具有显着电催化活性的磷化钴 (Co2P)，专为对过氧化氢进行灵敏和选择性的无酶生物分析而设计

介绍

过氧化氢 (H2O2) 是生物体中具有代表性的活性氧物质，它在正常生理功能中起着至关重要的作用 [1]。活细胞中H2O2的浓度与细胞生理平衡密切相关[2]。大量研究也报道了癌症、阿尔茨海默病、帕金森病和一些严重疾病可能是由 H2O2 浓度异常引起的 [3,4,5]。开发准确、灵敏、快速和选择性的方法来检测正常氧化应激生物标志物 H2O2 的浓度，无疑将有利于早期诊断。迄今为止，许多分析方法如光谱法 [6]、比色法 [7]、荧光法 [8, 9] 和电化学方法 [10,11,12] 已应用于 H2O2 的测定。电化学法，尤其是电流检测法，以其灵敏度高、选择性好、成本低等优点，正逐渐成为多种传感方法中对H2O2生物分析最简单有效的检测方法之一。

酶电化学传感器已被证明是检测 H2O2 的有效仪器。然而，基于酶的传感器的大规模实际应用受到复杂的固定化、环境不稳定性和低重现性的限制。因此，开发非酶促电化学H2O2传感器势在必行。

近年来，越来越多的基于贵金属 [13,14,15]、非贵金属及其相应化合物 [16,17,18,19] 或碳材料 [20, 21] 的传感器被用于电化学 H2O2 检测。作为用于制造非酶生物传感器的电化学活性材料，过渡金属化合物越来越受到关注。过渡金属磷化物（TMPs）是一类新开发的材料，具有优异的电催化活性、良好的导电性和许多突出的性能。因此，它们已被广泛研究用于水分解 [22, 23]、加氢脱硫 [24] 和超级电容器电极 [25]。最近的研究表明 CoP、Ni2P 和 Cu3P [26,27,28] 也可用作非酶促 H2O2 检测的有效电催化剂。然而，目前关于 TMPs 在生物分析中应用的研究数量仍然有限。此外，三苯基膦[29, 30]、白磷[31, 32]或其他对环境有害的磷源[33]的使用会增加TMP制备的操作风险。因此，开发TMP制备绿色方法的一些研究工作值得在该领域进行补充。

在这项工作中，以醋酸钴和红磷为原料，通过一步水热法制备了磷化钴纳米颗粒（Co2P NPs）。在这里，我们通过滴铸法在氧化铟锡 (ITO) 衬底上制造了 Co2P NPs 用于 H2O2 检测。 Co2P 对 H2O2 还原显示出优异的电催化活性。此外，它显示出良好的选择性、优异的重现性和良好的稳定性，因此具有作为检测 H2O2 敏感平台的潜在应用。

实验部分

试剂和材料

所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可使用。醋酸钴 (II) 四水合物 (Co(Ac)2·4H2O)、氯化钴六水合物 (CoCl2·6H2O)、D-(+)-葡萄糖、L-甘氨酸 (L-Gly)、抗坏血酸 (AA)、尿酸(UA)、尿素、NaCl、KCl、NaH2PO4、Na2HPO4、过氧化氢（30% H2O2）、乙醇和丙酮购自中国国药集团化学试剂有限公司。 D-(-)-果糖、L-精氨酸 (L-Arg)、L-赖氨酸 (L-Lys)、多巴胺 (DA)、对乙酰氨基酚 (APAP)、氨基三亚甲基膦酸 (ATMP, 50 wt%) 购自Aladdin Ltd. 商业红磷（98.5%，100目）购自能化科技（上海）有限公司。Nafion PFSA聚合物分散液（5%）购自北京宏海天科技有限公司。使用去离子水在所有的实验中。氧化铟锡（ITO）玻璃（10 × 20 × 1.1mm，ITO膜185 ± 2nm，薄层电阻6.6 ± 0.1Ω）由深圳市南翔诚科技有限公司提供。

