用于药物递送、染料降解和过氧化氢比色检测的卟啉铁接枝介孔二氧化硅复合材料

介绍

为了克服天然酶在恶劣环境条件下易变性等缺点，人们投入了大量精力来开发高稳定性的酶模拟物，包括氧化石墨烯、氯化血红素和金属纳米颗粒 [1, 2]。在这些人工酶中，血红素蛋白家族的活性中心血红素是众所周知的天然金属卟啉[3]。作为催化剂，金属卟啉配合物可以有效催化环境污染物如多环芳烃（PAHs）和偶氮染料的氧化，将底物分子转化为功能性含氧有机化合物或将其降解为无害化合物[4,5,6]。然而，氯化血红素的催化活性可能会受到氧化自降解、分子聚集产生无活性二聚体以及在水性缓冲液中的低溶解度的影响 [7]。将氯化血红素固定在具有高表面积的固体载体上为实现其高催化性能提供了一种经济而有效的策略，同时最大限度地减少了实际使用中不令人满意的活性损失。

由于外表面和内表面结构适应的可行性[8]，具有金属卟啉的各种类型的介孔硅纳米材料（MSNs）在各种应用中越来越受到关注。例如，黄等人。据报道，基于氯化血红素的介孔二氧化硅纳米反应器具有显着的过氧化物酶样活性 [9]。巴博萨等人。开发金属卟啉固定的 Fe3O4@SiO2 介孔亚微球作为可重复使用的碳氢化合物氧化仿生催化剂 [10]。最近，Sun 等人。报道了一种基于双适体生物识别和血红素包封的介孔二氧化硅的新型化学发光传感器，用于凝血酶检测 [11]。在各种 MSN 中，SBA-15 (Santa Barbara Amorphous-15) 表现出六边形孔结构和 3-10 nm 可调孔径，可用于化学接枝功能分子 [8, 12]。作为硅材料，SBA-15具有较低的生物毒性，SBA-15表面大量不稳定的Si-OH基团可用于接枝其他功能分子，赋予SBA-15更多的功能[13]。据报道，SBA-15可作为酶固定化、抗体加载和药物递送的载体[14,15,16]。

DOX 作为一种有效的化疗抗生素是广谱癌症的一线治疗，但其在临床上的副作用仍然是一个严重的问题 [17]。为了提高治疗效果，同时降低 DOX 的系统毒性，人们在分子设计和各种药物递送系统的配方开发方面做出了相当大的努力。在 2001 年首次使用介孔 MCM-41（Mobil Composition of Matter No. 41）作为药物载体 [18] 后，包括 SBA-15 在内的 MSNs 具有优势特征 [19, 20]，因为它们固有的孔结构适合载药并释放。然而，MSNs复杂的化学修饰可能会限制其实际应用。

在这项研究中，我们成功地将氯化血红素嫁接到 SBA-15 上构建了复合材料（FeIX-SBA-15）（方案 1），其中不仅保留了氯化血红素的酶样活性，而且有效地包封和持续实时细胞分析仪 (RTCA) 技术通过孵育癌细胞的生长曲线反映了盐酸阿霉素 (DOX) 的释放 [21,22,23]。值得注意的是，与我们使用二茂铁羧酸改性的 SBA-15 (FCA-SBA-15) [24] 的早期工作相比，DOX/FeIX-SBA-15 获得了相对较高的 DOX 负载量，这可能是由于精制载体中接枝的 FeIX 和 DOX 之间的 π-π 堆积。此外，由于固定在商用滤膜上的 FeIX-SBA-15 的固体形式，开发了一种用于有效染料降解和过氧化氢比色检测的流动催化形式。

FeIX接枝SBA-15用于抗癌药物DOX负载

材料和方法

材料

所有试剂均为分析级 (A.R.)，无需进一步纯化即可使用。三嵌段共聚物 Pluronic P123 (EO20PO20EO20, MW =5800) 购自 Sigma-Aldrich (Germany)。 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)、原硅酸四乙酯 (TEOS)、酸性橙 II 和盐酸四甲基联苯胺购自上海阿拉丁生物科技有限公司（中国）。氯化血红素和盐酸阿霉素购自上海麦克林生物化学有限公司（中国）。胰蛋白酶-EDTA 溶液购自 Beyotime Biotechnology Co., Ltd（中国）。细胞培养基 (RPMI-1640) 来自 GE Healthcare Life Sciences Co., Ltd (China)。胎牛血清 (FBS) 获自 Gibco Co., Ltd (USA)。青霉素和链霉素来自赛默飞世尔科技有限公司。A549 细胞系来自美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。

