通过微等离子体合成黄色荧光碳纳米点用于癌细胞的成像和光催化灭活

介绍

癌症仍然是世界范围内的主要死因[1]。兼具诊断和治疗功能的多功能纳米粒子在纳米医学中具有广阔的应用前景。同步图像引导治疗是癌症治疗中的一个新概念，在优化治疗效率方面显示出巨大的前景。它可以提供有关肿瘤大小和位置、光疗的最佳时间窗口和治疗效果的有用信息 [2,3,4]。由于其时空选择性和非侵入性，光动力疗法 (PDT) 已被用于治疗多种癌症和其他疾病 [5, 6]。理想的光敏剂通常具有以下特征：（1）高效生成活性氧（ROS），（2）良好的生物相容性，以及（3）水溶性[7]。然而，目前 PDT 的应用受到光敏剂水溶性差、不稳定性和次优激发波长的限制。因此，需要通过环保、低成本的方法制备具有良好水溶性和生物相容性的光敏剂替代品。

碳量子点（CQDs）由于其独特的有益特性而受到极大的关注，例如合成简单且环境友好、毒性低、生物相容性好、水溶性好、光稳定性好[8]。 CQD 在细胞成像、生物传感、靶向药物递送和其他生物医学应用中具有潜在用途 [9,10,11,12,13]。合成碳点有两种主要方法，自下而上和自上而下的方法。自上而下的方法包括电化学氧化、激光烧蚀、化学氧化和超声波合成方法。自下而上的方法包括水热处理、微波合成和热分解 [14,15,16,17]。然而，所需的高温、高压和强酸总是导致大量的能源消耗、复杂的工艺和不可避免的对环境的危害。因此，新型环保合成方法应运而生。据报道，使用微等离子液体方法可以在几分钟内生产 CQD，无需高温条件、大量能量输入和繁琐的程序 [18,19,20]。微等离子体为涉及先进材料的基础研究和应用提供了独特的物理化学环境。微等离子体提供的化学和电子环境是高度不平衡的，可以储存能量。在这种环境中，可以产生大量的电子、离子、自由基和其他激发电离的活性物质 [21, 22]。虽然o -苯二胺是合成碳纳米点的原料，尚未用于微等离子体合成[23,24,25]。

在这项研究中，o 以-苯二胺为原料，通过微等离子体处理合成CQDs。通过这种方法生成的 CQD 尺寸均匀（直径约 3.2 nm），并在 550 nm 附近显示出发射峰。我们证明了新合成的 CQDs 可以在光照条件下产生大量的 ROS。在体外，CQDs 可以被 HeLa 肿瘤细胞吸收，并在 420-500 nm 的蓝色波长激发下发出黄光，并且毒性低。我们还观察到 HeLa 肿瘤细胞在 460 nm 照射下的失活。这些结果表明，新制备的碳量子点可能是用于体内生物成像、成像引导或靶向癌症治疗的有前景的材料。

结果与讨论

CQD 的特征

本研究中的黄色发光 CQDs 是通过微等离子体方法以 o 的方式以简便且环保的方式制备的 -苯二胺作为碳前体。虽然已有报道采用微等离子体处理方法合成碳纳米点，但相关研究较少。图 1A 显示了 CQD 颗粒的透射电子显微镜 (TEM) 图像。微等离子体产生的颗粒呈环状或椭圆形，平均直径为 3.2 nm。如图 1A（插图）的高分辨率图像所示，CQD 中的晶格距离为 0.21 nm，属于石墨的 (1,1,0) 平面。拉曼光谱显示 D 模式，称为无序诱导模式，位于 1342 cm ^-1 G 模式以 1507 cm ⁻¹ 为中心 ，分别由于 sp 的结果 ³ 和 sp ² -碳的杂交（图 1E）。众所周知，与 G 模式相比，D 模式的强度取决于样品中石墨微晶的大小。样品的无序度越高，ID/IG 的强度比越高，石墨微晶越小。此外，CQD粉末的D和G模式也可以看作是具有较高ID/IG强度比（0.77）的小石墨片。

