FA) 结合“桥梁。”除了强大的光热效应外，所获得的 FA-MoSe2@BSA NSs 还具有优异的辐射敏化性能。 BSA 修饰赋予 MoSe2 纳米点 (NDs) 优异的生理稳定性和生物相容性。体内外实验表明，FA-MoSe2@BSA NSs具有良好的肿瘤靶向作用，同时作为近红外光热剂和放射增敏剂用于协同光热放疗，对健康组织无毒性。

方法

材料

FA-PEG5000-NHS 和 CH3-PEG5000-NHS 购自 Shanghai Ponsure Biotech。 Co. Ltd. 异硫氰酸荧光素 (FITC)、牛血清白蛋白（BSA，纯化率≥ 98.0%）、MoSe2 散装粉末和钙黄绿素-AM (CA)-碘化丙啶 (PI) 染色剂购自 Sigma-Aldrich（圣路易斯） , Mo, 美国）。 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自阿拉丁（中国上海）。细胞培养试剂均由康宁公司提供。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）由Dojindo Laboratories（日本）提供。 γ-H2AX 抗体由 Millipore (Temecula, CA) 提供。

FA-MoSe2@BSA NSs 的制备

首先，在典型程序中，将 50 mg MoSe2 粉末加入 25 mL 蒸馏水中并搅拌 20 分钟，然后在冰浴中使用尖端超声处理（Scientz-IID，950 W，25 kHz）进行超声处理。超声处理脉冲持续 2 秒和 3 秒，总超声处理时间为 12 小时，振幅为 70%。之后，将混合物以 6000 rpm 离心 25 分钟。收集上清液并再次以 12,000 rpm 离心 30 分钟，得到 MoSe2 纳米点 (MoSe2 ND) 溶液。之后，将25mg BSA粉末加入上述上清液中并轻微搅拌，在25°C和pH =7.4下搅拌6小时后形成硬化的凝聚层，然后与0.5%戊二醛（250 μL）交联处理。然后，通过在水中透析 1 天去除戊二醛，产生 MoSe2@BSA 纳米球（MoSe2@BSA NSs）。接下来，将 MoSe2@BSA 纳米球分成两部分，一份与 FA-PEG5000-NHS（8 mg）混合，另一份与 CH3-PEG5000-NHS（8mg）溶液混合并搅拌 2 小时。最后，将溶液在水中透析，得到纯化的 FA-MoSe2@BSA NSs 和 MoSe2@BSA NSs 溶液。制备的溶液储存在 4°C。此外，UV-VIS 光谱仪用于量化 FA-MoSe2@BSA NSs 上的 FA。具体而言，将 MoSe2@BSA 纳米球与 FA-PEG5000-NHS（8 毫克）混合并反应 2 小时后，将混合物离心以去除未结合的 FA。收集上清液用于吸收检测。 FA 浓度由紫外可见分光光度计在 FA 吸收峰波长 (280 nm) 处检测。 FA 包封率 (EE) 的计算公式如下：

FA-MoSe2@BSA NSs 的表征

通过透射电子显微镜（TEM，JEOL JEM2011，Tokyo，Japan）和扫描电子显微镜（SEM，Hitachi FE-SEM S-9300，Janpan）观察样品的形貌。 Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK) 用于测量尺寸和 zeta 电位。紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱在UV2550紫外-可见分光光度计（Shimadzu，Kyoto，Japan）上记录。傅里叶变换红外 (FTIR) 光谱由 FTIR 光谱仪 (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Germany) 检测。通过X射线衍射仪（Seifert Jso-Debyerex-2002，德国）记录纳米球的X射线粉末衍射（XRD）。通过电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES，Hitachi P4010，日本）测量细胞和组织中Mo的含量。在 NIR 照射期间，使用热电偶温度计（Fluke，美国）每 30 秒记录一次温度变化。

细胞培养和细胞摄取

小鼠乳腺肿瘤 4T1 细胞购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，并在补充有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中在 37°C 和 5% CO2 中培养。

