hGC33靶向索拉非尼纳米颗粒通过Wnt通路抑制协同抑制肝癌

摘要

肿瘤特异性抑制剂的递送是癌症治疗难题。抗体修饰纳米颗粒可将载药递送至过表达特定肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。本研究构建了修饰抗体hGC33的索拉非尼负载聚乙二醇-b-PLGA聚合物纳米颗粒，靶向糖聚蛋白-3（GPC3⁺），一种在肝细胞癌（HCC）中过表达的膜蛋白。研究发现：hGC33修饰纳米颗粒（hGC33-SFB-NP）通过特异性结合HCC细胞表面GPC3靶向GPC3⁺ HCC细胞，抑制Wnt诱导的信号转导，下调cyclin D1表达使HCC细胞G0/G1期阻滞，通过抑制上皮-间质转化（EMT）减弱HCC细胞迁移。hGC33-SFB-NP通过分别与GPC3分子协同抑制Ras/Raf/MAPK通路和Wnt通路，抑制HCC细胞迁移、细胞周期进程和增殖。体内实验显示hGC33-SFB-NP抑制肝癌生长，提高荷瘤小鼠生存率。结论：hGC33增强SFB-NP对HCC细胞靶向性；hGC33-SFB-NP通过双重阻断Wnt通路和Ras/Raf/MAPK通路协同抑制HCC进展。

引言

糖聚蛋白3（GPC3）是一种通过磷脂酰肌醇锚定在细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖。GPC3虽在发育期多组织表达，但大多数成人组织因启动子区DNA甲基化而部分抑制表达。然而，约70% HCC患者GPC3蛋白过表达，并通过与Wnt配体相互作用刺激经典Wnt信号转导，促进Wnt/Frizzled结合驱动HCC生长。经典Wnt信号通路激活是HCC恶性转化最常见事件之一。基于GPC3增强Wnt信号能力，假设GPC3过表达通过刺激经典Wnt通路促进HCC生长。

识别GPC3 C端表位（524–563）的治疗性单克隆抗体hGC33可抑制小鼠HepG2和Huh-7皮下移植瘤生长。hGC33经互补决定区移植人源化，抗癌效果与hGC33相当，已进入临床试验。这表明hGC33具有重要抗肿瘤活性，抗GPC3治疗可通过阻断Wnt及/或其他信号通路直接抑制HCC细胞增殖和/或生存。

然而，鉴于HCC发病机制复杂，单独阻断GPC3疗效有限。因此，探究HCC发病详细机制、识别诊断预后有前景生物标志物，有助于提供有效治疗靶点、改善患者预后。抗GPC3抗体被提出可增加HCC对化疗药物敏感性。hGC33联合标准化疗药物抗肿瘤活性近期已评估。索拉非尼是新型口服靶向HCC药物，通过阻断RAF/MEK/ERK介导的细胞信号通路直接抑制肿瘤细胞增殖遏制肿瘤生长。但索拉非尼体内非靶向分布和HCC中异常激活的Wnt信号限制药效并增加副作用。Wnt与Frizzled家族受体结合激活细胞内信号转导，调控细胞增殖、凋亡、迁移，导致包括HCC在内多种肿瘤耐药。

HepG2异种移植模型中，hGC33联合索拉非尼抑制肿瘤生长优于单用索拉非尼。聚合物纳米载体药物递送在癌症治疗中备受关注。抗癌药物负载纳米载体可防止体内非特异性分布和降解，提高生物利用度和抗肿瘤靶向性，简化药代动力学和治疗评估。聚乳酸-共-乙酸（PLGA）基制剂被认为是理想安全药物载体。聚乙二醇-b-聚(D,L-乳酸-共-乙酸)（PEG-b-PLGA）基于PEG和PLGA共聚物，水解后安全无毒，获美国FDA批准。因此，PEG-b-PLGA共聚物纳米载体静脉注射是实现靶向递送和增强疗效的有前景策略。此外，针对HCC细胞膜GPC3分子的特异性抗体hGC33应用不仅能提高纳米药物体内外靶向递送，还能阻断与GPC3相关的Wnt及/或其他信号通路，抑制癌细胞增殖/生存，可能实现协同抗肿瘤活性。