CQD 的表征。 A CQDs 的 TEM 图像（插图，高分辨率 TEM 图像）； B CQD 的尺寸分布； C CQDs的紫外可见吸收光谱； D 激发波长从 400 到 500 nm 以 20 nm 为增量的 CQD 的 FL 光谱； E , F CQDs的拉曼光谱和CQDs的FTIR光谱

FTIR 和 XPS 是表征碳基材料化学成分和结构的强大工具。 CQD 的 FTIR 数据记录在 400-4000 cm ^-1 范围内 ，如图 1F 所示。 FTIR 光谱显示 CQDs 主要包含胺 (3052 和 3324 cm ^-1 ), OH (3200 cm ⁻¹ ), C=O (1595 cm ⁻¹ ), C–N/C–O (1200 cm ⁻¹ ), C=C (1500 cm ⁻¹ ) 和 CH (748 cm ⁻¹ ) 官能团或化学键 [26, 27]。由 XPS 确定的 CQD 的表面成分与 FTIR 结果一致。图 2A 中显示的全谱显示三个典型峰：C 1s (285 eV)，N 1s (400 eV) 和 O 1s (531 eV)。

CQD 的 XPS 光谱。 A CQD 的全尺寸 XPS 光谱； B C 1s的高分辨率 光谱; C N 1s 的高分辨率 光谱; D O 1s的高分辨率 光谱

如图 2B-D 所示，一个 C 1s 分析揭示了sp的存在 ² /sp ³ 碳（C–C/C=C，284.8 eV）、亚氮碳（C–O/C–N，285.9 eV）和羰基碳（C=O，287.7 eV）。 N 1s 条带在 399.3、400.3 和 401.7 eV 处解卷积为三个峰，分别对应于吡咯 N、石墨 N 和氨基 N。 O 1s C-O 和 C=O 的峰分别位于 531.6 和 533.1 eV [28, 29]。重要的是，上述这些官能团的存在赋予了 CQD 良好的溶解度。此外，使用荧光光谱和紫外-可见吸收研究了 CQD 的光学性质。 CQD 的荧光发射光谱如图 1C 所示。制备的 CQD 表现出依赖于激发的荧光发射行为。当在 400 到 500 nm 的波长下激发时，最大荧光发射峰从 473 nm 红移到 519 nm，荧光强度急剧下降 [30]。如图 1D 所示，CQD 的 UV-vis 光谱在 400-490 nm 的波长范围内具有强吸收峰。 CQD 在 280 和 420 nm 处表现出两个特征吸收峰，分别表示 π-π*（芳香族 C=C）和 n-π*（羧基和/或 C-N）跃迁 [31, 32]。因此，CQDs的这些光学特性为同时进行生物成像和光动力灭活提供了可行性。

CQDs 的生物成像和细胞毒性

为了评估 CQD 对生物成像和细胞标记的能力，通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 在 HeLa 细胞上研究了使用 CQD 的体外细胞成像。 Hela 细胞与 200 μg mL ^-1 一起孵育 CQDs 6 小时，然后准备 CLSM 检测。结果，HeLa 细胞显示出均匀分布在整个细胞中的亮黄色荧光（图 3A）。更重要的是，应该注意到 200 μg mL ^-1 的低 CQDs 浓度 足以用黄色荧光标记 Hela 细胞，这进一步说明了 CQD 在细胞成像中的可能性。据报道，碳纳米粒子总是仅在蓝光区域表现出强发射，而长波长发射通常较弱。在紫外激发下，生物组织经常表现出蓝色自发荧光，容易受到光损伤，这严重阻碍了具有短波长发射的碳纳米粒子的生物成像分析应用[33]。因此，具有长波长发射的碳纳米粒子的开发受到广泛关注。在本研究中，所制备的 CQD 在 400-450 nm 光的激发下显示出亮黄色荧光。因此，激发的黄色荧光可能使 CQD 可用于检测深部肿瘤。然而，距离人类癌症成像的实际应用还有很长的路要走。

CQD 的应用。 A 用 CQD 标记的 HeLa 细胞的 CLSM 成像； B CQDs的体外细胞毒性试验； C 用对照溶液或 CQD (200 μg mL ^-1 ) 并暴露于蓝光 (460 nm, 30 mW cm ⁻² ) 5 分钟、10 分钟和 15 分钟； D 暴露于蓝光 10 和 15 分钟后 Hela 细胞上激发的 CQD 的 IC50 (*P <0.05)