对于细胞摄取，FITC 用于通过物理吸收标记 NS。 4T1 细胞粘附在 6 孔板的载玻片上，并与游离 FITC、MoSe2@BSA NSs、FA-MoSe2@BSA NSs + FA 和 FA-MoSe2@BSA NSs 以相同浓度的 FITC（0.05 mg/mL ) 分别为 3 小时。然后用 PBS 洗涤细胞三次并用 0.2 mL 戊二醛固定，然后用 DAPI 染色 10 分钟。使用激光扫描显微镜捕获细胞的荧光图像。为了进一步观察细胞摄取，4T1细胞（2 × 10 ⁵ 细胞/孔）在 6 孔细胞培养板中培养 24 小时，然后与 MoSe2@BSA NSs、FA-MoSe2@BSA NSs + FA 和 FA-MoSe2@BSA NSs 再孵育 3 小时。之后，将处理过的细胞用 PBS 轻轻洗涤 3 次，匀浆，用 1 mL 王水溶液处理 4 h。 ICP-AES 用于检测细胞内的 Mo 含量。摄取率 =\( \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} \)× 100%，其中 Ma 为细胞内 Mo 的质量，Mb 为 Mo 总添加量。

体外生物相容性

首先，采集健康小鼠全血，检测FA-MoSe2@BSA NSs的体外溶血情况。具体而言，通过离心收集红细胞 (RBC)。丢弃上清液，将收集的 RBC 与 FA-MoSe2@BSA NSs（在 PBS 中，1:4）以预定浓度（50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL 和 400微克/毫升）。作为阳性或阴性对照，红细胞与去离子水或 PBS 一起孵育。在 37°C 静置孵育 1 小时后，将上述悬浮液组离心（10,000 转/分钟，1 分钟），并通过紫外-可见分光光度计监测 541 nm 处的上清液的吸光度。溶血率按下式计算。

其中 A t , A 电脑 , 和 A nc 分别为待测样品、阳性对照和阴性对照的上清液在 541 nm 处的吸光度。

此外，MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 的细胞毒性通过标准 CCK-8 测定进行检测。 4T1 细胞 (1 × 10 ⁵ 细胞/毫升，0.5 毫升）接种在 96 孔板中并培养 24 小时。丢弃旧培养基后，将含有 0.01、0.1、0.15、0.3 和 0.4 mg/mL MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 的新鲜培养基与 4T1 细胞孵育 24 小时。 PBS温和洗涤细胞3次。然后将 100 μL CCK-8 工作溶液（10% CCK-8 + 90% DMEM）添加到每个孔中，然后在 37°C 下孵育 1 小时。使用酶标仪（Labtech, Inc., Durham, North Carolina）检测 450 nm 处的吸光度值。

体外光热放射治疗

首先，研究了NSs的体外光热性能。具有相同 Mo 浓度的 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 与细胞一起培养 3 小时，然后通过 NIR 照射 5 分钟（808 nm，1 W/cm ² ）。用红外热像仪（Fluke TI25，美国）分别检测各孔处理细胞的温度。

接下来，对于体外光热疗法，将贴壁 4T1 细胞与不同浓度的 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 培养 3 小时。去除细胞外的NS。然后用或不用 NIR（808 nm，1 W/cm ² , 5 分钟）和不同剂量的 X 射线照射（RT，0-5 Gy，0.084 Gy/s）。再孵育 24 小时后，通过标准 CCK-8 测定检测细胞活力。将上述处理过的细胞进一步用calcein-AM/PI共染色以检测活细胞和死细胞，然后通过共聚焦激光扫描显微镜成像（calcein-AM：Ex =488 nm，Em =515 nm；PI：Ex =535 纳米，Em =617 纳米）。此外，还通过γ-H2AX 免疫荧光分析了处理过的细胞。上述处理后，将细胞用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，并在 - 20°C 下用甲醇渗透 15 分钟，然后用 PBS 洗涤。然后，将细胞与封闭缓冲液（PBS 溶液中的 1% BSA）在 25°C 混合 1 小时，并在 4°C 下与抗磷酸组蛋白 γ-H2AX 小鼠单克隆抗体（稀释 1:500）进一步孵育过夜C。 PBS洗涤后，共聚焦激光扫描显微镜观察细胞荧光。

