sp-ICP-MS 预处理方法的优化和评估，以揭示银纳米颗粒在体内的分布

介绍

纳米技术的最新进展加速了小于 100 nm 的工程纳米粒子 (ENP) 的开发。由于与其他微型或更大尺寸的材料相比，ENP 具有增强的组织渗透性和表面反应等有益特性，因此被广泛用于各种产品，包括化妆品、食品和药品 [1, 2]。例如，银纳米粒子 (nAg) 是最常见的 ENP 之一，因其稳定释放 Ag ⁺ 被用于抗生素 .此外，它们在印刷电子技术中被用作导电材料 [3]。相比之下，与 nAg 的小粒径相关的独特物理化学性质可能是危险的。众所周知，这些颗粒会破坏血脑屏障并诱发炎症 [4]。 ENPs 在日用产品中使用的增加已经使人类暴露于各种类型的 ENPs。应评估其继续使用以确定其安全性 [2, 3]。

为了确保安全，必须了解ENPs的“风险”，即“危害”（潜在毒性）和“暴露条件”的综合概念。虽然 ENP 的危害已在世界范围内进行了分析，但很少有研究检查 ENP 的暴露情况 [5]。此外，最近有报道称，掺入培养细胞的 nAg 的细胞内分布不同于 Ag ⁺ [6] 而那个 Ag ⁺ 小鼠组织中的微粒 [7]。因此，有必要对其粒径等物理性质进行评价，区分体内的粒子和离子[3, 6,7,8]。

使用目前可用的分析技术，定量分析 ENPs 在体内的物理特性具有挑战性。电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 适用于定量分析，但不适用于物理性质分析，因为在定量过程中无法区分离子和粒子等所有目标。相比之下，透射电子显微镜 (TEM) 适用于分析物理特性，但不适用于量化 ENP，因为只能观察到组织的一部分。因此，需要一种同时对ENPs进行物理性质分析和定量分析的新方法来研究其生物转化。

单颗粒 ICP-MS (sp-ICP-MS)，它基于 ICP-MS，在每个停留时间内将一个或不引入一个颗粒进入分析仪，是一种通过分析峰强度和颗粒浓度来确定颗粒尺寸的有吸引力的方法峰值速率。可以通过分析峰值信号和背景信号来区分粒子和离子 [9]。之前的一些研究报道了使用 sp-ICP-MS 对 ENP 进行定量和物理性质分析 [10, 11]。

然而，这些研究大多使用 sp-ICP-MS 分析环境水或含有 ENP 的商业产品 [10, 11]，少数研究采用 sp-ICP-MS 分析生物组织。此外，这些研究通过蛋白酶 K 消化或使用四甲基氢氧化铵 (TMAH) 对组织进行预处理，以溶解蛋白质和脂质基质。由于不同的试剂具有不同的增溶特性，预处理方法的变化可能会影响分布在组织中的 ENPs 的回收率。此外，重要的是预处理方法不影响ENPs的大小或离子性质，有效地回收分布在组织中的ENPs。

本研究以nAg为模型ENPs，对生物样品中sp-ICP-MS的不同预处理方法进行评估和优化，以测定体内ENPs的数量和物理性质。

材料和方法

ENPs

30、70 和 100 纳米的“生物纯”nAg（nAg30、nAg70 和 nAg100）购自 nanoComposix（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。 RM8013 用作计算运输效率的标准，从美国国家标准与技术研究所（美国马里兰州盖瑟斯堡）获得。每种类型的ENPs在使用前均经超声处理10 min。

试剂

0.1 mol/L 氢氧化钠 (NaOH)、25% TMAH、30% 盐酸 (HCl) 和蛋白酶 K 的溶液购自 Wako（日本大阪）。 70% 硝酸 (HNO3) 溶液购自 Kanto Kagaku（日本东京）。