Co2P 纳米粒子的合成

商业红磷（2 克）在超声处理下分散在 15 毫升水中，并在 50 毫升特氟龙内衬不锈钢高压釜中在 200°C 下水热处理 12 小时以清除氧化层 [34]。然后，将水热处理后的红磷在真空烘箱中干燥。完成红磷的预处理后，将 1 mmol Co(Ac)2·4H2O 溶于 30 mL 蒸馏水中，得到水溶液。然后，将水热处理的红磷以Co/P 1/10的摩尔比在超声处理下加入溶液15分钟。将制备的悬浮液快速倒入 50 mL 内衬聚四氟乙烯的高压釜中。然后，将高压釜放入电炉中，分别在 160、200、240°C 下水热处理 12 小时。然后离心收集产物，分别用蒸馏水和乙醇洗涤3次。最后，Co2P NPs 在 60°C 空气中干燥 3 小时。

Co(PO3)2 的合成

Co(PO3)2 的制备方法参考之前的报道[35]。首先制备 0.1 M CoCl2·6H2O 甲醇溶液。然后，2 mL ATMP (50 w t%) 滴加到 20 mL 的上述紫色溶液中并搅拌 30 分钟。随后在溶液中形成不溶性钴-偏磷酸盐配位聚合物。将所得粉红色粉末在Ar气流下以5°C·min ^-1 的升温速率进一步加热至900°C 然后保持 2 小时。冷却至室温后，收集黑色产物并在空气中在 650°C 下重新加热 4 小时以去除碳化的有机配体。最终得到浅紫色的Co(PO3)2粉末。

Co2P/ITO 电极制作

首先，将 ITO 玻璃（1 cm × 2 cm）分别在丙酮、乙醇和去离子水中通过超声清洗 10 分钟。之后，处理过的ITO在氮气吹扫下干燥。为了改进电极，将 5 mg Co2P NPs 分散在 1 mL 去离子水中形成 5 mg mL ^-1 Co2P 悬浮液。然后，将 5 μL 5% Nafion 溶液加入悬浮液中，将混合物超声 15 分钟以获得均匀的墨状悬浮液。 Co2P/ITO电极通过在ITO表面滴注100 μL Co2P悬浮液制备，并在空气中干燥作为工作电极。 Co2P/ITO电极的制备示意图如图1所示。

Co2P/ITO电极的制备及H2O2传感示意图

特征

X 射线衍射 (XRD) 数据通过 D8 ADVANCE 衍射仪使用 Cu Kα 辐射进行分析。使用具有能量色散光谱检测器的 Tecnai G2 F20 进行透射电子显微镜 (TEM) 测量。 X射线光电子能谱（XPS）光谱在Thermo ESCALAB 250XI光谱仪上测量。

电化学测量

伏安法测量是通过 CHI 660E 电化学工作站在三电极系统中完成的，采用 Co2P/ITO 电极作为工作电极，铂箔（1 cm × 1 cm）作为对电极，Ag/AgCl 与 3 M KCl 溶液作为参比电极研究用于检测 H2O2 的合成样品的电化学活性。磷酸盐缓冲盐水（PBS；0.1 M，pH 7.4）用作电解质以模拟人体生理介质。通过循环伏安法 (CV) 和电流法 (I-t) 研究了 Co2P/ITO 电极对 H2O2 检测的传感性能。所有检测实验均在室温下 100 rpm 搅拌下进行。在VersaSTAT 3F电化学工作站上进行电化学阻抗测试，以铁氰化物溶液为电解液进行阻抗测量。

结果与讨论

Co2P NP 的特征

Co2P NPs 的晶体结构由XRD 测量证实。图 1a 显示了在 160、200 和 240°C 下制备 12 小时的 Co2P 样品的 XRD 图案。在 200°C 下制备的 Co2P 样品在 40.7°、40.9°、52.0° 和 56.2° 附近显示衍射峰，对应于正交晶系的 (121)、(201)、(002) 和 (320) 处的特征衍射平面。 Co2P 阶段（JCPDS 编号 32-0306）。当温度从 160 到 200°C 变化时，衍射峰强度增加，峰变得更窄和更尖，表明产品在 200°C 具有更高的结晶度。然而，当温度达到 240°C 时，会形成一些杂质，29.7° 处的衍射峰归因于 Co(PO3)2（JCPDS 编号 27-1120）的 (-222) 处的衍射平面。合成时间对 200°C 下 Co2P 制备的影响显示在附加文件 1：图 S1 中。当持续时间控制在 12 小时内时，获得的 Co2P NPs 显示出（121）峰的半峰全宽的最小值，表明更好的结晶度。此外，当反应时间在 6 到 24 小时之间变化时，样品中不存在任何杂质。根据 Scherrer 公式，在 200 °C 下制备 12 h 的 Co2P NPs 的计算晶粒尺寸为 14.2 nm。