本研究探讨hGC33抗体修饰共聚物PEG-b-PLGA纳米颗粒是否能促进索拉非尼（hGC33-SFB-NP）体内外递送至HCC，通过HCC主动靶向改变药物药代动力学提高治疗效率。根据粒径、ζ电位、形态、包封率、载药量、体外药物释放全面表征靶向NP。以HepG2肝癌细胞细胞摄取表征体外靶向能力。通过比较索拉非尼和SFB-NP评估hGC33-SFB-NP生物分布和协同治疗效果。结果表明：hGC33-SFB-NP可靶向GPC3⁺ HCC，通过抑制Wnt和Ras/Raf/MAPK信号通路抑制细胞周期进程、增殖和肿瘤侵袭，协同抑制肝癌进展。

材料与方法

材料

hGC33抗体、MTT、DAPI、JC-1、DMSO购自Sigma-Aldrich（美国）。EDC·HCl和NHS购自启云生物（广州）。BCA蛋白定量试剂盒、香豆素-6、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自碧云天（上海）。马来酰亚胺-PEG-b-PLGA二嵌段共聚物（mal-PEG-b-PLGA；25,000–30,000 Da，PLGA，LA:GA w/w；PEG，13–15%）购自Polyscitech（美国）。PI3K抗体试剂盒（9655#）、p-Akt抗体试剂盒（9916#）、mTOR抗体试剂盒（9964#）、Bcl-2家族抗体试剂盒（9942#）、凋亡抗体试剂盒（9915#）、羊抗兔/抗鼠二抗购自Cell Signal Technology（美国）；cyclin B1和cyclin-dependent kinase购自Abcam（美国）。p-Rb、cyclin D1、CHK1、P53、p-BRCA1、RAD51、细胞色素C、MMP2、MMP9抗体购自Abcam（美国）。其他分析级试剂溶剂均购自正规供应商，无需纯化直接使用。

细胞与动物

HCC细胞系HepG2（美国典型培养物保藏中心）用含10% FBS（HyClone）、80 U/mL青霉素、80 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养，5% CO₂，37°C湿润环境。BALB/C裸鼠，20–22 g（5–6周），南京军科生物技术有限公司提供。SPF级饲养。所有动物护理按安徽理工大学动物护理要求进行。实验方案经安徽理工大学动物实验伦理委员会审批（批准号：2019dw013）。

纳米颗粒制备

称取mal-PEG-b-PLGA和SFB或香豆素-6溶于有机相（二氯甲烷/丙酮 3:2 v/v）。滴加至聚乙烯醇（PVA）溶液（5% w/v）中持续涡旋。探针式超声破碎仪（输出功率550 W，8次）冰上间歇超声制备油水乳液。乳液加入1% w/v PVA溶液磁力搅拌。8000 rpm离心30 min收集SFB和香豆素-6纳米颗粒，去离子水洗涤3次。

利用抗体hGC33游离巯基与马来酰亚胺反应形成硫醚键生成hGC33-NP。hGC33抗体与马来酰亚胺功能化NP按摩尔比5:1（hGC33:mal-PEG-b-PLGA）混合，4°C持续搅拌孵育16 h。hGC33抗体巯基与PEG链马来酰亚胺反应偶联至NP。Sepharose CL-4B柱层析除去未偶联抗体。BCA试剂盒（Thermo Fisher）确认蛋白偶联效率。

