pH响应全氟戊烷蛋白质纳米粒子实现卵巢肿瘤靶向超声成像与治疗

摘要

本研究开发了一种多功能超声（US）治疗剂，将全氟戊烷（PFP）封装入铁蛋白（FRT）并偶联肿瘤靶向分子叶酸（FA），构建FA-FRT-PFP。制备的FA-FRT-PFP平均粒径42.8±2.5 nm，zeta电位−41.1±1.7 mV，在生理溶液和温度下表现良好稳定性。FRT是pH敏感笼状蛋白，pH 5.0时解离形成孔道可负载PFP，调节至中性pH关闭孔道将PFP封装形成纳米粒子。pH 5.0条件下，3 min低强度聚焦超声（LIFU, 2 W/cm²)显著增强FA-FRT-PFP超声信号，通过声滴汽化（ADV）效应。相同条件下4 min LIFU照射导致FA-FRT-PFP生成气泡破裂。FA-FRT-PFP可高效靶向进入卵巢癌细胞，3 min LIFU照射后显著增强超声对比度。4 min LIFU照射后细胞活力因坏死显著下降，可能因FA-FRT-PFP进入肿瘤细胞后在溶酶体酸性环境中释放PFP，经LIFU照射相变为气泡并破裂产生物理冲击波破坏细胞结构致坏死，实现肿瘤治疗。综上，FA-FRT-PFP是新型且极具前景的超声诊疗一体化剂，可望用于未来临床应用。

引言

卵巢癌是全球最致命女性癌症之一[1-3]。卵巢癌治疗临床仍依赖放疗、化疗、手术及其他辅助疗法[4-6]。但这些策略的短板持续阻碍患者生存率提升。为克服缺陷，需要更有效、更安全的诊断方法。近年将成像与治疗整合为单一治疗平台成为热门课题[7-9]。

超声（US）技术因其无创、无辐射、低成本、特异性等特点，广泛用于临床诊断和肿瘤治疗[10-12]。近十年开发了具有超声成像和治疗能力的声学响应平台（ARP）用于有效肿瘤诊断治疗[13-16]。ARP主要包括微气泡/纳米气泡（MB/NB）和纳米粒子（NP）平台[16,17]。MB/NB虽有良好声学响应能力，但因尺寸大、体内组织穿透弱、样品稳定性差。NP因尺寸小具有更强组织渗透性和更长药代动力学循环，但声学响应能力有限。因此迫切设计小尺寸、高稳定性、强响应的ARP。

液态氟碳在外部刺激下发生液-气相变[18,19]。Natalya等开发含液态氟碳纳米乳液，在低强度聚焦超声（LIFU）下产生声滴汽化（ADV）效应[20-22]。乳液形成气泡并同步触发药物释放，实现肿瘤治疗。但包裹液态氟碳的密封层增加肿瘤治疗所需超声强度和时间，损伤周围健康组织。因此需进一步优化液态氟碳载体。

本研究开发铁蛋白（FRT）纳米粒子负载液态氟碳全氟戊烷（PFP），进一步结合肿瘤靶向分子叶酸（FA）形成FA-FRT-PFP。铁蛋白是高生物相容性内源性纳米笼蛋白，表现pH敏感性[23-25]。蛋白酸性环境下解离、碱性环境下重组，允许随pH变化控制铁蛋白负载和释放[26-28]。PFP是常用相变材料，沸点29℃。低沸点使LIFU易诱导相变，比HIFU更安全。PFP负载入铁蛋白，所得FA-FRT-PFP直径~47.3±2.8 nm，在生理溶液和温度下高稳定。结果显示FA-FRT-PFP优势：(1) 通过pH从酸性调至中性可轻松将PFP负载入FRT；(2) pH=5.0下LIFU（2 W/cm², 3 min）使FA-FRT-PFP释放PFP相变增强超声成像信号（ADV）；(3) 长时间LIFU照射（4 min）和pH=5.0下，FA-FRT-PFP释放PFP爆炸产生物理冲击波通过坏死有效破坏肿瘤细胞。据我们所知，这是首例PFP负载FRT作为肿瘤超声诊疗剂。结果表明FA-FRT-PFP+LIFU是肿瘤诊疗一体化新策略。