一 在不同温度下制备 12 小时的 Co2P NP 的 XRD 图案。 b Co2P NPs 的透射电子显微图像和高分辨率透射电子显微图像（插图）。 c 中 Co2P 的 XPS 光谱 Co 2p 区域和 d P 2p 地区

Co2P NPs 的形态通过 TEM 测量进行评估。如图 1b 所示，在 200 °C 下制备的产品由直径约 10-20 nm 的不规则纳米粒子组成，在高分辨率 TEM (HRTEM) 图像中可以清楚地看到两个晶格条纹（图 1 中的插图）。 1b)。相邻平面之间的距离为0.22 nm，对应于Co2P的（121）个面，进一步证实了TMP的形成是Co2P。

XPS 技术用于分析 Co2P 表面的化学成分。附加文件 1：图 S2 显示了 Co2P 的 XPS 测量光谱。在样品中检测到 Co、P 和 O 元素，证实了 Co2P 和一些氧化产物的存在。 Co2P 的能量色散 X 射线光谱 (EDX) 光谱（附加文件 1：图 S3）进一步证实了样品中三种元素（Co、P、O）的共存。 Co 2p 和 P 2p 的高分辨率 XPS 光谱分别如图 1c、d 所示。在 Co 2p 光谱中，781.1 和 797.6 eV 处的峰可归因于 Co ²⁺ 的结合能 (BE) 2p 3/2 和 Co ²⁺ 2p 1/2，分别为 [26, 36]。 786.0 和 803.1 eV 处的峰值是两个明显的震荡卫星峰值。 778.2 eV 的 Co 2p BE 从金属 Co (777.9 eV) 的正移，这表明 Co2P 中的 Co 具有部分正电荷 (δ ⁺ ) 具有较小的值 (0 <δ <2) [37]。相反，P 2p 129.4 eV 的 BE 与元素 P (130.2 eV) 的 BE 负移，因此 P 具有部分负电荷 (δ ^- ) 在 Co2P 中。 Co 和 P 元素中 BE 与其单质的变化分别表明 Co2P 中电子密度的转移方向是从 Co 到 P [38]。 Co2P 的表面氧化会在样品中产生一些氧化的 P 物质。因此，高 BE 范围内 133.2 eV 处的峰属于氧化物 [39]。

Co2P/ITO 电极上 H2O2 的电化学检测

为了研究 Co2P NPs 在 H2O2 还原中的电催化活性，我们通过在裸露的 ITO 表面上滴铸 Co2P NPs 悬浮液来设计一种非酶促 H2O2 电极。图 2a 显示了裸 ITO 和 Co2P/ITO 在 pH 7.4 的 0.1 M PBS 中的 CV 曲线，分别有和没有 5.0 mM H2O2。虚线表示裸 ITO 对 H2O2 还原的响应可以忽略不计。然而，Co2P/ITO 电极在 H2O2 存在下在 -0.5V 处表现出显着的还原峰，这表明 Co2P NPs 对 H2O2 还原具有显着的电催化活性。图 2b 显示了 Co2P/ITO 在不同扫描速率（从 30 到 100 mV s ⁻¹ ）下的 CV 曲线 ) 与 2.5 mM H2O2。随着扫描速率的增加，还原峰电流增大，峰电位向更负的一侧移动，说明H2O2在Co2P/ITO上的还原是不可逆反应。相应的校准曲线（插图，图 2b）显示还原峰值电流密度与扫描速率成线性比例增加，表明 H2O2 在 Co2P/ITO 电极表面的电化学还原是一个表面控制的过程 [40] .

一 在 100 mV s ^-1 扫描速率下，在含有和不含 5.0 mM H2O2 的 0.1 M PBS 中的裸 ITO 和 Co2P/ITO 电极的 CV 曲线 . b Co2P/ITO 电极在 2.5 mM H2O2 中的 CV 曲线，扫描速率为 30 到 100 mV s ^-1 .插图：相应的电流与扫描速率的关系图。 c Co2P/ITO 电极在 0.1 M PBS 中连续添加 H2O2 的电流响应。 d 稳态电流与H2O2浓度的校准曲线