用于载药的 SBA-15 的化学嫁接

SBA-15 按照先前报道的方法制备 [12]。随后，在 80°C 下将 0.40 g SBA-15 分散在 140 mL 甲苯中，并加入 APTES (1.2 mL)。然后，将混合物再搅拌 8 小时并通过以 5000 rpm 离心 5 分钟进行分离。用乙醇和水洗涤后，将 APTES-SBA-15 所得产物在 80°C 下干燥。血红素 (0.15 g) 首先分散在 30 mL DMSO 中，然后加入 APTES-SBA-15 (0.60 g)，然后将混合物在 70 °C 下再搅拌 7 h。所得产物经离心、洗涤、干燥，即为FeIX-SBA-15。

在验证 FeIX 成功接枝到 SBA-15 上后，将 FeIX-SBA-15（0.50 克）悬浮在 20 毫升含有 DOX·HCl（2 毫克/毫升）的去离子水中，在 37°C 下搅拌 24 小时至加载 DOX。然后，将产物以 5000 rpm 离心 5 分钟。洗涤、干燥和研磨后，收集最终产物（DOX/FeIX-SBA-15）。

特征

样品的形态特征通过扫描电子显微镜（SEM，Hitachi SU-1510）和能量色散谱（EDS）X 射线探测器在 15 kV 的加速电压下运行进行研究。制备材料的小角 X 射线衍射 (SAXRD) 图由 Smartlab TM 9 KW X 射线衍射仪使用 Cu Kα 辐射 (λ =0.154 nm) 在 0.2°–8° 的 2θ。在 X 射线荧光光谱仪（Thermo Scientific，USA）上测量 X 射线荧光（XRF）分析。氮气吸附等温线在体积吸附分析仪（BELSORP-MINI，日本）上在相对压力范围 P/P0 为 0.01 至 0.99 内测量。分别使用 Brunauer-Emmett-Teller (BET) 和 Barrett-Joyner-Halenda (BJH) 测量值计算比表面积和孔径分布。固体紫外可见分光光度计（Thermo Scientific，USA）记录材料的固体紫外可见光谱。在紫外可见分光光度计（UV-vis 7300，China）上测量样品的吸收光谱，根据以下公式计算 DOX 载药量（DLC）：DLC（重量百分比） =（载药重量/总介孔材料和负载药物的重量）*100%。 DOX/FeIX-SBA-15 的铁含量由电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP，PE Optima 2000DV，美国）测定。分析前先将DOX/FeIX-SBA-15完全溶解在氢氟酸中，然后挥发氢氟酸，将样品重新溶解在浓硝酸中。

FeIX-SBA-15 的催化活性和降解行为

利用FeIX的类酶活性，研究了TMB的催化活性和酸性橙II在溶液中的降解行为。制备含有 20 mM NaOH 和 1.5 mM Triton X-100 的混合溶液，然后用 PB 溶液稀释 4 倍以溶解 FeIX-SBA-15。在 TMB 催化反应中，500 μL FeIX-SBA-15 (600 μg/mL) 与 500 μL H2O2 (2 mM) 混合作为底物用于降解 TMB（500 μL，3 μg/mL）。以特定时间间隔进行光谱测量以评估反应程度。为了研究合成复合材料的降解行为，500 μL FeIX-SBA-15 (600 μg/mL) 溶液和 500 μL 10 mM H2O2 溶液的混合物作为底物。接下来，将 500 μL Orange II (0.25 mM) 添加到上述溶液中。在 485 nm 处记录吸光度测量值。

此外，复合材料进一步固定在商用滤膜上，以流动催化的方式降解酸性橙 II。将 5 mL FeIX-SBA-15 (600 μg/mL) 悬浮液通过商用过滤器（0.22 μm，Millipore），使材料被截留在过滤器上并在室温下干燥。将与 500 μL H2O2 (10 mM) 和 500 μL H2O 混合的 500 μL Orange II (0.25 mM) 溶液通过装有 FeIX-SBA-15 的商用滤膜。记录混合物的光谱测量结果。