动物模型

Balb/c 裸鼠（5-8 周大）由 Charles River Laboratories（中国北京）提供。建立动物 4T1 肿瘤模型，150 μL 10 ⁶ 将悬浮细胞皮下注射到小鼠背部。小鼠在动物室喂养并每 2 天观察一次。本研究中的所有福利和实验程序均按照国家卫生部的政策进行，并经商丘市第一人民医院伦理委员会批准。当肿瘤体积达到 100 mm ³ ,小鼠用于体内实验。

体内生物分布和血液循环

在 4T1 荷瘤小鼠中研究了 NSs 的全身生物分布。在静脉注射 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA (10 mg/kg) 后 1 小时、1 天、7 天和 24 天，肿瘤和主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏） ) 称重并用王水溶液消化 12 小时。这些组织中的 Mo 和 Se 含量通过 ICP-AES 进行分析。此外，健康的 Balb/c 小鼠静脉注射 FA-MoSe2@BSA（10 毫克/千克）。从小鼠尾部采集约 10 μL 血液并通过 ICP-AES 进行血液循环分析。

体内光热放射治疗

对于体内光热放疗，荷瘤小鼠 (n =5 每组）用 PBS + NIR、PBS + RT、MoSe2@BSA NSs + NIR + RT、FA-MoSe2@BSA NSs + RT、FA-MoSe2@BSA NSs + NIR 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理+ NIR + RT（含 5 mg/kg MoSe2）。放疗剂量为 5 Gy。在注射后 24 小时静脉注射，肿瘤区域受到 5 分钟近红外辐射（808 nm，1 W/cm ² ）。在照射过程中，红外热像仪记录小鼠的热图像。在接下来的 30 天内，每 4 天监测一次肿瘤的长度和宽度。相对肿瘤体积计算为V /V 0，其中 V 0代表治疗开始时的肿瘤体积。同时，每4天监测每只小鼠的体重。

体内生物相容性

为了体内生物相容性，将 150 μL FA-MoSe2@BSA NSs (15 mg/kg) 静脉注射到健康的 Balb/c 裸鼠中。注射前和 30 天后，收集血液进行全血计数评估，包括白细胞 (WBC)、红细胞 (RBC)、血红蛋白 (HGB)、平均血小板体积 (MPV)、平均红细胞血红蛋白 (MCH)、血细胞比容 (HCT)、平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)、平均红细胞体积 (MCV) 和血小板 (PLT)。同时处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾。获得的器官用 4% 多聚甲醛固定并切成 5 μm 切片，并用苏木精和伊红 (H&E) 染色。染色切片经数码显微镜成像。

统计分析

数据显示为平均值 ± SD。双尾学生的t 检验用于分析两组的统计显着性。对于 *P，差异被认为是显着的 <0.05 并且对于 **P 非常显着 <0.01.

结果与讨论

FA-MoSe2@BSA NSs 的制备和表征

FA-MoSe2@BSA NSs 的制备过程如图 1a 所示。简而言之，不稳定的 MoSe2 纳米点在超声处理下由块状 MoSe2 制备，然后通过 BSA 蛋白稳定和组装，并通过 PEG“桥”同时与目标分子 FA 结合。制备的 MoSe2 NDs 是在 TEM 中观察到的超小纳米点（图 1b）。 MoSe2 ND 的 XRD 图案显示在附加文件 1 中：图 S1。 13.1° 处的衍射峰属于 (002) 面，与体相 MoSe2 的峰位置匹配。明显的 (002) 峰表明在 MoSe2 ND 的 c 轴上存在少量层。与块状 MoSe2 相比，MoSe2 NDs 的（100）面衍射峰显着变宽，这可能源于 MoSe2 NDs 的尺寸减小 [23]。在与 BSA 蛋白和 FA 组装和结合后，纳米复合材料形成球状颗粒（图 1c）。 FTIR 光谱显示 FA-MoSe2@BSA NSs 中存在 –CONH-键，表明 FA 可能通过酯键共轭到 MoSe2 上（附加文件 1：图 S2）。此外，我们量化了 FA-MoSe2@BSA 纳米球上的 FA，为 10.5 ± 0.11%。 DLS 分析显示 MoSe2 NDs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 的平均直径分别约为 3.8 nm 和 139.8 nm（图 1d）。储存 7 天后，MoSe2 NDs 的尺寸从 3.8 nm 增加到 63.2 nm，而 FA-MoSe2@BSA NSs 尺寸没有明显变化（图 1e），表明 MoSe2 NDs 的长期聚集和低稳定性贮存。此外，当分散在水、PBS 和细胞培养基等不同介质中时，FA-MoSe2@BSA NSs 显示出相似的尺寸分布（图 1f）。这些结果表明 FA-MoSe2@BSA NSs 在生理条件下是稳定的，这种 MoSe2 NDs 稳定性的提高可能归因于 BSA 组装和 PEG 涂层 [24, 25]。如图 1g 所示，MoSe2 NDs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 的紫外-可见 (UV-Vis) 光谱具有类似的高 NIR 吸光度特性，表明 BSA 和 FA 修饰不影响 MoSe2 的吸光度。

