优化sp-ICP-MS预处理：揭示生物组织中银纳米颗粒分布

摘要

工程纳米颗粒（ENPs）快速普及加剧人体暴露风险，现有分析手段难以同时量化表征生物基质中的ENPs。单颗粒电感耦合等离子体质谱（sp-ICP-MS）可同步实现定量与物理特性评估，但其在组织中的应用受限于预处理协议不足，易改变颗粒完整性或降低回收率。本研究以银纳米颗粒（nAg）为模型，系统评估五种溶解剂——氢氧化钠（NaOH）、四甲基氢氧化铵（TMAH）、硝酸（HNO₃）、盐酸（HCl）和蛋白酶K。NaOH处理实现>90%组织溶解，同时保持颗粒尺寸并最小化电离，优于其他试剂。将NaOH方案扩展至心、肺、脾、肾匀浆验证其广泛适用性。最终应用优化预处理考察静脉注射nAg与Ag⁺在小鼠血液和肝脏的命运：sp-ICP-MS显示肝脏中nAg以颗粒形式保留（~80%），血液中高度电离（~95%）；Ag⁺则在两者中均保持离子态。研究证实NaOH预处理实现体内ENPs的准确sp-ICP-MS分析，凸显颗粒-离子转化对生物分布与动力学的决定性影响。

引言

纳米技术进步加速了<100 nm工程纳米颗粒（ENPs）生产，其增强组织穿透性与反应表面等独特优势广泛应用于消费品与药物。银纳米颗粒（nAg）因持续释放Ag⁺及导电特性被大量使用，但纳米尺度特性也带来血脑屏障破坏、炎症反应等健康风险。鉴于ENPs无处不在，严谨评估危害与暴露——共同定义ENP风险——至关重要。

现有研究多聚焦ENP毒性，量化实际暴露场景的较少。近期工作证实培养细胞中nAg与Ag⁺呈现不同细胞内分布，凸显组织内区分颗粒与离子的必要性。常规ICP-MS仅测总金属含量，无法区分颗粒/离子形态；TEM提供尺寸信息但缺乏定量能力。因此，耦合精准定量与物理特性分析的方法对阐明ENP生物转化至关重要。

单颗粒ICP-MS（sp-ICP-MS）可检测单个颗粒，通过峰强估算尺寸、峰频计算浓度，并借背景信号分析区分离子。既往研究多用于环境与商业样品，生物组织应用受限主要因预处理不足导致ENPs降解或改性。不同溶解剂在组织裂解、ENP回收、颗粒完整性保持上差异显著。本研究旨在评估优化小鼠组织中nAg的sp-ICP-MS预处理策略，建立同步定量表征体内ENPs的可靠工作流。

材料与方法

ENPs

30、70、100 nm Biopure nAg（nAg30、nAg70、nAg100）购自nanoComposix（美国圣地亚哥）。传输效率校准标准RM8013来自NIST（美国盖茨堡）。所有ENP悬液使用前超声10 min。

试剂

0.1 mol L⁻¹ NaOH、25% TMAH、30% HCl、蛋白酶K购自和光纯药（日本大阪）。70% HNO₃购自关东化学（日本东京）。

动物

雌性BALB/c小鼠（6周龄）购自日本SLC（静冈）。12 h明暗循环，自由饮食饮水。所有操作符合大阪大学伦理规范。

动态光散射测粒径分布

nAg稀释至10 µg mL⁻¹ Ag于MilliQ水，1 mL置于zeta毛细管池，Malvern Zetasizer Nano-ZS测定平均直径与zeta电位。

总Ag质量测定

Agilent 7700x ICP-MS测总Ag浓度，条件：射频功率1550 W，Ar流量1.05 L min⁻¹，停留时间100 ms，铑作内标，三次重复。

sp-ICP-MS分析与计算

同仪器，射频功率1550 W，Ar流量1.05 L min⁻¹，停留时间10 ms，总运行30 s。粒径计算用RIKILT开发的单颗粒工具。

sp-ICP-MS临界颗粒浓度

1.0 mg mL⁻¹ nAg母液系列稀释至2000、800、700、600 pg mL⁻¹，再十倍稀释得40个浓度点供sp-ICP-MS评估。

小鼠肝脏预处理方法优化

肝脏匀浆制备：组织与PBS（w/v=1:10）混合匀浆。每份匀浆加标100 ng mL⁻¹ nAg，按1:1体积比加入以下试剂：0.1 mol L⁻¹ NaOH、25% TMAH、30% HCl、蛋白酶K（10 U mL⁻¹于0.01 M Tris-HCl、0.01 M EDTA、0.5% SDS）。37 °C孵育3 h，收集残渣称重，上清液500倍稀释供sp-ICP-MS。

NaOH预处理在多器官通用性评估

心、肺、脾、肾匀浆（PBS w/v=1:10）加标100 ng mL⁻¹ nAg，加入1 mol L⁻¹ NaOH（1:1 v/v），37 °C孵育3 h。残渣称重，上清500倍稀释供sp-ICP-MS。