材料与方法

材料

琼脂糖凝胶、铁蛋白（FRT）、叶酸（FA）、全氟戊烷（C₃F₈, PFP）购自Sigma（美国圣路易斯）。NH₂-PEG₂₀₀₀-FA和NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH由西安瑞熙生物技术有限公司（中国）提供。1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自Dojindo Laboratories（日本熊本）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、磷酸缓冲盐水（PBS）、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清（FBS）购自Gibco（美国大岛）。

细胞培养

人卵巢癌细胞系SK-OV-3由上海细胞生物学研究所中国科学院提供。正常卵巢上皮细胞HUM-CELL-0088来自武汉PriCells。细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。5% CO₂、37℃湿润培养箱中维持。

FA-FRT-PFP制备

首先通过酯化反应将靶向分子FA与FRT偶联[29]。简述：NH₂-PEG₂₀₀₀-FA（10 mg）与FRT溶液混合，存在EDC（5 mg/mL）和NHS（20 mg/mL）。室温轻微搅拌反应3 h，透析（MW切割=1.2 kDa）对抗蒸馏水纯化24 h。得FA-FRT纳米粒子。其次通过蛋白变性复性过程制备PFP负载入FRT腔腔[30]。简述：FA-FRT稀释至5 mL PBS为2 mg/mL，用30 min轻微搅拌调节pH=5.0确保FRT完全解离。冰浴中加入500 μL PFP，80 W脉冲超声（5 s开/5 s停共5 min）。超声后调节混合物pH至中性（pH=7.4）。因PFP为油状不溶水，液液分离轻松去除多余PFP得FA-FRT-PFP。FRT-PFP制备方法类似，仅将NH₂-PEG₂₀₀₀-FA替换为NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH。

FA-FRT-PFP表征

纳米粒子粒径和zeta电位用Zeta Sizer（Malvern, NanoZS, UK）测试。透射电镜（TEM, Hitachi, Japan）和倒置荧光显微镜（Olympus, Japan）观察形貌。傅里叶变换红外光谱（Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Germany）检测化学结构。共聚焦激光扫描显微镜（LEXT OLS4100, Olympus, Japan）检测细胞摄取。流式细胞仪（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）分析FITC/PI双染色细胞。

pH与超声响应产气性能

pH=5.0和7.5条件下FA-FRT-PFP用不同声强LIFU（1.5和2.0 W/cm²)和不同时间（1,2,3,4 min）在琼脂糖凝胶模型中照射，用超声设备（Esaote Mylab 90, Italy）5-12 MHz、机械指数（MI）0.06观察超声图像。随后光学显微镜随时间观察FA-FRT-PFP外观。用ImageJ软件分析超声图像感兴趣区域US强度。

细胞摄取

简述：1 mg FITC溶于1 mL DMSO混合FRT-PFP和FA-FRT-PFP轻微振荡30 min。透析除去游离FITC和DMSO得FITC标记纳米粒子。SK-OV-3和正常卵巢细胞（HUM-CELL-0088）培养24 h，游离FITC、FITC标记FRT-PFP和FA-FRT-PFP与SK-OV-3共孵育5 h。此外，FITC标记FA-FRT-PFP与FA预处理SK-OV-3共孵育5 h。PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，0.2 mg/mL DAPI染色10 min。共聚焦激光扫描显微镜捕获荧光图像。流式细胞仪定量荧光信号。

体外超声成像

SK-OV-3在无FA培养基培养24 h，PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA与SK-OV-3共孵育6 h。收集细胞混合琼脂糖凝胶，照射或不照射LIFU 3 min（1 s开1 s停共3 min；1 MHz；2.0 W/cm²）。最后捕获超声图像。

体外抗癌功效

SK-OV-3以1×10⁴ cells/well密度接种96孔板，贴壁24 h。测FA-FRT细胞毒性时，不同浓度（0,20,40,100,200,500 μg/mL）FA-FRT与SK-OV-3共培养。24 h处理后用含10% CCK-8的DMEM培养基孵育20 min。多模式酶标仪（Thermo Scientific）检测450 nm吸光度表征细胞活力。此外，SK-OV-3和正常卵巢细胞（HUM-CELL-0088）用PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA处理3 h，再LIFU照射（1 s开1 s停共4 min；1 MHz；2.0 W/cm²）。处理细胞再孵育21 h。对照组无LIFU，用PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA处理24 h。CCK-8检测处理细胞活力。