H2O2 的比色检测

对于溶液中的 H2O2 检测，制备了 500 μL FeIX-SBA-15 (600 μg/mL) 和 500 μL TMB (3 mg/mL) 的混合物。接下来，将 500 μL 不同浓度 (25-500 μM) 的 H2O2 添加到上述溶液中，并在 30°C 下孵育 10 分钟。最后，在 651 nm 处记录光谱测量值。

同时，在以流动催化方式固定复合材料的商用过滤膜上进行 H2O2 的测量。如上所述获得改性膜。然后，将 500 μL H2O2 (0.293 ~ 8.8 mM)、500 μL TMB (2 mg/mL) 和 500 μL H2O 的混合物分别通过改进的商业过滤膜，然后在651 纳米。

将吸光度与 H2O2 浓度作图，方法的检测限 (LOD) 可通过以下公式进行评估：LOD =3RSD/斜率。 （RSD：相对标准偏差）。

Cell Clture 和 RTCA 检测

人类非小细胞肺细胞 A549 用 RPMI-1640 培养基培养，培养基中含有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素溶液，在含有 5% CO2 的培养箱中在 37°C (Thermo Scientific) 中培养。采用实时细胞分析仪 (RTCA) 技术（xCELLigence 系统，ACEA Biosciences Inc.）和 Cell Counting Kit-8（CCK-8，DOJINDO Laboratory）方法对材料进行细胞毒性评估。在 RTCA 检测中，每孔 5000-8000 个细胞接种在 E-plate 中。分析仪实时监测细胞孵育和增殖，其中信号变化表示为定义为细胞指数 (CI) 的任意单位。将细胞暴露于浓度为 12.6 µg/mL 的 FeIX-SBA-15 和 DOX/FeIX-SBA-15。 DOX 的浓度为 0.50 µg/mL。此外，为了获得 DOX/FeIX-SBA-15 的 IC50，检测了用 1.6 至 50.4 µg/mL 不同剂量的 DOX/FeIX-SBA-15 处理的细胞。此外，CCK-8试剂盒试验作为终点方法用于检测材料的细胞毒性。 CCK-8试剂与细胞孵育2 h，酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

结果与讨论

材料特性

DOX/FeIX-SBA-15 的复合物如方案 1 所示合成。APTES-SBA-15 首先通过胺化反应制备 [13]。然后，FeIX分子通过酰胺反应和介孔中羧基和氨基之间的静电相互作用接枝在APTES-SBA-15的表面上。最后，由于 FeIX 的共轭平面大环分子 [25] 和 DOX 的蒽环类发色团 [24]，抗癌药物 DOX 加载到 FeIX-SBA-15 复合材料中，涉及 FeIX 和 DOX 之间 π-π 堆积的强分子相互作用。

通过扫描电子显微镜（SEM）评估复合材料的表面微观结构。如图 1a 所示，在 SBA-15 中形成了具有 0.4-1 μm 一定均匀度的管状结构的 SBA-15，并且附着的 FeIX 和 DOX 分子没有引起明显的形态变化。与 SBA-15 相比，DOX/FeIX-SBA-15 的 TEM 图像（图 S1）验证了化学修饰后保留的细观结构。通过 X 射线荧光光谱进一步估计了 DOX/FeIX-SBA-15 的化学成分。如表 S1 所示，在 DOX/FeIX-SBA-15 中发现了 Si、O、C、Fe 和痕量的其他吸收元素。与FeIX-SBA-15相比，DOX/FeIX-SBA-15中Si（~ 24.3%）和Fe（~ 2.5%）的计算原子百分比略低，但C（11.3%）相对较高表明 DOX 成功封装。为了进一步评估表面成分，记录了复合材料的固体紫外-可见光谱。如图 S2 所示，与 FeIX 分子类似，FeIX-SBA-15 在 250-350 nm、450-550 nm 和 600-700 nm 处显示出吸收带，而 SBA-15 几乎没有可观察到的吸收带[ 26]。相比之下，DOX/FeIX-SBA-15 表现出由 DOX 引起的 450-550 nm 的宽吸收带。

一 SBA-15 和 DOX/FeIX-SBA-15 的 SEM 图像。 b 材料的小角 X 射线衍射图。氮吸附等温线 (c ) 和孔径 (d ) 获得的材料：I SBA-15，II DOX/SBA-15，III FeIX-SBA-15 和 IV DOX/FeIX-SBA-15