单次静脉注射nAg₁₀₀与Ag⁺小鼠体内量化与物性分析

nAg₁₀₀与AgNO₃稀释至0.25 mg mL⁻¹（Ag⁺）于5%葡萄糖。小鼠静脉注射nAg₁₀₀（1.5或0.75 mg kg⁻¹）、AgNO₃（1.5或0.75 mg kg⁻¹折算Ag⁺）或5%葡萄糖（对照）。注射后24 h采集血液与肝脏。肝脏匀浆（PBS w/v=1:10）经TMAH或NaOH（1:1 v/v）处理供ICP-MS与sp-ICP-MS分析。

结果与讨论

sp-ICP-MS颗粒检测优化

准确sp-ICP-MS要求每停留时间仅一个颗粒进入等离子体，否则多颗粒误合并为单事件导致尺寸高估。系列稀释nAg₁₀₀绘制检出与理论颗粒数关系：低浓度线性，高浓度检出数少于理论值，表明多颗粒干扰（图1a）。理论值减检出值显示：检出事件超500时偏差显著，确立可靠分析实用阈值（图1b）。

不同直径nAg验证确认sp-ICP-MS设置给出准确尺寸估算：nAg30、nAg70、nAg100实测直径分别为30.0±1.2 nm、65.1±0.6 nm、97.4±0.6 nm。动态光散射（DLS）结果（36.4±1.6 nm、70.6±1.7 nm、101±1.0 nm）与sp-ICP-MS吻合，验证分析协议。

小鼠肝脏组织nAg检测预处理优化

有效预处理需裂解组织、回收ENP且不改变理化状态、避免电离或聚集。对比NaOH、TMAH、HNO₃、HCl、蛋白酶K五种溶解剂，使用加标100 ng mL⁻¹ nAg的肝脏匀浆。

残渣分析显示NaOH、TMAH、蛋白酶K溶解>90%肝脏基质，HNO₃和HCl仅~75%（图2a）。考虑到组织~80%为水，酸性试剂溶解度低说明基质去除不全。

sp-ICP-MS回收数据：酸处理完全电离nAg，蛋白酶K部分电离；NaOH和TMAH保持nAg完整颗粒，离子检出可忽略（图2b）。粒径分布显示TMAH致使峰值从100 nm偏移至120 nm且分布变宽（图2c-d），提示聚集。NaOH处理维持原始100 nm尺寸（图2c-d），确证其适用性。

TMAH分解产三甲胺和甲醇提高介电常数，降低nAg zeta电位促进聚集。短时（1 min）TMAH暴露保持粒径~100 nm，证实长时间处理导致聚集。

NaOH预处理多器官通用性评估

为验证NaOH广泛适用性，对心、肺、脾、肾匀浆加标nAg应用该方案。残渣分析显示>95%溶解（图3a）。sp-ICP-MS在所有组织中检出加标Ag为颗粒态，回收率在FDA可接受的80–120%范围（图3b）。各器官粒径均维持~100 nm（图3c-d），凸显方法一致性。

数据共同确证：NaOH预处理为sp-ICP-MS在多种动物组织中量化表征nAg提供稳健可复现平台。

体内nAg与Ag⁺定量与物性分析的sp-ICP-MS评估

为展示实用价值，对比静脉注射nAg₁₀₀与Ag⁺在小鼠血液和肝脏的命运。ICP-MS确认两者两partment均有Ag（图4a,b）。但sp-ICP-MS揭示不同物种分布：血液中无论给药形式Ag主要以离子存在（>95%）；肝脏中nAg₁₀₀源Ag约80%保持颗粒态，Ag⁺给药则极少颗粒（图4c,d）。肝脏nAg₁₀₀粒径分析显示平均~80 nm，小于给药100 nm，反映肝组织内部分电离与可能转化（图4e）。

结论

建立了优化NaOH预处理协议，实现小鼠组织中银纳米颗粒的准确sp-ICP-MS分析，同步提供定量与粒径表征。应用该工作流于静脉注射nAg₁₀₀与Ag⁺显示：nAg体内部分电离，肝脏~80%保持颗粒态，血液~95%电离。凸显评估ENP生物分布与动力学时必须考虑颗粒-离子转化。该方法广泛适用于多种组织，可用于风险评估研究阐明ENP暴露动态与生物响应。

数据与材料可用性

本文未生成或分析数据集，不适用数据共享。

缩略语

Ag

银

Ag⁺

银离子

DLS

动态光散射

ENPs

工程纳米颗粒

HCl

盐酸

HNO₃

硝酸

ICP-MS

电感耦合等离子体质谱

nAg

银纳米颗粒

nAg₁₀₀

100 nm nAg

nAg₃₀

30 nm nAg

nAg₇₀

70 nm nAg

NaOH

氢氧化钠

PBS

磷酸盐缓冲液

sp-ICP-MS

单颗粒ICP-MS

TEM

透射电镜

TMAH

四甲基氢氧化铵