动物

BALB/c 小鼠（雌性，6 周）购自 Japan SLC（Shizuoka，Japan）。小鼠被关在一个有 12 小时光/暗循环的房间里（8:00 开灯，20:00 关灯）。随意提供食物和水。实验方案符合日本大阪大学的伦理准则。

通过动态光散射测量粒度分布

nAg 在milliQ 水中稀释至最终银(Ag) 浓度为10 μg/mL。接下来，用1 mL溶液填充尺寸和zeta毛细管细胞（Malvern Instruments，Malvern，UK），用Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments）测量颗粒分布和平均直径。

测量 Ag 的总质量

为了测量样品中的总 Ag 浓度，使用了 Agilent 7700x（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）。分析条件为 RF 功率 1550 W，载气 1.05 L/min Ar，停留时间 100 ms。在 MS 模式下重复测量 3 次。使用内标法，铑用作Ag的内标。 ICP-MS 分析的目标元素为 ¹⁰³ Rh 和 ¹⁰⁷ 银。 Ag和铑标准溶液购自Wako（日本大阪）。

sp-ICP-MS 分析及其计算

对于 sp-ICP-MS 分析，我们使用了与总 Ag 分析类似的 Agilent 7700x（安捷伦科技公司；美国加利福尼亚州圣克拉拉）。分析条件如下：RF功率1550 W，载气1.05 L/min Ar，停留时间10 ms，分析时间30 s。粒度计算采用RIKILT公司发布的单粒子计算工具[12]。

sp-ICP-MS 的临界粒子浓度

nAg 储备溶液浓度为 1.0 mg/mL，用于制备 2000、800、700 和 600 pg/mL 溶液。然后将这些溶液中的每一种连续稀释 10 倍以获得 40 种不同的 nAg 溶液。我们通过sp-ICP-MS测定了这40个样品的颗粒浓度。

小鼠肝脏预处理方法的优化

从小鼠收集的肝脏与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (w /v 1:10 的比例），然后均质。将匀浆与 100 ng/mL nAg 溶液混合。然后在 v 下用以下试剂之一处理混合物 /v 比例为1:1—0.1 mol/L NaOH溶液、25% TMAH、30% HCl或蛋白酶K溶液（10 U/mL蛋白酶K、0.01 M Tris-HCl、0.01 M EDTA和0.5% SDS）。将样品在 37 °C 下培养 3 小时，收集残留物并称重。将上清液稀释 500 倍，用 sp-ICP-MS 进行分析。

NaOH 预处理在各种器官中的多功能性评价

从小鼠收集的心脏、肺、脾和肾脏与 PBS (w /v 1:10 的比例），均质，并与 100 nm/mL nAg 混合。接下来，1 mol/L NaOH 溶液在 v /v 加入 1:1 的比例并在 37 °C 下孵育 3 小时。孵育后，收集残留物并称重。上清液稀释500倍，sp-ICP-MS分析。

评估 nAg100 和 Ag ⁺ 的数量和物理特性 小鼠单次静脉给药后

对于静脉给药，将 nAg100 和 AgNO3 稀释至 0.25 mg/mL（作为 Ag ⁺ ) 5% 葡萄糖溶液。 BALB/c 小鼠静脉注射 nAg100（1.5 或 0.75 mg/kg）、AgNO3（1.5 或 0.75 mg/kg 作为 Ag ⁺ )，或 5% 葡萄糖溶液（对照）。 24 h后，收集处死小鼠的血液和肝脏。将肝脏与 PBS (w /v 1:10 的比例）并均质化。将血液和肝脏匀浆与 TMAH 溶液混合 (v /v 比例为 1:1) 和 NaOH 溶液 (v /v 比例为 1:1)，分别。这些样品通过 ICP-MS 分析以测量 Ag 浓度，并通过 sp-ICP-MS 评估物理性质，如粒径和粒子与离子之间的区别。