还进行了复合材料的小角 X 射线衍射分析。如图 1b 所示，SBA-15 的 SAXRD 图案在 0.94° 处显示了一个主衍射峰，在 1.6° 和 1.8° 处有两个可观察的峰，分别反射（100）、（110）和（200）晶面，指向到定义明确的细观结构 [27]。与 SBA-15 相比，DOX/SBA-15 的 SAXRD 谱显示峰强度降低，表明负载 DOX 没有对孔结构造成损害。然而，在 SBA-15 中接枝 FeIX 导致可观察到的峰向大角度移动，同时 (110) 和 (200) 晶面的峰强度降低，表明材料的细观结构规则性部分丧失 [28]。值得注意的是，在 FeIX-SBA-15 中进一步负载 DOX 导致（110）和（200）晶面消失。

为了获得样品的细观结构参数，记录了氮吸附等温线。如图 1C 所示，所有样品都表现出典型的 IV 型等温线，在较高的相对压力下具有尖锐的毛细管冷凝步骤，表明化学改性后细观结构的保留 [24]。如图 1D 和表 S2 所示，与~ 6 nm 的 SBA-15 相比，观察到 FeIX/DOX 缀合后孔径减小，证实了 SAXRD 的结果。 DOX/SBA-15 和 DOX/FeIX-SBA-15 中 DOX 的负载量分别计算为 1.14% 和 4.27%。结果表明，FeIX 接枝的 SBA-15 增强了 DOX 在介孔中的负载能力，这是我们早期工作中 DOX/SBA-15 的 ~ 3.7 倍和 DOX/FCA-SBA-15 的 ~ 1.6 倍[24]。药物分子负载能力的提高可能归因于FeIX和DOX之间精细的分子相互作用。

磨碎的血红素在介孔上的催化活性和降解行为

FeIX-SBA-15 的催化活性通过在 H2O2 存在下使用 TMB 作为模型反应进行评估 [29]。图 2a 显示测定溶液 (TMB + H2O2 + FeIX-SBA-15) 的吸光度强度随着催化反应时间的增加而增加。因此，溶液变为蓝色并随着时间变暗（图 2b）。然而，当溶液中不存在 H2O2 或 FeIX-SBA-15 时，反应不会发生，表明 FeIX-SBA-15 的过氧化物酶活性。同时，如图S3A所示，FeIX-SBA-15在H2O2存在下能够降解Orange II，如反应时间3小时内紫外-可见光吸收所监测。

一 FeIX-SBA-15 与 TMB 和 H2O2 混合后的 UV-vis 吸光度变化。 b 不同时间含有 TMB、H2O2 和 FeIX-SBA-15 的溶液的照片。溶液中 H2O2 的线性校准图 (c ) 和 FeIX-SBA-15 改性膜 (d )

利用固体形式的氯化血红素接枝介孔复合材料，对基于 FeIX-SBA-15 固定化商业过滤膜的流动催化形式进行了有机转化测试 [30, 31]。如图 S3B 所示，当 H2O2 和 Orange II 混合物通过改性膜时，与仅含有 SBA-15 的对照膜相比（图 S3C），溶液的吸收强度随之降低，表明固定化了 FeIX-SBA-15膜回用后具有良好的催化活性，可用于废水中染料的降解[32, 33]。

此外，与辣根过氧化物酶相比，含氯化血红素的复合物在较宽的pH范围内表现出显着的催化活性，这归因于氯化血红素在酸性溶液等相对苛刻的条件下具有足够的稳定性[29, 34]，具有实际意义。

H2O2 的比色检测

基于 FeIX-SBA-15 的 TMB 催化反应模型，建立了测定溶液中 H2O2 的比色策略，校准曲线如图 2c 所示。 H2O2 的浓度范围为 25-500 μM，检测限 (LOD) 为 2.1 μM。

随后，通过 FeIX-SBA-15 改性商业膜直接过滤不同浓度的 H2O2，也开发了一种简单的 H2O2 显色检测。如图 2d 所示，线性检测范围估计为 0.293 至 8.80 mM，检测限为 0.067 mM。获得的分析参数与早期报告的分析参数的比较列于表 1 中，它表明与反应条件（如催化剂浓度、pH 值和测定温度）相关的检测性能 [35]。尽管所提出的方法没有优于之前的报道，但其在较宽的校准浓度范围内的分析性能与显色方法相当。