图 2c、d 显示了在搅拌下将 H2O2 在 -0.5 V 下连续添加到 0.1 M PBS 时 Co2P/ITO 电极的电流响应和校准曲线。 Co2P/ITO 电极对 H2O2 的加入表现出快速响应，并在 5 秒内达到稳态电流。图 2d 中的校准曲线显示换能器显示 H2O2 浓度的多重线性范围，从 0.001 到 1.0 mM、1.0-5.0 mM 和 5.0-10.0 mM。由于电极表面 H2O2 的电催化还原动力学发生变化，传感器的灵敏度随着 H2O2 浓度的增加而变化。根据先前的报道，H2O2 还原的速率决定步骤在低浓度下由 H2O2 吸附支配，而在高浓度下 H2O2 的活化是主要决定因素。在中间区域，H2O2 的还原动力学同时受吸附和活化控制[10]。大量分析人员会吸附在Co2P表面并以高浓度覆盖活性位点，导致灵敏度降低[41]。

不同反应温度和时间下制备的 Co2P 样品的 H2O2 传感性能的比较显示在附加文件 1：图 S4、S5 和表 S1 中，表明在 200°C 下制备 12 小时的 Co2P 样品显示出最好的 H2O2传感性能。当反应温度升至 240°C 时，Co2P 中形成的 Co(PO3)2 可视为杂质。为了进一步阐明 Co(PO3)2 对 H2O2 检测的影响，研究了 Co(PO3)2 的电化学性质。如附加文件 1：图 S6 所示，Co(PO3)2 对 H2O2 的电化学响应可以忽略不计，其电导率低于 Co2P，这在安培测试中降低了 Co2P/ITO 的电流信号。因此，Co2P 样品更高的纯度和更好的结晶度可能有助于提高传感性能。因此，我们选择在 200°C 和 12 小时制备的 Co2P 样品作为最佳 H2O2 传感材料。校准I –t 曲线在生物系统中 H2O2 浓度的生理范围 1.0-50 μM 范围内也呈现出良好的线性关系（图 S7）[28]，这有助于提高该传感器实际应用的可能性。此外，H2O2 传感器的检测限 (LOD) 可以计算为 0.65 μM，信噪比为 3。与之前报道的 H2O2 传感器相比，我们的 Co2P/ITO 传感器的综合电化学性能优于具有良好灵敏度、线性范围和LOD的那些，如表1所示。

在重复检测 1.0 mM H2O2 35 次后（图 3a、b），Co 2p 中的 XPS 光谱 和 P 2p 分析 Co2P 的区域以进​​一步研究传感机制。 P 2p 中峰的位置没有明显变化 H2O2 检测前后的区域。然而，Co 2p 中的峰值为 778.2 和 793.0 eV 多次测量后光谱消失。由于 778.2 eV 的峰表明 Co2P 样品中存在还原的 Co 物质 [37]，这两个峰的消失表明 Co2P 中低价态的还原 Co 物质可能在检测过程中被 H2O2 氧化，尤其是在高H2O2 的浓度。 Co 2p 的残余峰 区域（782.1 和 798.3 eV）归因于 Co ²⁺ 2p 3/2 和 Co ²⁺ 2p 分别为 1/2，表明在多次测量后 Co2P 中 Co(II) 物种的唯一存在。根据之前关于钴基电催化剂在 H2O2 检测中的应用的报道，Co ²⁺ 物种被证明是 H2O2 还原的催化活性位点 [46,47,48]。通常，H2O2 中的电化学还原在 PBS 中经历两个步骤 [49, 50]，如下所示。

a中XPS光谱的比较 Co 2p 区域和b P 2p 检测前后Co2P区域

第一步，H2O2获得一个电子形成吸附的OH ⁻ （哦哈）。当中间体 OHad 获得一个额外的电子时，就会生成 H2O2 的最终还原产物 H2O。由于H2O2/H2O的氧化还原电位高于Co ³⁺ /Co ²⁺ , Co2P 中的 Co(II) 物种可以在电子转移过程中被氧化为 Co(III)，H2O2 被不可逆地还原为 H2O。在电流测试期间，施加的偏压为 - 0.5 V 对 Ag/AgCl（等于 0.14 V 对。 NHE)，低于 Co ³⁺ 的标准氧化还原电位 /Co ²⁺ .结果，氧化的 Co(III) 可以被还原为 Co(II)，并且 Co(II) 的这些催化活性位点再次再生。因此，可以得出结论，在H2O2的电化学检测过程中发生了Co(II)物种的催化循环，重复测量后低价态的还原Co物种被H2O2氧化。

