普鲁兰多糖纳米颗粒介导的洛伐他汀和多柔比星共递送对三阴性乳腺癌细胞的协同增强抑制作用

摘要

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型，容易产生耐药性且难以治疗。在这项研究中，我们将水溶性普鲁兰多糖与洛伐他汀 (LV) 接枝，以开发一种新型的两亲性偶联物、普鲁兰多糖包裹的 LV (PLV)。 PLV 偶联物是用三种不同的支链淀粉与 LV 的比率合成的，并通过傅里叶变换红外 (FTIR) 进行表征。 LV 的摩尔比取代度 (DS) 分别为 PLV (1/2)、PLV (1/3) 和 PLV (1/4) 的 7.87%、3.58% 和 3.06%，通过质子核磁共振分析。我们选择 PLV (1/2) 偶联物来制备负载多柔比星 (DXR) 的 PLV 纳米颗粒 (PLV/DXR NPs)，因为它具有优异的性能。通过动态光散射测定的 PLV (1/2) NPs 的平均尺寸和 zeta 电位分别为 177.6 nm 和 - 11.66 mV，PLV/DXR NPs 的平均值分别为 225.6 nm 和 - 10.51 mV。体外药物释放分析表明，PLV/DXR NPs 在 72 h 内持续释放 DXR，在 pH 5.4 (97.90%) 下比 pH 7.4 (76.15%) 更稳定。在细胞毒性研究中，PLV/DXR NPs 显示出比非 TNBC MDA-MB-453 细胞更强的 TNBC MDA-MB-231 增殖抑制作用（IC50 0.60 vs 11.05 μM）。准备装载 FITC 的 PLV/DXR NPs 以研究细胞摄取：两种细胞系都显示出时间依赖性的 NPs 摄取，但进入 MDA-MB-231 细胞的 NPs 数量大于进入 MDA-MB-453 细胞的 NPs 数量.基于普鲁兰多糖的 NP 联合递送 LV 和 DXR 可以有效抑制 TNBC 细胞，这可能有助于设计治疗 TNBC 的强大药物递送系统。

介绍

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种特殊的乳腺癌亚型，缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2），预后比其他乳腺癌亚型更差。 1,2,3]。可用的靶向治疗主要取决于靶向肿瘤细胞表面的特定受体。由于 TNBC 缺乏用于治疗的主动靶向的特定表面标记，因此其他靶向方法值得探索。例如，被动靶向，它涉及对实体瘤的独特增强渗透性和保留 (EPR) 效应 [4]，允许特定尺寸范围的颗粒靶向肿瘤部位 [5, 6]。纳米颗粒(NP)是一种可以利用EPR效应富集实体瘤部位的药物载体[4]。

最近，我们发现洛伐他汀 (LV) 是一种用于治疗高脂血症的亲脂性他汀类药物 [7]，可通过靶向癌症干细胞选择性抑制 TNBC [8, 9]。此外，我们证明了 NP 封装可以增强 LV 在乳腺癌细胞植入小鼠模型中对 TNBC 的抑制作用 [8]。我们的研究以及之前的研究结果 [10, 11] 表明，亲脂性他汀类药物，尤其是 LV，可以重新用作 TNBC 治疗的抗癌药物。然而，LV能否克服化疗耐药或增强化疗药物对TNBC的治疗作用尚不清楚。

LV 与不同类型的化疗药物如阿霉素 (DXR)、5-氟尿嘧啶 [12]、顺铂 [13] 和 1-β-D-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶 [14] 之间的协同作用已在不同的癌细胞类型中得到报道。 DXR 是一种蒽环类化合物，具有与 DNA 结合和抑制核酸合成的复杂特征。此外，LV 与 DXR 协同诱导卵巢癌细胞凋亡 [15]。此外，LV 是外排蛋白 P-糖蛋白 [16] 的直接抑制剂，这是一种 ATP 驱动的泵，可以很容易地将 DXR 排放到细胞外室 [17, 18]。因此，LV可能会增加其他治疗药物的治疗效果，LV与这些药物的联合可能会增强对TNBC的治疗效果。

目前的联合疗法充满挑战。一方面，联合化疗可能受到化疗药物代谢快、水溶性差和生物利用度低的严重限制[19, 20]。另一方面，由于不同药物的药代动力学、膜转运特性和非特异性生物分布各不相同，因此很难在单个细胞中达到足够的给药浓度和特定比例 [21,22,23]。这些因素影响治疗功效和组合的协同或拮抗水平。将两种治疗药物共包封到纳米级药物载体中是克服这些挑战的有效方法，因为它可以让载体中的药物保持正确的协同作用比例[24, 25]。