结果和讨论

通过 sp-ICP-MS 优化粒子检测

在 sp-ICP-MS 分析中，重要的是在每个驻留时间内将一个或不引入一个粒子到检测器中。如果多个粒子在停留时间内被引入检测器，则多个粒子的总质量被视为单个粒子的质量 [13]。因此，样品必须充分稀释才能进行 sp-ICP-MS 分析。相比之下，SP-ICP-MS 分析 ENP 浓度非常低的样品会导致颗粒分布和尺寸数据不准确。

为了确定 nAg100 的浓度与检测到的粒子数之间的关系，我们连续稀释 nAg100 储备溶液以通过 sp-ICP-MS 进行评估。结果表明，在相对较低的 Ag 浓度区域中，检测到的粒子数量在理论上和线性增加。相比之下，在相对较高的 Ag 浓度下，检测到的颗粒数量低于理论值（图 1a）。该数据表明，在较高的 Ag 浓度下，在每个停留时间内，多个粒子往往会被引入检测器，从而导致对粒子尺寸的高估。因此，有必要确定与理论值没有差异的最大检测颗粒数，以准确评估颗粒尺寸。接下来，我们从理论值中减去检测到的粒子数，并将差异绘制为纵轴。结果表明，当检测到的粒子数> 500 时，会出现尺寸估计的差异。这表明有必要在分析时间内检测到 ≤ 500 个粒子（图 1b）。虽然这些数据是在单次试验中获得的，但重复实验显示出相同的结果（数据未显示）。

确定每个驻留时间的最佳粒子数以进行准确的 sp-ICP-MS 分析。通过 sp-ICP-MS 分析了一系列 nAg 溶液（600 fg/mL 至 2,500 pg/mL）。 一 为了确定 nAg100 的浓度与检测到的粒子数之间的关系，绘制了检测到的粒子（实线）和理论值（虚线）的曲线。 b 从理论值中减去检测到的粒子数绘制在垂直轴上以确定最佳粒子数。每个点都是一次试验的结果 (n =1)

为了验证分析条件，我们将 nAg 稀释为各种直径（nAg30、nAg70、nAg100），以在每个分析时间内检测 <500 个粒子并评估它们的直径。 sp-ICP-MS 分析表明，nAg30、nAg70 和 nAg100 的初级直径分别为 30.0 ± 1.2、65.1 ± 0.6 和 97.4 ± 0.6。此外，由动态光散射 (DLS) 确定的流体动力学直径分别为 36.4 ± 1.6、70.6 ± 1.7 和 101 ± 1.0，这些值与 sp-ICP-MS 估计的值相似。这些结果表明sp-ICP-MS条件适用于测量各种尺寸的纳米颗粒的直径。

优化检测小鼠肝脏组织中 nAg 的预处理方法

为了量化和确定ENPs在体内的物理特性，需要完全溶解组织。此外，重要的是有效地回收分布在体内的粒子和离子，而不会使粒子发生任何物理或化学变化。我们测试了 NaOH、TMAH、HNO3、HCl 或蛋白酶 K 五种增溶剂，并通过 sp-ICP-MS 分析了数量和物理特性，以优化以肝脏为模型的预处理策略 [14,15,16,17 ,18]。