纳米颗粒表征

形态、粒径、包封率（EE）及稳定性

透射电镜（TEM，H-600，日立）评价NP形态。无药物hGC33-NP和无药物NP用傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Nicolet）溴化钾压片法测定。Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS（Malvern，英国）20°C测定平均粒径和ζ电位。超滤法评价药物包封率（EE）和载药量（LC）。样品加入超滤装置（100 kMWCO，Sartorius），8000 rpm，4°C离心25 min除游离药物。同体积样品溶于乙腈测总药量。高效液相色谱法测定浓度，吸收波长266 nm。EE% =（包封药物重量/总药物重量）×100%。LC% =（包封药物重量/NP重量）×100%。室温下预设时间点（0.5、1、2、4、8、12、16、20、24 h）动态光散射（DLS）测定NP粒径变化评价稳定性。

体外药物释放与细胞摄取实验

分子量截留10 kDa透析袋考察药物释放。1 mL NP装入透析袋（MWCO 8,000–10,000 Da，Spectrum Labs），浸入PBS，磁力搅拌25°C。100 mL 0.2 M PBS（pH 7.4）中测定7天药物释放曲线。高效液相色谱测定样品药物浓度。后续研究用粒径相同的hGC33-香豆素6-NP评价hGC33-SFB-NP靶向性。HepG2（GPC3⁺）和Li-7（GPC3⁻）分别与hGC33-香豆素6-NP共培养0.5、2、4 h（37°C，5% CO₂）。共培养细胞PBS洗涤3次，4%甲醛固定10 min；5 μg/mL Hoechst 33,342染核15 min定位细胞内NP。激光共聚焦显微镜（Olympus FV1000）分析细胞内纳米颗粒图像。

体外细胞效应

MTT法测定游离hGC33(Ab)、游离SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP细胞毒性。对数生长期HepG2（GPC3⁺）和Li-7（GPC3⁻）96孔板接种4000 cells/well，37°C，5% CO₂孵育48 h。用上述制剂处理48 h。按文献[20] MTT法测定抗增殖活性。490 nm测吸光度，SPSS 17.0计算半最大抑制浓度（IC₅₀）。

细胞侵袭能力测定

对数生长期细胞6孔板接种5×10⁴ cells/well，吸头划痕，换无血清培养基。对照组和实验组分别在0、24、48 h记录划痕愈合。同数量细胞接种Transwell小室，处理游离hGC33、游离SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP。下室加500 μL 10% FBS培养基。24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。计算划痕愈合面积和迁移细胞数评价迁移能力。

细胞周期测定

6孔板过夜贴壁后，用游离hGC33(Ab)、游离SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP处理24 h，收集细胞乙醇固定。碘化丙啶染色后流式细胞术检测，ModFit 3.0（Verity Software House）分析细胞周期。

Western Blot

6孔板过夜贴壁，用游离hGC33、游离SFB、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP处理24 h。收集各处理组细胞提取蛋白测定。BCA蛋白试剂盒（Biosharp，合肥）测定校准蛋白浓度。12% SDS-PAGE电泳，转印PVDF膜，脱脂奶封闭。一抗（1:1000稀释）4°C过夜孵育，二抗（1:2000）室温孵育1 h。ECL底物（Thermo Fisher）显色，凝胶成像分析系统显示图像，β-actin作对照。

体内抗肿瘤活性

评价游离hGC33、游离SFB、hGC33-null-NP、SFB-NP、hGC33-SFB-NP对HCC体内生长抑制。按安徽理工大学伦理委员会动物健康规定，所有实验在BALB/c小鼠笼养，温控室（23±2°C），12 h/12 h明暗周期。5×10⁶活HepG2细胞悬液50 μL皮下接种于5周龄雌性BALB/c小鼠（20–22 g）右腹。肿瘤体积达~50 mm³时随机分6组（每组10只）。尾静脉注射：生理盐水对照NS（200 mg/kg null NP in 200 μL PBS）、hGC33-null-NP（200 μL PBS中，相当于hGC33=100 μg/kg/次）、游离hGC33（200 μL PBS中，100 μg/kg/次）、游离SFB（SFB剂量：8 mg/kg/次）、SFB-NP（SFB剂量：8 mg/kg/次）、hGC33-SFB-NP（相当于SFB=8 mg/kg/次，hGC33=100 μg/kg/次）。隔天1次，共10次。每4天测体重、肿瘤大小。肿瘤体积公式：体积=0.5×L×W²（L、W为肿瘤长宽）。给药4周后，乙醚麻醉，测肿瘤大小重量。此外取瘤、心、肝、肾、肺、脾，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，数码显微镜评价组织学变化。