共包封的纳米载体主要包括脂质体、聚合物胶束和微球或纳米球[26,27,28,29]。聚合物胶束由于其优异的性能（例如，具有化学共轭和物理包封的双重载药量、高载药量和高生物相容性）而备受关注[26, 30]。在我们之前的研究中，我们用普鲁兰多糖（一种具有高生物相容性的亲水性多糖）制备了一系列 NP，并研究了各种因素对其药物释放行为的影响 [31]。在目前的研究中，我们制备了一种新型 PLV 聚合物胶束，具有不同的支链淀粉和 LV 进料比，并表征了尺寸和 zeta 电位和形态的分布。我们选择了最小的结果 NP 来加载 DXR，因为在使用 EPR 效应的前提下，它更有可能被细胞内化。此外，我们测量了 PLV/DXR NPs 在不同 pH 值介质中的载药量、包封率和药物释放量。我们评估了装载 FITC 的 PLV/DXR NPs 的细胞摄取，以检查 NPs 进入肿瘤细胞和 DXR 和 LV 组合的协同作用以及 NPs 对 MDA-MB-231 (TNBC) 和 MDA-MB 的细胞毒性-453（非 TNBC）细胞（方案 1）。

材料和方法

材料

普鲁兰多糖 (200 kDa) 来自 Hayashibara（东京）。 LV 和 DXR 盐酸盐来自 J&K Scientific（北京）。 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）购自阿拉丁试剂（上海）。其他试剂如溶剂均来自国药集团化学试剂有限公司（北京）。乳腺癌细胞系MDA-MB-231（TNBC）和MDA-MB-453（非TNBC）购自上海生命科学研究院细胞资源中心。 CellTiterBlue 试剂来自 Promega (Madison, WI, USA)。 Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Cat#SH30022.01）来自HyClone（美国），胎牛血清（FBS）（Cat#04-001-1ACS）来自Biological Industries（以色列）。

LV 接枝普鲁兰多糖 (PLV) 的合成

首先，LV琥珀酸单酯（LV-SA）通过以下步骤合成。简而言之，将0.60 g琥珀酸酐（SA，6.0 mmol）和2.0 g LV（5.0 mmol）溶解在20 mL无水吡啶中，并在50 °C下搅拌48 小时。将所得反应液缓慢倒入1500mL pH 3的冰HCl溶液中，不断搅拌，析出大量白色沉淀，用浓HCl将悬浮液的pH调至pH 3，真空过滤.然后用pH-3的冰HCl溶液洗涤沉淀，然后用ddH 2 O洗涤至中性，得到粗产物。最后，粗品用丙酮-水溶剂体系重结晶，得到纯LV-SA，收率为72%。 PLV 是通过将 LV-SA 的羧酸基团与支链淀粉的羟基以 1/2、1/3 和 1/4 的 LV-SA 与支链淀粉的摩尔比缀合而产生的。简而言之，将0.5 g（1.03 mmol）制备的LV-SA、0.15 g DMAP（1.23 mmol）和0.24 g EDCI（1.23 mmol）溶解在20 mL二甲亚砜（DMSO）中，并在50℃ 4℃下搅拌。普鲁兰多糖（0.33 g，1/2；0.50 g，1/3；0.67 g，1/4）溶解在DMSO中，得到2%（w/v）的溶液。然后将支链淀粉溶液缓慢加入反应液中，在50 ℃反应48 h。将反应混合物放入透析袋（MWCO =8~12 kDa）中并用25%乙醇/水和水透析。然后将样品冷冻干燥[32]。使用 FTIR 分光光度计（KBr 颗粒，Nicolet，TM Nexus 470-ESP，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）通过 FTIR 分析表征具有不同 LV 与支链淀粉进料比的 PLV 缀合物。 ¹ 也证实了 PLV 偶联物 H NMR 光谱（DMSO-d6 溶剂，BRUKER AVANCE-500，Bruker，Billerica，MA，USA），并计算每种偶联物的 LV 取代度 (DS)。

纳米颗粒的制备和表征

将 50 mg 量的 PLV 缀合物溶解在 12.5 mL DMSO 中，在 37 °C 下轻轻摇动（使缀合物完全溶胀）以获得 4 mg/mL 缀合物溶液。取5mL偶联物溶液用DMSO稀释至2 mg/mL，用透析袋（8~14 kDa）用1000 mL蒸馏水透析8 h，交换10次。然后，使用探针型超声仪（GA92-IIDA 超声波细胞粉碎机，苏州江东精密仪器）在冰水浴中以 100 W 脉冲（脉冲开启 2.0 s，关闭 2.0 s）对溶液进行超声处理 2 min .获得自组装 PLV NPs 并将样品储存在 4 °C。为了制备 PLV/DXR NPs，将 2 mg DXR 溶解在 5 mL DMSO 中，然后滴加到 5 mL 共轭溶液中，然后通过相同的方法制备 PLV/DXR NPs。在制备负载 FITC 的 PLV/DXR NPs 的典型程序中，将 1 mg DXR 溶解在 2 mL DMSO 中，然后滴加到 2.5 mL 偶联物溶液中。然后滴加1 mL FITC溶液(0.6 mg/mL)的DMSO溶液，同法制备FITC负载的PLV/DXR NPs。