细胞死亡分析

评估细胞死亡类型，SK-OV-3以5×10⁴ cells/mL密度接种6孔板。24 h后用PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA处理3 h，再LIFU照射（1 s开1 s停共4 min；1 MHz；2.0 W/cm²）。处理细胞再孵育23 h。对照组无LIFU，用PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA处理24 h。胰蛋白酶消化，1500×g离心3 min，冰冷PBS洗3次，重悬于200 mL结合缓冲液。加入5 μL annexin V-FITC和10 μL PI暗孵育15 min。流式细胞仪分析染色细胞。

Western Blot

按文献进行Western blot。细胞用40 μg/mL PBS（对照）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA、FA-FRT-PFP联合或不联合LIFU照射（2.0 W/cm², 4 min）再孵育21 h处理。RIPA缓冲液（Sigma）裂解细胞。各蛋白50 μg加Laemmli样品缓冲液煮沸5 min进行SDS-PAGE。蛋白半干转印至PVDF膜（Bio-Rad Laboratories）。膜先用含2%脱脂奶或2% BSA（磷酸化特异性抗体）TBS封闭缓冲液室温孵育1 h，再用相应一抗在TBST（含0.1% Tween20和2% BSA）中稀释4℃过夜孵育。洗膜后用适当二抗（Santa Cruz）在TBST中孵育，超级信号Western Pico化学发光底物（Thermo）检测。

统计分析

所有数据呈均值±标准差。Student's t-test统计分析。*P<0.05，**P<0.01为统计学显著。

结果与讨论

FA-FRT-PFP制备与表征

FA-FRT-PFP合成用于肿瘤治疗（图1）。相变液滴通过FRT pH诱导可逆解离重组负载入FRT。PFP经LIFU诱导ADV递送入细胞作为超声成像剂。图2a-c显示FRT、FRT-PFP、FA-FRT-PFP TEM图像，均为球形。FRT、FRT-PFP、FA-FRT-PFP平均粒径分别为6.9±0.3 nm、43.8±1.6 nm、47.3±2.8 nm（图2d），表明PFP负载和FA偶联增大FRT尺寸。FRT和FA-FRT-PFP平均zeta电位分别为−43.2±3.1 mV、−46.9±2.2 mV、−41.5±2.7 mV（图2e）。此外，FA与FRT偶联经FT-IR表征（附件1：图S1）。FT-IR谱显示~1110 cm⁻¹吸收带可能对应PEG醚键C-O-C振动；~1601 cm⁻¹和~1710 cm⁻¹吸收峰属PEG及FRT羰基振动、FA和FRT的-COOH和-CONH₂；~2820、~2920、~2950 cm⁻¹带对应FA和PEG -CH₂不对称对称C-H伸缩振动；~1440 cm⁻¹吸收峰关联FA苯环。结果确认FA与FRT成功偶联。28天储存期内，FA-FRT-PFP在水、PBS、生理盐水、FBS中粒径和PDI无显著变化（图3a,b），表明FA-FRT-PFP优异稳定性。图3c显示FA-FRT-PFP在25-45℃不同温度下粒径变化。25-40℃粒径几乎不变，表明FA-FRT-PFP在40℃以下高稳定。45℃时粒径从42.1 nm降至6 nm，可能因FA-FRT-PFP中PFP剧烈气化导致纳米粒子破裂。FA-FRT-PFP气化温度从PFP常压下29℃升至45℃，可能因FRT壳层覆盖[21,31-33]。

pH与LIFU响应超声增强

不同pH和LIFU功率强度下FA-FRT-PFP超声幻影实验。图4a显示无LIFU照射（预照射）时所有组超声信号弱。pH 7.5下3 min LIFU照射后，FA-FRT-PFP在1.5和2.0 W/cm²均显示低超声信号；而pH=5.0同等照射时间下FA-FRT-PFP超声信号强度更强。表明FA-FRT-PFP呈时间和声强依赖性ADV效应。因pH=5.0时FA-FRT-PFP解离释放PFP更易相变。有趣的是，LIFU照射时间延至4 min时，pH=5.0、2.0 W/cm² LIFU下FA-FRT-PFP超声信号强度比低照射时间弱，可能因该条件LIFU过强诱导气泡破裂。结果证明FA-FRT-PFP可在pH=5.0、2.0 W/cm² LIFU照射下释放PFP产生相变和爆炸。图4b,c为超声强度统计数据。图4d-g为3 min LIFU照射（2.0 W/cm²)和pH=7.5、5.0下FA-FRT-PFP溶液形貌。pH=5.0、2.0 W/cm² LIFU下FA-FRT-PFP生成大气泡，进一步验证发现。