如果打算将 CQDs 开发为潜在的生物标记试剂，除了发光特性外，还需要高生物相容性和低毒性。对于生物医学应用，材料必须在推荐剂量下具有高度的生物相容性。为了检查细胞毒性，用终浓度为 0 到 400 μg mL ^-1 的 CQD 处理 HeLa 细胞 24 小时。如图 3B 所示，通过 MTT（3-（4,5-二甲基噻唑基-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑）测定，超过 95% 的细胞存活，这表明 CQD 实际上是非有毒。

这些数据表明，新生成的具有激发黄色荧光的CQDs具有低细胞毒性和高生物相容性，有利于其在生物成像方面的广阔前景。

光动力疗法的功效

癌细胞灭活

如图 3C 所示，单独用 CQD 或蓝光处理的 HeLa 细胞之间的存活率没有差异。 CQDs 和蓝光的同时处理显着降低了 Hela 细胞的细胞活力，这取决于曝光的持续时间。在 460 nm 照射 15 分钟后，CQD 显示出显着的抗肿瘤活性；在 200 μg mL ^-1 的浓度下，HeLa 细胞的活力降低了约 40% .为了进一步检测激发的 CQDs 的影响, 实施了 MTT 分析来评估激发的 CQDs 对 Hela 细胞的半数最大抑制浓度 (IC50)。结果，CQDs 在 Hela 细胞上激发后的 IC50 约为 427.5 μg mL ^-1 (95% CI 366.7–498.7 μg mL ⁻¹ ) 照射 10 分钟后，约为 255.1 μg mL ^-1 (95% CI 220.9–249.8 μg mL ⁻¹ ) 蓝光照射 15 分钟后。

这些结果表明，激发的CQDs可以像一些临床抗癌药物如Photofrin [34]一样有效地杀死肿瘤细胞，这提示了CQDs在成像引导抗肿瘤治疗中的应用价值。

CQD 的 ROS 生成

在 PDT 期间，癌细胞可以在适当的照射条件下被内吞光敏剂产生的细胞毒性 ROS 杀死 [35, 36]。 ROS 可以通过凋亡或坏死使靶细胞失活，并且在几种疾病中通过 PDT 几乎没有副作用 [37,38,39,40]。检查图 4A 表明 ROS 试剂发出红色荧光，表明 ROS 的产生。此外，ROS的红色信号与CQDs的荧光很好地重叠，这意味着ROS的产生与肿瘤细胞对CQDs的摄取密切相关。如图 4B 所示，与对照组和无激光照射组相比，460 nm 激光照射 15 分钟的实验组显示出明显的 ROS 生成。我们的结果表明，CQDs 在 460 nm 激光照射下可以显着促进细胞内 ROS 的产生，在 PDT 中具有巨大的应用潜力。原则上，CQDs 可以从基态（图 4C 中的 S0）激发到激发态（图 4C 中的 Sn），该过程的效率由光源强度和消光系数决定.在溶剂介导的弛豫之后，CQD 保持在第一个单重激发态的最低振动水平。由于激发后的快速振动弛豫，从第一个单重激发态（图 4C 中的 S1）发射的光子的能量低于激发光子的能量，导致波长增加。荧光成像利用 CQDs 从 S0 到 Sn 到 S1 的转变 [41]。 CQDs 被 HeLa 肿瘤细胞摄取，当被合适的波长源照射时会发出荧光，从而允许细胞被标记。 S1 可以通过荧光或通过系统间交叉到非荧光三重激发态（图 4C 中的 T1）而返回到 S0 状态 [7, 42]。 T1的荧光基团在电子转移反应中特别活跃，产生超氧自由基，随后导致荧光基团降解。从 T1 转移到分子氧的能量会产生一种比基态分子氧更强的激发态单线态氧氧化剂。超氧自由基和单线态氧，以及其他 ROS，包括 OH 和 H2O2，与附近的生物分子反应产生光毒性，导致细胞死亡。 CQDs被HeLa细胞吸收后，光照导致单线态通过系统间转移到三线态，能量转移过程产生ROS，最终导致细胞死亡。在适当的波长源下，CQD 经历两种类型的能量转移。发射荧光标记 HeLa 肿瘤细胞，HeLa 细胞被 ROS 杀死。我们的实验数据揭示了新产生的 CQDs 在黑暗中良好的生物相容性和光照条件下的肿瘤杀伤效率。因此，CQDs可作为肿瘤细胞和组织的光敏剂。