一 FA-MoSe2@BSA NSs合成示意图. b MoSe2 ND 的 TEM 图像。插图是高分辨率 TEM 图像。 c FA-MoSe2@BSA NSs 的 TEM 和 SEM 图像。 d MoSe2 NDs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 的尺寸分布。 e MoSe2 NDs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 在 7 天内在水中的尺寸变化。 f FA-MoSe2@BSA NSs 在水、PBS 和培养基中的粒径分布。 g MoSe2 NDs和FA-MoSe2@BSA NSs的吸收光谱

FA-MoSe2@BSA NSs 的光热效应

图 2a 显示 FA-MoSe2@BSA NSs 溶液的温度随着浓度的增加（0-200 μg/mL）而增加。 NIR 照射后（808 nm，1 W/cm ² ) 5 分钟后，200 μg/mL 的 FA-MoSe2@BSA NSs 溶液的温度变化达到约 41°C，而在相同条件下纯水的温度仅升高约 1.5°C。此外，FA-MoSe2@BSA NSs在不同功率强度（0.5-2.0 W/cm ² ) 也记录了 5 分钟。如图 2b 所示，随着激光功率强度的增加，温度升高到最高 40.6°C。图 2c 描绘了 FA-MoSe2@BSA NSs 的光稳定性，这意味着 FA-MoSe2@BSA NSs 在三个近红外辐射循环后保持其出色的光热效应，而没有任何温度升高的衰减。这些结果表明 FA-MoSe2@BSA NSs 具有显着的光稳定性和优异的光热性能。如图 2d 所示，通过计算机断层扫描 (CT) 获得的 FA-MoSe2@BSA NSs 图像的 Hounsfield 单位 (HU) 值与其浓度呈正相关，表明 NSs 有可能用作放射增敏剂。

一 不同浓度（0、50、100 和 200 μg/mL）FA-MoSe2@BSA NSs 溶液在 808 nm 激光照射下，功率密度为 1 W/cm ² 的光热加热曲线 . b 100 μg/mL FA-MoSe2@BSA NSs 溶液在 808 nm 激光照射下不同功率密度（0.5、1、1.5 和 2 W/cm ² ）的光热加热曲线 ）。 c FA-MoSe2@BSA NSs 在功率密度为 1 W/cm ² 808 nm 激光照射 3 个周期下的温度变化 . d 不同浓度FA-MoSe2@BSA NSs的CT图像（插图）和HU值