PLV NPs、PLV/DXR NPs 和加载 FITC 的 PLV/DXR NPs 通过 0.45-μm 膜过滤，然后通过动态光散射（DLS、Zetasizer 3000 HS、马尔文仪器，马尔文，英国）。采用透射电子显微镜（TEM；Tecnai G2 20 S-Twin，FEI Hong Kong）在80 kV加速电压下观察PLV NPs的形态特征。

装载能力和诱捕效率的确定

将 PLV/DXR NP 溶液 (5 mL) 超声处理 5 分钟（脉冲开启 2.0 s，关闭 2.0 s）以从 NP 中释放药物。使用紫外可见分光光度计（Shimadzu UV-2550，Kyoto，Japan）在480 nm处测量溶液中的DXR吸光度以计算药物浓度。 DXR包封率（EE）和负载量（LC）计算如下：

$$ \mathrm{EE}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{total}\ \mathrm{ added}\ \mathrm{drug}}\times 100\% $$ $$ \mathrm{LC}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{NP}\ \mathrm{weight}}\times 100\% $$

体外药物释放

DXR 从 PLV/DXR NPs 的释放曲线是在 0.1 M 磷酸盐缓冲溶液中在 37 °C 下通过透析方法测量的 [33]。通常，将 6 mL PLV/DXR NP（等于 139.4 mg DXR）转移到透析袋中（MWCO =3500 Da），然后在 37 °C 下在 15 mL PBS（pH 7.4 和 5.4）中孵育。在预定时间，取出 3 mL 外部缓冲溶液并替换为 3 mL 新鲜 PBS（pH 7.4 或 5.4）。通过荧光分光光度法测量释放的 DXR 的量。药物释放百分比（Q %) 计算如下：

$$ Q\%=\left({C}_n\times V+{V}_n\sum \limits_{t=0}^n{C}_i\right)/\left({W}_{\mathrm{ NP}}\times \mathrm{LC}\%\right) $$

其中 W 是 NP 权重，C n 是 Tn 处的样品浓度 , V 是释放介质的总体积，V n 是样品体积 (2 mL)，C 我是 T 处的样品浓度我 (i =0, 0.5, 1,...n 小时，都 V 0 和 C 0 都等于零）。

细胞培养

人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 和 MDA-MB-453 在含有 10% FBS 的 DMEM 完全培养基中在 37°C、5% CO2 和常氧 (21% O2) 的潮湿条件下培养。实验细胞均来源于对数生长期细胞。

体外细胞毒性

MDA-MB-231 和 MDA-MB-453 细胞接种于 96 孔板 (4×10³ 细胞/孔，体积为 100 μL）在常规培养条件下培养 24 h。然后加入不同药物浓度的PLV/DXR NPs（DXR和LV的质量比为8.13）并孵育48 小时。最后，加入用于测量细胞增殖的 20 μL CellTiter Blue 试剂 (Promega)，并在 37 °C 下孵育 1-4 小时。使用自动酶标仪测量 530/590 nm 处的吸光度。细胞活力表示为吸光度占未处理对照组的百分比。

体外协同效应分析

Isobole 分析用于定量评估配对药物产生的协同作用和拮抗作用。根据 Tallarida 的剂量等效原理和 Loewe 加性模型，生成了一条 isobole，这是一条定义配对药物相加效应的线 [34, 35]。在实践中，如我们之前所述[8]，我们首先获得游离DXR和游离LV的剂量效应曲线，在对药物剂量和效应进行变换后，使用线性回归得到线性回归方程来计算配对的组合剂量。具有特定作用的药物。绘制等轴线的数据如表 1 所示。等轴线上的点将 DXR/LV 设置为不同的比率，以产生 50% 的最大效果。配对药物剂量的IC50低于isobole表明有协同作用，而高于isobole的IC50表明拮抗作用。

<图>

体外细胞摄取

PLV/DXR FITC NPs 通过透析获得。通过使用荧光酶标仪测试 PLV/DXR FITC NPs 的细胞摄取。接种MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞（2 × 10⁵ / 孔）在 2.5 厘米的培养皿上，并在 37 °C 下孵育 24 小时。然后将细胞与浓度的 PLV-DXR FITC NP 在 37 °C 下孵育 1、2 和 4 小时。然后除去培养基并用冷PBS洗涤两次。细胞用 4% 多聚甲醛固定 5 分钟，然后使用含有 DAPI 的封固剂封固在载玻片上。然后，通过荧光显微镜观察纳米颗粒的细胞摄取。

统计分析

数据表示为平均值 ± SD，并通过学生的t进行分析测试。 P 处的差异被认为具有统计学意义 <0.05.