统计分析

数据以均数±标准差（SD）表示，SPSS 18.0方差分析。两两比较用双尾Student's t检验。P < 0.05为统计学显著差异。

结果

纳米颗粒表征与体外药物释放

NP直径和表面性质影响细胞摄取、药物释放、体内分布，故表征相应参数。SFB-NP、hGC33-null-NP、hGC33-SFB-NP形态、粒径、粒径分布汇总见图1。TEM观察hGC33-SFB-NP形态（图1a）显示刚性核心边缘模糊，表明hGC33存在于NP表面。三种NP粒径均100–150 nm，典型单峰分布。hGC33-SFB-NP平均直径（120.2±10.2 nm）略大于hGC33-null-NP、SFB-NP、null NP（图1a、Table 1）。hGC33-SFB-NP和hGC33-null-NP表面有薄球形不清晰膜，表明抗体hGC33存在于NP表面。粒径增加证实hGC33膜存在。NP制备前¹H-NMR（图1b）确认hGC33-SFB-NP合成。5.2 ppm和1.58 ppm峰归属乳酸–CH₃质子；4.8 ppm峰归属乙酸–OCH₂–；3.6–3.8 ppm峰归属PEG重复单元–CH₂CH₂O–质子。PEG-b-PLGA和Ab-PEG-b-PLGA NP表面化学用FTIR研究（图1c）。PEG-b-PLGA聚合物谱中~1750 cm⁻¹强带源于PLGA链羰基（C=O）伸缩；2880 cm⁻¹带源于PEG链–CH伸缩。同时2520 cm⁻¹出现峰，归属hGC33抗体–SH伸缩峰。¹H NMR和FTIR结果表明抗体接枝于PEG-b-PLGA聚合物主链上。

有趣的是，hGC33-SFB-NP和SFB-NP在含10% FBS DMEM（pH 7.4）中前~4天快速释放药物，随后缓慢稳定释放；20天累积释放SFB分别约77%和65%（图1d）。差异可能因PEG-b-PLGA基质表面亲水分子增加水化促进水解加速NP降解。为测定NP稳定性，将hGC33-SFB-NP、hGC33-null NP、null-NP、SFB-NP置于含10% FBS DMEM（pH 7.4）和PBS（pH 7.4）中。各NP粒径2周以上保持稳定。SFB从hGC33-SFB-NP持续稳定释放14天，但DMEM中粒径变化较10% FBS中略有变化（图1e、f）。hGC33-SFB-NP稳定性适合SFB持续生物学作用。

大ζ电位引起NP间强静电排斥维持分散体系稳定。Table 1显示hGC33-SFB-NP、hGC33-null-NP、SFB-NP ζ电位分别为−18.2±2.2、−18.5±1.8、−15.9±2.1 mV，可能因抗体hGC33糖蛋白醛基、羧基、磷酸基负电荷。负电荷NP导致悬液高稳定性。此外，正常生理环境细胞表面带负电，制备NP排斥低电荷细胞，对组织细胞毒性低。此外，null-NP和SFB-NP粒径分布（PDI 0.18、0.19）略小于hGC33-null-NP（PDI=0.21）和hGC33-SFB-NP（PDI=0.23），但无显著差异，NP粒径均一性良好。Table 1列出NP粒径、分布、ζ电位及SFB包封率、载药量结果。超速离心除去未偶联GPC3抗体hGC33，BCA蛋白分析显示hGC33抗体与NP结合效率79.5%±2.9%。