细胞摄取和体外生物相容性

为了评估细胞摄取，MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 被 FITC 标记。如图 3a 所示，与 MoSe2@BSA NSs 和游离 FITC 处理的细胞相比，FA-MoSe2@BSA NSs 处理的细胞在细胞质内观察到更强的 FITC 荧光。 ICP-AES 定量分析显示 FA-MoSe2@BSA NSs 的细胞摄取高于 MoSe2@BSA NSs（图 3b）。这些结果表明 FA 增强了 FA-MoSe2@BSA NSs 的细胞摄取。有趣的是，在 FA 阻断后，与没有 FA 阻断的细胞相比，FA-MoSe2@BSA NSs 处理的细胞在细胞质内显示出较弱的绿色 FITC 荧光。相应地，FA-MoSe2@BSA NSs + FA处理的细胞的细胞摄取率低于FA-MoSe2@BSA NSs处理的细胞。这表明细胞膜上的 FA 受体受到阻碍（被游离 FA），进而降低了 FA-MoSe2@BSA NSs 的靶向能力和可及性。进一步证明FA受体在4T1细胞中过度表达，FA-MoSe2@BSA NSs可能通过受体介导的内吞途径进入细胞[26, 27]。

一 4T1 细胞与游离 FITC、FITC 标记的 MoSe2@BSA NSs、FA-MoSe2@BSA NSs + FA 阻断和 FA-MoSe2@BSA NSs 孵育后的共聚焦荧光图像。红色和蓝色分别代表 FITC 荧光和 DAPI 染色的细胞核。 b 4T1细胞对MoSe2@BSA NSs、FA-MoSe2@BSA NSs + FA阻断和FA-MoSe2@BSA NSs的ICP-AES定量分析

NSs 的体外生物相容性通过溶血和细胞毒性分析进行评估。图 4a 显示 FA-MoSe2@BSA NSs 处理的红细胞 (RBC) 或 PBS 处理的 RBC 没有明显的溶血。此外，当浓度高达 0.4 mg/mL 的 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 与细胞孵育 24 小时时，存活率抑制不到 10%。这些结果表明FA-MoSe2@BSA NSs具有良好的体外生物相容性。

一 与不同浓度的 FA-MoSe2@BSA NSs 孵育 1 小时后红细胞的溶血率。插图显示了 RBC 暴露于不同浓度的蒸馏水、PBS 和 FA-MoSe2@BSA NSs 然后离心的照片。 b 用不同浓度的 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理 24 h 后 4T1 细胞的细胞活力

体外光热放射治疗

如图 5a、b 所示，用 FA-MoSe2@BSA NSs 处理的细胞在 NIR 照射 5 分钟（808 nm，1 W/cm ^{2 ) 与 MoSe2@BSA NSs 和 PBS 处理的细胞相比。图 5c 显示了通过添加 FA-MoSe2@BSA NS 增强了 RT 功效。随着 X 射线剂量的增加，FA-MoSe2@BSA NSs 的 RT 功效比 MoSe2@BSA NSs 提高了很多。结果表明，FA-MoSe2@BSA NSs可以增强放疗效果，可能是由于它们的X射线衰减能力可以将X射线辐射能量集中在肿瘤细胞内并产生二次俄歇电子，从而导致DNA损伤和抑制细胞生长[28, 29]。}

一 PBS、MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理细胞的热图像，以及 b 808 nm 激光（1 W/cm ² ）连续照射下相应的温度变化曲线 ）。 c 用 PBS、MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 结合不同剂量的 X 射线照射（0-5 Gy）处理的 4 T1 细胞的细胞活力。 d 在 808 nm NIR 激光（5 分钟，1 W/cm ² ）下用不同样品处理的 4T1 细胞的细胞活力 ) 和 X 射线 (5 Gy) 照射

为了进一步评估联合 RT 和 PTT 的治疗效果，仅用 NIR 或 RT、FA-MoSe2@BSA NSs + RT、FA-MoSe2@BSA NSs + NIR 或 FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT 处理 4T1 细胞.如图 5d 所示，FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT 处理组显示出最显着的浓度依赖性细胞死亡，抑制率为 92.8%。 FA-MoSe2@BSA NSs 的优异治疗效果可能是由于 (1) FA-MoSe2@BSA NSs 的光热消融 PTT 和 DNA 损伤，以及 (2) FA 靶向增强了细胞内化 FA- MoSe2@BSA NSs，从而产生更多的热量和X射线来杀死细胞。