结果

DXR 和 LV 的体外细胞毒性和协同作用

为了评估 LV 和 DXR 对 TNBC 和非 TNBC 细胞增殖的抑制作用，通过 Alamar blue 测定评估细胞活力。我们首先通过免费药物测试确定了 LV 和 DXR 对两种 TNBC 细胞系的抑制作用。通过设置一种药物的浓度常数并改变另一种药物的浓度，可以获得一系列 LV/DXR 浓度比。对于 MDA-MB-231 细胞系，LV 和 DXR 均具有浓度依赖性抑制作用，但 LV 在高达 3.0 μM 的浓度下具有显着的抑制作用（图 1）。

讨论

在这项研究中，为体外药物释放分析制备的 PLV/DXR NPs 在 72 h 内持续释放 DXR，在 pH 5.4 (97.9%) 时稳定。 PLV/DXR NPs 比非 TNBC MDA-MB-453 细胞更强烈地抑制 TNBC MDA-MB-231 的增殖。两种细胞系都显示出时间依赖性的 NPs 吸收，但 MDA-MB-231 细胞比 MDA-MB-453 细胞吸收更多的 NPs。因此，基于支链淀粉的 NP 共递送 LV 和 DXR 可以有效抑制 TNBC 乳腺癌细胞增殖，这可能表明治疗 TNBC 的强大药物递送系统。

近来，LVs在TNBC防治中的应用得到了认可，研究进一步表明LV优先抑制TNBC细胞增殖并诱导细胞凋亡[10, 41]。但在临床上，LVs多为口服制剂，而其他化疗用抗肿瘤药物包括DXR多为注射剂形式。这种情况导致联合 LV 和其他药物的化疗效果不佳，难以以预期的剂量和时间到达肿瘤组织。由于 LV 不溶于水，因此难以将 LV 制成注射剂。因此，纳米递送系统对于LV用于抗肿瘤功效以及允许多种药物的共包封以更容易地联合化疗是必要的。

本课题组近期制备了一种基于陶瓷体的纳米复合材料包裹LV，在一定程度上解决了LV的水溶性问题，但载药效率普遍不高（5~6%）[8]。张等人。开发了喜树碱-氟尿苷偶联物纳米胶囊来加载 LV。这些纳米胶囊由两种美国食品和药物管理局批准的化疗药物组成，实现了喜树碱-氟尿苷的超高载药量（68.3%），但对 LV 的载药效率仍然很低（2.8%）[29]。在本研究中，我们使用 LV 对支链淀粉进行疏水修饰以获得两亲性 PLV 缀合物，然后制备 PLV/DXR NPs，不仅解决了 LV 的水溶性问题，而且产生了高载药量（15.69% LV 和 DXR 1.93%）。

将两种或多种抗肿瘤药物封装到纳米载体中的策略已被广泛接受，以实现有效的药物递送 [42]。隋等人。使用负载索拉非尼的 DXR 接枝普鲁兰多糖 NPs 来实现对鼠乳腺癌的协同化疗 [30]。我们的研究对 PLV/DXR NPs 使用了类似的方法，与单独的 DXR 相比，对 MDA-MB-231 细胞显示出更高的抑制效果。然而，PLV/DXR NPs并未表现出协同效应，这可能与NP内吞和LV释放的滞后有关，值得进一步研究。

联合指数已被广泛用于量化两种药物的协同作用 [43,44,45]。用于协同效应定量评估的等效线图分析方法可以有效避免假阳性结果[35]。本研究基于等值线图分析，从一系列DXR/LV比值中筛选出最佳协同比值。

我们的研究为设计更有效的共同递送系统以引发对 TNBC 的协同增强抑制作用提供了基本原理。由于我们的工作是初步的，并且基于 EPR 效应可行的前提，因此有必要使用原位乳腺肿瘤生长模型和患者来源的异种移植模型进一步研究这种新型共递送系统对 TNBC 的体内有效性。

结论

在这项研究中，我们通过将 LV 化学接枝到支链淀粉和物理包封 DXR 开发了新型双载药 NPs，其具有优异的单分散性、高载药量和良好的药物释放行为。 PLV/DXR NPs 显示出 DXR 可持续的 pH 敏感释放行为。 PLV/DXR NPs 比非 TNBC MDA-MB-453 细胞更有效地内化和抑制 TNBC MDA-MB-231 的增殖。此外，我们证明了游离 DXR/LV 混合物的协同作用，为未来潜在的 TNBC 临床治疗提供了联合化疗方案。