细胞摄取

图5显示FA-FRT-PFP细胞摄取能力。游离FITC处理细胞荧光可忽略，但标记于FA-FRT-PFP后出现强荧光信号，表明FA-FRT-PFP强细胞摄取能力。FRT-PFP处理和FA预孵育FA-FRT-PFP处理细胞显示较弱FITC荧光。进一步证明FA增强纳米粒子主动靶向。此外，FA-FRT-PFP摄取行为与FCM相当（图5c,d）。FA-FRT-PFP摄取率46.5±2.8%，显著高于游离FITC（对照）、FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA。此外，附件1：图S2显示正常卵巢细胞纳米粒子摄取。FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA和FA-FRT-PFP组摄取无显著差异。可能因正常卵巢细胞（HUM-CELL-0088）FA受体表达低于SK-OV-3细胞。

体外超声成像

为证实FA-FRT-PFP通过ADV增强体外超声成像，纳米粒子与细胞孵育5 h，照射或不照射LIFU（2.0 W/cm²）。图6a显示无LIFU照射时所有测试组细胞无增强超声信号；LIFU照射后FA-FRT-PFP处理细胞超声强度显著高于对照FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA组。超声成像灰度值用ImageJ软件定量分析。结果与超声成像数据一致（图6b），显示FA-FRT-PFP处理细胞经2.0 W/cm² LIFU照射3 min后超声强度增强。FA-FRT-PFP进入细胞后在溶酶体酸性环境（pH≈5.0）解离释放PFP至细胞质[34,35]。LIFU照射下PFP易从液滴相变为气体，增强超声强度。

体外抗癌功效与细胞死亡分析

图7a显示FA-FRT-PFP高达0.5 mg/mL浓度细胞毒性。无LIFU照射下FA-FRT-PFP对SK-OV-3细胞无明显抑制活力。CCK-8分析FA-FRT-PFP联合LIFU抗癌功效。图7b显示无LIFU时FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA、FA-FRT-PFP与对照组无显著细胞毒性。联合4 min LIFU照射后FA-FRT-PFP显示显著细胞毒性，高于FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA，40 μg/mL时峰值抑制率近90%。可能因FA-FRT-PFP比FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA更易进入细胞质再进入溶酶体。溶酶体酸性环境中FA-FRT-PFP释放PFP至细胞质。4 min LIFU照射下释放PFP气化产生空化和破裂，生成一系列物理冲击力显著增强杀瘤效果[36-38]。此外，附件1：图S3显示正常卵巢细胞纳米粒子细胞毒性。联合LIFU时FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA、FA-FRT-PFP组细胞毒性无显著差异。结果可能因HUM-CELL-0088细胞FA受体表达低无FA靶向效应。

图8a,b显示无LIFU时所有组细胞死亡极少。4 min LIFU照射后FA-FRT-PFP处理细胞显示显著坏死（~91.6%），因LIFU诱导PFP空化或气泡爆破产生物理冲击波。此外，附件1：图S4显示细胞TNF蛋白表达水平。无LIFU时细胞几乎不表达TNF蛋白。LIFU下FA-FRT-PFP组TNF表达水平高于FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA组，表明TNF蛋白是FA-FRT-PFP+LIFU诱导死亡相关关键蛋白[39]。基于优异体外抗癌效果[40-42]，FA-FRT-PFP有望用于未来体内癌症治疗。

结论

总之，我们成功开发基于FRT、负载PFP相变纳米粒子并修饰FA靶向分子的FA-FRT-PFP。作为新型靶向超声诊疗剂，FA-FRT-PFP具有多重优势：(1) 纳米级粒径；(2) FRT作为载体可酸性条件下解离、中性条件下重组上传释放PFP液滴；(3) 酸性条件下3 min LIFU辅助下FA-FRT-PFP释放PFP经ADV相变显著增加超声对比度；(4) 酸性环境下4 min LIFU照射释放PFP易诱导细胞内“爆炸效应”，产生物理抗肿瘤特性。结果证明FA-FRT-PFP在LIFU辅助下为超声分子成像和肿瘤治疗提供新策略。