hGC33-香豆素6-NP高效靶向GPC3⁺ HCC HepG2细胞

验证NP上hGC33抗体是否保留特异性靶向GPC3能力，以GPC3⁺ HepG2和GPC3⁻ Li-7为靶细胞，hGC33-香豆素6-NP为示踪NP，分别孵育2、4、8 h。PBS洗涤3次，DAPI染核，固定后Leica荧光显微镜（DMi8，德国）拍照。相同时间下HepG2绿色荧光显著强于Li-7（图2），表明进入HepG2的hGC33-香豆素6-NP显著多于Li-7。结果证实hGC33-香豆素6-NP上hGC33抗体保留靶向GPC3能力并介导NP内化。HepG2和Li-7中GPC3表达经间接免疫荧光和细胞化学染色检测：HepG2过表达GPC3，Li-7不表达GPC3（图2）。

hGC33-null-NP抑制HepG2细胞增殖

测定hGC33修饰NP（hGC33-null-NP）是否抑制HCC生长，检测GPC3阳性HepG2和阴性Li-7生长抑制。结果：hGC33-null-NP和hGC33处理24 h后均抑制GPC3阳性HepG2生长，但hGC33抑制效果更显著（图3a）；相反，hGC33-null-NP和hGC33均不影响GPC3阴性Li-7生长（图3b）。hGC33-null-NP（相当于0.1 μM hGC33）和hGC33（0.1 μM）对HepG2增殖代表性时间进程见图3c。因hGC33识别GPC3 C端肽段，hGC33抑制HepG2优于hGC33-null-NP。结果提示hGC33-null-NP中hGC33分子可能有空间位阻效应，影响其与表位结合能力。

hGC33-null-NP抑制HepG2细胞周期

研究hGC33抗体修饰NP分子活性机制，考察hGC33-null-NP处理HepG2细胞周期进程。HepG2中hGC33-null-NP和hGC33显著增加G1期细胞比例（图4a、b），表明两者均可诱导G1期细胞周期阻滞。此外，两者均显著下调HepG2中cyclin D1表达（图4c、d）。

HepG2、Huh-7、Li-7细胞Wnt激活

了解经典Wnt/β-Catenin信号在HCC细胞激活情况，首先检测各HCC细胞系Wnt配体和受体卷曲蛋白（Frizzled，FZD/Frz）表达：HepG2（GPC3⁺⁺）、Huh-7（GPC3⁺）、Li-7（GPC3⁻）。结果显示Wnt3a和转导β-Catenin通路的FZD受体在所有细胞系表达，尤其HepG2和Huh-7高表达（图5）。

hGC33-null-NP抑制Wnt3a诱导的Wnt信号转导依赖性细胞增殖

研究表明GPC3胞外段可能是Wnt协同受体，促进Wnt/β-Catenin信号激活转导。因此，HepG2（GPC3⁺）、Huh-7（GPC3⁺）、Li-7（GPC3⁻）与hGC33和hGC33-null-NP共孵育时，hGC33和hGC33-null-NP阻断Wnt/β-catenin信号激活，抑制Wnt3a条件培养基中HepG2和Huh-7增殖，但不抑制Li-7增殖。Li-7增殖最可能因细胞表面缺乏GPC3（图6）。结果表明hGC33和hGC33-null-NP特异性结合细胞膜GPC3分子，部分中和Wnt3a致有丝分裂活性，抑制Wnt/β-catenin信号通路。但hGC33-null-NP抑制增殖弱于hGC33，可能NP空间结构干扰hGC33功能，无法完全阻断GPC3与Wnt3a相互作用。

hGC33-null-NP抑制HepG2和Huh-7中Wnt3a诱导信号转导

了解hGC33-null-NP对HCC细胞Wnt/β-catenin信号影响，提取hGC33或hGC33-null-NP处理HepG2和Huh-7蛋白。Western blot显示：hGC33-null-NP处理后pYAP和pβ-catenin水平升高，YAP和β-catenin水平下降。此外，hGC33-null-NP组cyclin D1、CD44、VEGF、c-MYC水平低于对照组，但低于hGC33处理组。HepG2和Huh-7观察到相似效应（图7）。