将肝脏匀浆与 nAg100 混合以获得 100 ng/mL 的最终 Ag 浓度，然后在 37 °C 下用每种增溶剂处理。首先，我们评估了作为组织溶解度指标的组织残留量。超过 90% 的组织被 NaOH、TMAH 和蛋白酶 K 处理溶解，而只有 75% 的组织被 HNO3 和 HCl 处理溶解（图 2a）。考虑到近 80% 的组织由水组成 [19]，HNO3、HCl 和 PBS 处理无法有效溶解不溶性组织基质。相比之下，用 NaOH、TMAH 和蛋白酶 K 处理可有效溶解组织的不溶性基质，表明它们适用于准确定量组织中的 nAg。接下来，我们分析了每个粒子和离子的回收率，以评估每次处理后物理性质的变化。 Sp-ICP-MS 分析表明，nAg100 用酸性试剂（HNO3 和 HCl）处理后几乎完全电离，用蛋白酶 K 处理时部分电离。这表明酸性试剂和蛋白酶 K 溶解了颗粒并将它们转化为离子。相比之下，当组织用碱性试剂（NaOH 和 TMAH）处理时，100 ng/mL Ag（对应于最初添加的量）被检测为颗粒。碱性处理后几乎没有检测到离子（图 2b），表明 NaOH 和 TMAH 保持了 nAg 的物理特性。最后，我们评估了用不同试剂处理的组织中的粒径分布，以便详细分析物理性质。 TMAH 处理后，平均粒径从 100 nm 变为 120（图 2c）。此外，TMAH 处理后颗粒更宽（图 2d），表明颗粒聚集。相比之下，当组织用 NaOH 处理时，平均粒径接近 100 nm，对应于初始粒径。这表明NaOH预处理是检测小鼠肝组织中nAg100的最佳条件。

NaOH 预处理是检测小鼠肝脏中 nAg100 的最佳方法。筛选了五种溶解试剂作为预处理溶剂以溶解组织（NaOH、TMAH、HNO3、HCl 和蛋白酶 K）。将肝脏匀浆与 nAg100 溶液混合以获得 100 ng/mL 的最终 Ag 浓度，并在 37 °C 下用每种增溶剂处理。 3 h 后，a 每组残留率作为组织溶解度的指标，b 回收率（黑色和白色条形分别代表作为粒子和离子检测到的银的比率），c 条形图中显示的平均粒径，以及 d 蜂群图中显示的粒度分布通过 sp-ICP-MS 分析进行分析。结果表示为平均值 ± SD (n =3)

TMAH 预处理已广泛用于各种研究中的 sp-ICP-MS 分析。 TMAH 可能会根据各种物理特性（例如粘度和 pH 值）诱导 nAg100 的聚集。此外，介电常数可能与聚集有关。 TMAH 处理 3 h 可能会增加由 TMAH 分解为三甲胺 (TMA) 和甲醇引起的介电常数 [20]。介电常数的增加使与介电常数成反比的 nAg100 的 zeta 电位接近于零，从而导致 nAg 之间的静电排斥力损失和聚集诱导。用TMAH短时间（1 分钟）处理nAg100导致平均粒径约为100 nm（数据未显示）。

评估 NaOH 预处理在各种器官中的多功能性

为了评估 NaOH 预处理检测 nAg 的多功能性，我们用 NaOH 处理各种小鼠器官（心脏、肺、肾脏和脾脏）并进行 sp-ICP-MS 进行颗粒检测。首先，我们评估了作为组织溶解度指标的组织残留量。通过 NaOH 处理实现了超过 95% 的组织溶解（图 3a）。此外，对应于添加量的 Ag 被检测为颗粒（图 3b）。尽管有些回收率超过 100%，但美国食品和药物管理局的标准指出，80-120% 的回收率是足够可靠的 [21]。因此，我们的分析是可靠的。此外，在任何器官中检测到的 nAg 的平均粒径接近 100 nm，对应于添加的 nAg 的粒径（图 3c、d）。这些研究表明，NaOH 预处理不仅可以检测小鼠肝脏中的 nAg，还可以检测小鼠心脏、肺、肾脏和脾脏中的 nAg。

NaOH 预处理是检测各种器官中 nAg100 的最佳方法。如图 2 所示，将心脏、肾脏、肺和脾脏匀浆与 nAg100 混合并与 NaOH 溶液一起孵育。 3 h 后，a 残留率（黑色和白色条形分别代表 NaOH 或 PBS 处理中的残留率），b 回收率（黑色和白色条形分别代表检测为粒子和离子的 Ag 率），c 蜂群图中显示的平均粒径，以及 d 蜂群图中显示的粒度分布通过 sp-ICP-MS 分析在每个组织样本中进行分析。结果表示为平均值 ± SD (n =3)