如图 6a 所示，在 PBS + NIR 和 PBS + RT 对照组中可以观察到很少的死细胞。尽管在 FA-MoSe2@BSA NSs + RT 或 FA-MoSe2@BSA NSs + NIR 组中发现了死细胞，但活细胞仍然存在。相反，在FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT组中，超过95%的细胞被破坏并呈现红色荧光，表明FA-MoSe2@BSA NSs联合RT和PTT可以提高治疗效率。 <图片>

一 生死与b 用 PBS + RT、PBS + NIR、FA-MoSe2@BSA NSs、FA-MoSe2@BSA NSs + NIR、FA-MoSe2@BSA NSs + RT 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理的 4T1 细胞的 γ-H2AX 染色图像+ NIR + RT，分别

由于 FA-MoSe2@BSA NSs 具有高 X 射线吸收率，因此有可能具有增强 RT 的能力。如图 6b 所示，在 PBS 处理组、仅 FA-MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs + NIR 处理组中观察到非常低水平的 γ-H2AX 信号。同时，FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT处理组显示出更高水平的γ-H2AX信号，表明细胞核内的DNA损伤更显着。这些结果表明 FA-MoSe2@BSA NSs 可以增强 RT 效应，这归因于其 X 射线衰减能力，将 X 射线辐射能量集中在肿瘤细胞内并产生二次电子和俄歇电子，导致 DNA 损伤和抑制细胞生长。 30–32]。

体内生物分布和血液循环

如图 7a、b 所示，注射后 24 小时，除肝脏和肾脏外，Mo 和 Se 元素在肿瘤中积累。还评估了注射 MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 后肿瘤组织中 Mo 元素的含量。如图 7c 所示，FA-MoSe2@BSA NSs 处理组肿瘤组织中的 Mo 水平随时间增加并在注射后 24 小时达到峰值，高于 MoSe2@BSA NSs 处理组团体。图 7d 显示了注射 FA-MoSe2@BSA NSs 后不同时间点 Mo 的血液循环曲线。 Mo t 1/2α（血液分布半衰期）和 t FA-MoSe2@BSA NSs 组的 1/2β（血液终末消除半衰期）分别为 0.91 ± 0.06 小时和 16.96 ± 1.3 小时。这些结果可能是由于 (1) PEG 和 BSA 修饰促进血液循环延长 [24, 33]，(2) 网状内皮系统减少巨噬细胞对纳米颗粒的清除 [34, 35]，以及 (3) 促进肿瘤靶向作用通过 FA 修饰和随后在肿瘤组织中的积累。 FA-MoSe2@BSA NSs的肿瘤最佳蓄积时间可指导体内光热放疗。

a Mo 和 b MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理小鼠肿瘤和主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的硒元素含量。 c MoSe2@BSA NSs 和 FA-MoSe2@BSA NSs 处理小鼠肿瘤区域的 Mo 元素含量随注射时间的定量体内分析。 d FA-MoSe2@BSA NSs注射后不同时间点Mo血液循环曲线

体内光热放射治疗

如图 8a、b 所示，NIR 照射下肿瘤区域的温度（5 min, 1 W/cm ² ) 与 PBS 或 MoSe2@BSA NSs 处理组相比，在注射 FA-MoSe2@BSA NSs 后 24 小时显示出约 22.1°C 的增加。这表明 FA-MoSe2@BSA NSs 在体内具有优异的光热效应。 As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe2@BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe2@BSA NSs + NIR; group 5:MoSe2@BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe2 was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ）。 The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe2@BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe2@BSA NSs (Fig. 8d).

一 In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe2@BSA NSs and FA-MoSe2@BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ）。 b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe2@BSA NSs + NIR, FA-MoSe2@BSA NSs + RT, MoSe2@BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe2@BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P  < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe2@BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe2@BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe2@BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe2@BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

一 H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe2@BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe2@BSA NSs

结论

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe2@BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe2@BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe2 NDs, FA-MoSe2@BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe2@BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe2@BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe2@BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.

缩写

BSA：

牛血清白蛋白

FA:

Folic acid

MoSe2 :

Molybdenum selenide

NDs:

Nanodots

近红外：

近红外

NSs:

Nanospheres

PEG：

聚乙二醇

PTT：

光热疗法

RT：

Radiotherapy