hGC33-SFB-NP或hGC33通过抑制上皮间质转化（EMT）减弱HCC细胞迁移

HCC是全球最致命癌症之一，发病率持续上升。索拉非尼是晚期HCC唯一获批标准治疗，可改善患者生存。但临床和临床前观察提示索拉非尼疗效有限，因耐药快速产生。因此阐明索拉非尼耐药逃逸机制是HCC研究重点。近年来，EMT在HCC进展和耐药中作用受关注。EMT指上皮向间质细胞转化，赋予细胞转移侵袭能力，包括获得干细胞特性、减少凋亡衰老、促进免疫抑制、参与癌症发生发展。E-cadherin表达丢失被视为致癌和EMT关键步骤。EMT是癌细胞获得侵袭性的多步分子细胞重编程过程，主要通过下调E-cadherin、角蛋白、粘蛋白、ZO-1（紧密连接蛋白）；上调vimentin、α-SMA、FN纤维连接蛋白、MMPs（基质降解）、N-cadherin、snail、slug、twist、Rho、TGF-β、FGF、I型胶原、II型胶原实现EMT特征肿瘤侵袭、转移、抗凋亡。这些蛋白表达变化主要涉及Wnt/β-catenin和Ras/Raf/MAPK信号通路激活。

实验显示：NP载体表面hGC33抗体可抑制Wnt3a诱导β-catenin信号转导，下调β-catenin、CD44、VEGF、cyclin D1、c-MYC表达。此外，hGC33-SFB-NP抑制Ras/Raf/MAPK通路激活，抑制HCC增殖和凋亡。hGC33和SFB协同作用，抑制EMT降低HCC迁移（图8）。

hGC33-SFB-NP体内抑制肝细胞癌生长并提高荷瘤小鼠生存率

评价hGC33-SFB-NP体内抗肿瘤活性，HepG2和Huh-7分别皮下接种雌性BALB/c裸鼠右腹和背部。移植瘤达~30 mm³时随机分组（hGC33-SFB-NP、hGC33-null-NP、SFB-NP、游离hGC33、游离SFB、对照组），每组n=5。图9a、b显示hGC33-SFB-NP显著延缓小鼠肿瘤生长，优于PBS对照和其他治疗。相比PBS对照，hGC33-null-NP、SFB-NP、游离hGC33、游离SFB均有一定抑制作用，因游离hGC33和游离SFB直接分别抑制Wnt信号和Ras/Raf/MAPK，可一定程度抑制HCC增殖。纳米颗粒修饰hGC33（hGC33-null-NP）虽通过化学键连接纳米表面，但未影响hGC33靶向GPC3和抑制Wnt活性。纳米载药SFB（SFB-NP）被细胞内吞后降解释放SFB抑制HCC生长。总体而言，hGC33-SFB-NP对HepG2移植瘤抑制强于Huh-7，可能因HepG2表达GPC3分子。

各治疗组裸鼠体重变化见图9c、d。对照组体重逐渐下降。游离hGC33、游离SFB、SFB-NP、hGC33-null-NP组体重亦渐降，无显著优于对照组。但hGC33-SFB-NP组HepG2和Huh-7荷瘤裸鼠体重仅轻微下降，治疗周期内相对稳定。结果支持新型hGC33-SFB-NP纳米药物在裸鼠无显著毒性，纳米载体负载SFB和表面修饰hGC33产生加性甚至协同抗肿瘤效应。

讨论

为考察hGC33-SFB-NP适用性于靶向HCC治疗，测试模型偶联物：体外结合HCC细胞GPC3能力；抑制GPC3阳性HCC增殖、迁移、Wnt/β-catenin信号转导能力；体内抑制GPC3过表达HCC能力。