综上所述，我们的结果表明，NaOH 预处理是 sp-ICP-MS 对动物组织中 nAg 进行定量和物理性质分析的最佳预处理策略。

sp-ICP-MS 对 nAg 和 Ag 的定量和物理特性分析的评估 ⁺ 在生物组织中

nAg 在体内电离或 Ag ⁺ 小鼠组织中的微粒，尽管这一过程的细节尚不清楚。因此，我们通过分析单次静脉注射 nAg100 或 Ag ⁺ 后小鼠血液和肝脏中 Ag 的数量和物理性质来评估 sp-ICP-MS 的实际应用。 . ICP-MS分析表明Ag ⁺ 的血液中均检出Ag - 和 nAg100 处理的小鼠（图 4a）。此外，在两组的肝脏中均检测到 Ag（图 4b）。接下来，我们分析了每个样品中 Ag 的物理特性。因为在 Ag ⁺ 的血液中都检测到少量的 nAg - 和 nAg100 处理的小鼠，大多数检测到的 Ag 是离子形式（图 4c）。在肝脏样本中，大约 80% 的 Ag 在 nAg100 处理的小鼠中被检测为颗粒，而在 Ag ⁺ 中检测到少量的 nAg -治疗的小鼠（图 4d）。最后，我们通过 sp-ICP-MS 评估了 nAg100 处理小鼠肝脏中的粒径，结果表明粒径约为 80 nm（图 4e）。这些数据表明 Ag ⁺ Ag ⁺ 的物理性质 在血液和肝脏中没有变化。相比之下，注入血液中的 nAg100 是部分电离的；肝脏中 20% 的银和血液中的大部分银呈离子形式。由于部分电离，肝组织中 nAg 的平均直径小于最初给药的颗粒的直径（80 对 100 nm）。因此，我们的生物样品适用的 sp-ICP-MS 策略表明，注入血液中的 nAg100 以颗粒（约 80%）的形式分布在肝脏中，并以离子（约 95%）的形式分布在血液中，而 ICP-MS 方法可以仅评估 Ag 含量，而不评估颗粒的物理或化学变化。

静脉注射 nAg100 和 Ag ⁺ 的同时定量和物理性质分析 . nAg100 和 Ag ⁺ 对小鼠进行静脉内给药（0.75 或 1.5 mg/kg）。 24 h后，收集他们的肝脏和血液。所有样品均用 NaOH 溶液预处理。 a 中的 Ag 浓度 血和b 通过ICP-MS测量肝脏。 c 中的 nAg 血和d 通过 sp-ICP-MS 测量肝脏。在肝脏中检测到的颗粒的平均直径显示在e .结果表示为平均值 ± SE (n =3)

结论

我们确定了生物组织中 nAg 的 sp-ICP-MS 分析的最佳预处理条件，从而能够同时对动物组织中的 ENP 进行定量和物理特性分析。我们还开发了适用于评估生物样品的 sp-ICP-MS 方法，并通过评估肝脏和血液中 nAg100 物理特性的变化证明了其适用性。我们还表明，给予小鼠的 nAg100 从颗粒形式到离子形式的部分变化影响了它们的动力学和分布。该技术可以通过评估ENP暴露条件、阐明对ENP的生物学反应以及识别反应的潜在机制，应用于ENP的风险分析。

数据和材料的可用性

数据共享不适用于本文，因为当前研究期间没有生成或分析数据集。

缩写

Ag：

银色

Ag ⁺ ：

银离子

DLS：

动态光散射

ENP：

工程纳米粒子

HCl：

盐酸

HNO3 :

硝酸

ICP-MS：

电感耦合等离子体质谱法

nAg：

银纳米粒子

nAg100：

100 nm nAg

nAg30：

30 nm nAg

nAg70：

70 nm nAg

NaOH：

氢氧化钠

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

sp-ICP-MS：

单粒子ICP-MS

TEM：

透射电子显微镜

TMAH：

四甲基氢氧化铵