细胞内 ROS 生成。 A HeLa 的荧光图像，(a) 明场透射图像，(b) 在 400-450 nm 范围内收集的 CQDs 荧光图像，(c) 在 510-530 nm 范围内捕获的 ROS 检测试剂荧光图像，以及 (d ) 合并后的图像； B 不同浓度的 CQDs 在照射或不照射 15 分钟的情况下细胞内 ROS 的产生； C 简化的能级图显示了潜在的荧光和细胞死亡能量转移途径。 （S0，荧光团分子的基态；S1，第一单线激发态；Sn (n> 1); T1，第一个三重激发态；例如，通过光子吸收激发； FL，荧光）

此外，CQDs如何准确靶向肿瘤，更有效地杀伤肿瘤细胞仍然是一个悬而未决的问题。现有丰富的表面功能性亲水基团（羧基、羰基、环氧基、羟基、羟基等）使碳点能够与可以精确靶向肿瘤的特异性抗体结合，这需要肿瘤具有特异性的生物标志物。同时，碳点还可以作为药物和基因传递的工具，因为它们具有较高的表面积与体积比 [43]。考虑到优异的生物相容性、肿瘤细胞内化的小尺寸、丰富的表面功能部分和生物成像潜力，碳点（包括 CQDs）被认为是有希望的肿瘤治疗治疗诊断候选者。然而，碳点在纳米医学和生物成像中的应用仍然存在挑战和许多未解决的问题。未来应加大力度推动碳点相关纳米药物从实验室到临床的转化。

结论

总之，我们使用 o 合成了光致发光 CQD -苯二胺通过等离子体法。在蓝色激光的激发下，直径约为 3.2 nm 的 CQD 发出黄色荧光。 Raman、UV-vis、FTIR 和 XPS 结果表明，更多的碳原子参与了 sp ² 杂交，形成一个新的有机基团。等离子体法合成的CQDs在细胞成像实验中被证明是一种有效的探针，CQDs发出的黄色荧光可以清楚地标记HeLa细胞。此外，合成的CQDs表现出良好的溶解性、无毒和高生物相容性，可以加速其生物成像能力。此外，激发的CQDs可以通过产生ROS有效杀死Hela细胞，在体外表现出令人满意的CQDs光动力细胞毒性，支持其在PDT中的应用。

实验方法

碳量子点的合成

微等离子体处理系统在附加文件 1：图 S1 中进行了总结。将内径为 180 μm 的中空不锈钢管连接到高压直流电源（天津市东文高压电源有限公司，天津，中国），并保持在其表面上方 2 mm 处。解决方案。将 Pt 电极（DJS-1；上海仪电科学仪器有限公司，中国上海）连接到电源的阴极并浸入溶液中。然后，400 毫克 o -苯二胺（中国上海）溶解在 40 mL 去离子水中，以及 20 mL o 将-苯二胺溶液加入到培养皿中并使用磁力搅拌器搅拌。在微等离子体处理过程中，氩 (Ar) 气以 60 sccm 的流速流过管道，直流电流保持在 17 mA。等离子处理 10 分钟后，使用透析膜（截留分子量，500 Da）对 2 L 去离子水透析棕黑色产物 12 小时，然后通过 0.22 μm 超滤膜过滤。最后通过冷冻干燥得到纯的CQDs。

CQD 的结构、组成和光学性质的表征

CQD 的尺寸和形态通过使用 JEM-2100F 系统（JEOL，东京，日本）的 TEM 进行表征。使用 Perkin Elmer LS 55 Luminescence Spectrometer (Waltham, MA, USA) 进行荧光光谱分析。使用 Varian Cary 50 UV-VIS 分光光度计（Palo Alto，CA，USA）测量 UV/Vis 吸收光谱。 FTIR 光谱使用 Nicolet 6700 光谱仪（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）获得，拉曼光谱使用 800 UV 微拉曼光谱仪（Invia-reflex，UK）进行。 XPS 实验使用 Axis Ultra DLD 系统（Shimadzu/Kratos Analytical Ltd.，Kyoto，Japan）进行。