Co2P/ITO 电极的选择性、稳定性、再现性和重复性

抗干扰性能是生物传感器的另一个重要特性。使用高纯度氮气来避免溶液中溶解氧的影响，因为氧气可以在与电流测试中应用的相似电位下减少 [51]。比较 Co2P/ITO 在 0.1 M PBS 中有或没有氮气吹扫的 CV 曲线，2.5 mM H2O2 的还原电位和电流响应是相似的，如图 S8 所示，因此表明溶解氧的干扰可以被忽视。还用体液中的常见物质和其他小分子，如一些无机盐、糖类、氨基酸和还原性生物分子，测试了 Co2P/ITO 的选择性。如图 4a 所示，与 1.0 mM H2O2 的响应相比，添加上述干扰物后的电流响应可以忽略不计。由于 H2O2 的两个 O 原子都可以与一个或两个 Co 原子键合 [52]，因此 H2O2 分子会特异性地化学吸附在 Co2P 中的 Co(II) 物质上。此外，在高电位的真实生物样品中，某些还原性化合物的不加选择氧化的干扰也可以在较低的偏置电位下显着降低[53]。因此，Co2P 对 H2O2 的良好选择性主要得益于 Co(II) 物种作为特定的吸附位点和传感过程中施加的负偏压。

一 添加 1 mM H2O2 和其他干扰物质（10 mM NaCl、KCl、Glu、Fru、尿素、L-Gly、L-Arg、L-Lys、AA；1 mM DA、UA）的 Co2P/ITO 电极的电流响应; 0.5 mM APAP) 在 0.1 M PBS 中。 b 50 μM H2O2 中十次连续扫描 CV 曲线的阴极峰值电流。 c 用于检测 1.0 mM H2O2 的六个 Co2P/ITO 电极的重现性。 d Co2P/ITO 电极检测 1.0 mM H2O2 八次的重复性

此外，还评估了 Co2P/ITO 换能器的稳定性、再现性和可重复性。图 4b 显示了 50 μM H2O2 中十个连续扫描 CV 曲线的降低峰值电流。十次循环后，电极的峰值电流仅下降了 2.7%。此外，该传感器在空气中存放 1 个月后仍保持其初始电流响应的 98.2% 左右（图 S9），显示出理想的检测稳定性和出色的长期耐用性。通过计算 H2O2 电流响应的相对标准偏差 (RSD) 来研究电极间的重现性。为尽可能消除电极制造中的电位误差，将单个电极的初始背景信号减去H2O2存在下的稳态电流密度，将得到的差值作为每个电极的电化学响应。在相同条件下制造了六个 Co2P/ITO 电极进行对照实验，电流响应的 RSD 为 1.24%，如图 4c 所示，表明 Co2P/ITO 的重现性相对优异。同时，通过检测 1.0 mM H2O2 八次，在一个电极中测量了重复性，RSD 为 1.14%（图 4d）。以上结果说明该电极用于H2O2非酶促电化学检测具有令人满意的稳定性、重现性和重复性。

结论

总之，通过水热法成功合成了Co2P NPs。此外，在 200°C 下制备 12 小时的 Co2P NP 已被证明是在 pH 7.4 PBS 中电化学还原 H2O2 的有效催化剂。作为非酶促 H2O2 传感器，Co2P/ITO 电极显示出不到 5 秒的快速电流响应、更宽的响应范围从 0.001 到 10.0 mM 和 0.65 μM 的低检测限，以及令人满意的选择性、重现性和稳定性.本工作旨在拓宽过渡金属磷化物在生物小分子电化学检测中的应用研究，并将我们的Co2P/ITO传感器设计为一种新型的非酶促H2O2检测平台。

数据和材料的可用性

所有数据和材料均不受限制地完全可用。

缩写

NP：

纳米粒子

ITO：

氧化铟锡

TEM：

透射电子显微镜

HRTEM：

高分辨透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射

XPS：

X射线光电子能谱

EDX：

能量色散X射线光谱

简历：

循环伏安法

I-t：

电流法

Gly：

甘氨酸

AA：

抗坏血酸

UA：

尿酸

参数：

精氨酸

赖氨酸：

赖氨酸

DA：

多巴胺

APAP：

对乙酰氨基酚

ATMP：

三亚甲基膦酸

PBS：

磷酸盐缓冲液

细节层次：

检出限

RSD：

相对标准偏差