细胞毒性测定和动态监测 DOX 负载复合物对细胞的影响

如图 3 所示，首先通过 CCK-8 试剂盒评估样品对 A549 细胞的生长抑制作用，并将测得的 24 小时半抑制浓度 (IC50) 总结在表 S3 中。用 150 μg/mL 的 SBA-15 处理的细胞仍保留超过 80% 的细胞活力，这反映了材料的低细胞毒性。 DOX/FeIX-SBA-15 (12.6 μg/mL) 的 IC50 比 DOX/SBA-15 (58.8 μg/mL) 低 ~ 四倍，比 FeIX-SBA-15 (35.4 μg/mL) 低~ 三倍,这表明在SBA-15上接枝FeIX可有效加载DOX以提高细胞毒作用。

A549 细胞分别与 SBA-15、FeIX-SBA-15、DOX、DOX/SBA-15、DOX/FeIX-SBA-15 孵育的活力

用不同复合物处理的 A549 细胞的生长状态在图 4a、b 中显示了通过 RTCA 监测的持续药物释放，这是基于无标记阻抗检测原理来反映细胞的生理状况 [41]。如图 4a 所示，在测试剂量下，DOX 处理细胞的细胞指数值先增加，然后迅速下降，观察到的归一化细胞指数 (NCI) 值急剧下降，涉及 DNA 损伤过程 [42]。 FeIX-SBA-15 (12.6 μg/mL) 和 DOX/FeIX-SBA-15 (12.6 μg/mL) 的 NCI 值均低于对照，但观察到 NCI 值随着孵育时间的增加而增加。与 FeIX-SBA-15 相比，DOX/FeIX-SBA-15 处理的细胞的 NCI 值在处理的前几个小时内增加。然而，由于药物递送的持续释放行为以及从 DOX/FeIX-SBA-15 的介孔释放的 DOX 的有效浓度积累不足以杀死大部分细胞，DOX/FeIX-SBA-15 处理的 A549 细胞的细胞生长FeIX-SBA-15表现出相对稳定的抑制状态，而FeIX-SBA-15处理后的细胞的细胞指数值在接下来的过程中显着增加。在 12.6 μg/mL (CCK-8) 的 IC50 浓度下，发现 DOX/FeIX-SBA-15 的 NCI 值在 24 小时时高于对照组的 50%。因此，记录了 DOX/FeIX-SBA-15 对细胞的多剂量效应（图 4B），并使用 RTCA 软件计算了 DOX/FeIX-SBA-15 记录的 NCI 得出的剂量反应曲线（图 4B） . 4c, d)。 DOX/FeIX-SBA-15 处理的细胞的 IC50 值确定为 15.0（24 小时），这与 CCK-8 测试一致。孵育 48 小时后，计算出的 IC50 为 6.7（48 小时）μg/mL。

不同材料(a ) 和 (b ) 不同浓度的 DOX/FeIX-SBA-15（a-f：1.6、3.2、6.3、12.6、25.2 和 50.4 µg/mL）与剂量反应曲线 (c , d ）。图a中的黑线 &b 建议添加材料的时间点

结论

在这项研究中，我们成功地将氯化血红素分子嫁接到 SBA-15 上以实现多种用途。构建的 FeIX-SBA-15 可用于装载抗癌药物，并且在 H2O2 存在下可有效催化 TMB 并降解溶液中和膜上的酸橙 II。在TMB催化模型反应的基础上，建立了H2O2定量分析的比色策略。此外，与 DOX/SBA-15 相比，FeIX 接枝的 SBA-15 有利于较高的 DOX 负载量，并改善对癌细胞生长的抑制作用。同时，RTCA 动态监测 DOX/FeIX-SBA-15 对 A549 的细胞毒性，明显表明药物分子 DOX 从介孔缓释行为。在此基础上，该给药系统降低了 DOX 的细胞毒性，但仍能有效抑制肿瘤细胞的生长。总之，我们生产的作为固体催化剂和药物递送系统的氯化血红素接枝介孔二氧化硅纳米复合材料可以提供一个具有巨大生物医学潜力的多功能纳米平台。

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。