细胞培养和细胞毒性分析

HeLa 细胞（ATCC，Manassas，VA，USA）在含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco's Modified Eagle 培养基 (DMEM) 中在 37°C 和 5% CO2 的潮湿环境中培养。对于 CQD 的细胞毒性研究，将细胞计数并以每孔 6000 个细胞的密度接种在含有 200 μL 完全培养基的 96 孔板中。培养 24 小时后，将细胞与浓度为 0、25、50、100、200 和 400 μg mL ^-1 的 CQD 一起孵育 再过 24 小时，然后，使用 MTT 分析检测细胞活力以评估 CQD 的细胞毒性。简而言之，将这些溶液替换为 100 μL MTT 测试溶液（0.5 mg mL ⁻¹ ) 并在孵化器中避光孵育 4 小时。除去上清液，将晶体溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。最后，在 490 nm 处测量每个孔的吸光度。假设没有 CQDs 的对照样品的活力为 100%，光密度与细胞活力有关。

MTT 测定还用于评估 Hela 细胞上激发的 CQD 的 IC50。简而言之，将 96 孔板中的 Hela 细胞与浓度为 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200 和 6400 μg mL ^{-1 -1s 的 CQD 一起孵育> 在培养箱中培养 24 小时，分别用 460 nm 光处理 10 分钟或 15 分钟，然后再培养 24 小时。 MTT法检测各孔细胞活力，并用于IC50评价。}

细胞成像

细胞浓度为2 × 10 ⁴ mL ⁻¹ 接种于共聚焦培养皿（直径 =15 mm）中，培养 24 小时，并用 PBS 洗涤两次以确保无死细胞。 CQD 溶液（200 μg mL ⁻¹ ;加入 pH 7)，并将细胞孵育 6 小时。随后将细胞用 PBS 洗涤 3 次以去除未结合的 CQD，并用 4% 多聚甲醛固定。然后，使用 CLSM（LSM510，Zeiss，Germany）在 400 到 450 nm 的波长范围内激发样品。

光动力疗法和 ROS 测量

为了研究抗肿瘤作用，将 HeLa 细胞与 200 μg mL ^-1 一起孵育 CQD 在 37°C 下在黑暗中持续 24 小时，并用 460 nm (30 mW cm ⁻² ) 5、10 和 15 分钟。孵育 24 小时后，进行标准 MTT 测定以确定相对细胞活力。使用荧光细胞内 Ros 检测试剂盒（sigma，美国）的分光光度法化学检测细胞内 ROS 的产生。将细胞在共聚焦盘（直径 =15 mm）中培养过夜以进行细胞附着。然后，将细胞与 200 μg mL ^-1 CQD 4 小时。随后，添加 100 μL/孔的主反应混合物。孵育 1 小时后，将细胞用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，并通过 CLSM 观察细胞的荧光图像。至于 ROS 产生检测，细胞在 96 孔板中培养，培养基为 200 μL。孵育 24 小时后，将培养基更换为 100 μL CQDs 溶液，浓度为 0、100、200 μg mL ^-1 ，并将细胞再孵育 4 小时。随后，样品用 PBS 洗涤 3 次，辐照或不辐照 15 分钟，然后与 100 μL/孔的 Master Reaction Mix 孵育 1 小时。最后，使用荧光读数器（520 nm 激发，605 nm 发射）检测荧光强度。

统计分析

本研究涉及的实验重复3次，采用SPSS19.0进行统计分析。使用 Mann-Whitney U 比较两组之间的差异 测试。使用非线性回归评估了 Hela 细胞上激发的 CQDs 的 IC50。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

数据和材料的可用性

本研究的所有数据和材料均可在合理要求下向通讯作者索取。

缩写

PDT：

光动力疗法

ROS：

活性氧

CQD：

碳量子点

TEM：

透射电子显微镜

CLSM：

共聚焦激光扫描显微镜

DMEM：

Dulbecco的改良鹰培养基

MTT：

3-(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑

DMSO：

二甲亚砜

IC50：

半数最大抑菌浓度