为共价结合GPC3特异性抗体hGC33与mal-PEG-b-PLGA NP，利用hGC33 Fc段游离巯基与马来酰亚胺功能化PEG-b-PLGA（mal-PEG-b-PLGA）形成稳定硫醚键交联。偶联是靶向GPC3阳性HCC前提。一系列实验包括透镜检测NP直径和ζ电位变化、hGC33-SFB-NP细胞内摄取，验证了hGC33-SFB-NP对HepG2（GPC3⁺）靶向性。结果表明抗体hGC33结合活性未受偶联改变。

共聚焦显微镜直接检测GPC3⁺ HepG2和GPC3⁻ Li-7对PEG-b-PLGA NP表面修饰hGC33吞噬效应。HepG2和Li-7共培养hGC33-香豆素6-NP后，HepG2绿色信号强度显著高于Li-7，表明HepG2内NP更多。这一发现与hGC33抗体修饰PEG-b-PLGA NP特异性结合HCC细胞表面GPC3并被内化一致。hGC33修饰NP内化效率取决于细胞表面GPC3抗原表达水平。

标准MTT法测定抑制肝癌细胞增殖效率。hGC33-null-NP和hGC33均抑制GPC3阳性HepG2生长，但均不影响GPC3阴性Li-7增殖（图3b）。动物水平，hGC33-null-NP或hGC33单独一定程度抑制Huh-7和HepG2移植瘤生长，而hGC33-SFB-NP导致小鼠Huh-7和HepG2肝癌移植瘤生长停滞。hGC33-null-NP显著抑制GPC3阳性肝癌细胞表明PEG-b-PLGA NP表面修饰hGC33对HCC增殖抑制依赖细胞表面GPC3抗原表达。

GPC3调控HCC发病多通路，包括Wnt和YAP信号。GPC3与Wnt配体相互作用，可能作为Wnt协同受体促进Wnt/Frizzled结合驱动HCC生长。进一步考察纳米药物表面修饰hGC33对肝癌细胞Wnt信号通路影响。同游离hGC33一样，纳米药物表面修饰hGC33不仅通过阻断表达GPC3的HepG2和Huh-7中Wnt诱导信号转导抑制肝癌细胞增殖，还抑制Wnt3a诱导β-catenin和YAP信号转导。先前研究显示HCC中YAP表达受β-catenin转录水平调控。本研究游离hGC33和纳米药物表面修饰hGC33抑制Wnt3a诱导YAP活性，表明从β-catenin复合物释放的YAP/TAZ也可启动经典Wnt信号转导。结果提示典型Wnt和YAP通过多种机制串扰。相比hGC33-null-NP和hGC33，hGC33-SFB-NP体内外具有更强抗增殖和抗迁移能力。因此，hGC33不仅决定HCC细胞特异性，还通过阻断肿瘤生长相关关键信号（Wnt/β-catenin和Wnt/YAP通路）增强SFB对HCC增殖迁移抑制效果。

结论

针对肝细胞癌细胞过表达的膜蛋白糖聚蛋白-3的抗体hGC33，增加了索拉非尼负载聚乙二醇-b-PLGA聚合物纳米颗粒（hGC33-SFB-NP）对癌细胞上糖聚蛋白-3的结合。抗体修饰纳米颗粒给药协同抑制Wnt诱导信号转导和Ras/Raf/MAPK信号通路；通过下调cyclin D1表达使肝细胞癌细胞G0/G1期阻滞，通过抑制上皮-间质转化减弱癌细胞迁移。hGC33-SFB-NP体内抑制肝癌生长，提高荷瘤小鼠生存率。

数据与材料可用性

是，所有数据均已在文中呈现。

缩写

AKT/PKB:

蛋白激酶B

c-MET:

HGFR：肝细胞生长因子受体

EE%:

包封效率%

EMT:

上皮-间质转化

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

¹H NMR:

¹H-核磁共振波谱

HCC:

肝细胞癌

LC%:

载药量%

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

PDI:

多分散指数

PI3K:

磷脂酰肌醇-3-激酶

pRAD51:

磷酸化RAD51

SFB:

索拉非尼

TEM:

透射电镜

YAP:

Yes相关蛋白-1