基于全氟戊烷蛋白纳米粒子的 pH 和声学响应平台，用于卵巢肿瘤靶向超声成像和治疗

介绍

卵巢癌是全球最致命的女性癌症之一 [1,2,3]。卵巢癌的治疗在临床上仍然依赖于放射疗法、化学疗法、手术和其他辅助疗法 [4,5,6]。然而，这些策略的缺点继续阻碍患者存活率的提高。为了克服这些缺点，需要更有效和更安全的诊断方法。近年来，将影像学和治疗学整合到一个单一的治疗平台已成为一个热门话题[7,8,9]。

超声（US）技术由于其无创、无辐射、低成本和特异性等特点，被广泛应用于临床诊断和肿瘤治疗[10,11,12]。近几十年来，已开发出具有美国成像和治疗能力的声学响应平台 (ARP)，用于有效的肿瘤诊断和治疗 [13,14,15,16]。 ARP 主要包括基于微泡或纳米泡（MB 或 NB）和纳米颗粒 (NP) 的平台 [16, 17]。在这些ARPs中，MB或NB表现出良好的声学响应能力，但由于其体积大，体内组织穿透力弱，样品稳定性差。由于其体积小，NP 显示出更强的组织渗透性和更长的药代动力学周期。然而，NPs 的声学响应能力是有限的。因此，迫切需要设计出体积小、稳定性高、响应能力强的ARP。

液态碳氟化合物在外部刺激下经历液相气相转变 [18, 19]。 Natalya 及其同事开发了一种含有液态碳氟化合物的纳米乳液，可在低强度聚焦超声 (LIFU) 下产生声学液滴汽化 (ADV) 效应 [20,21,22]。乳液形成气泡并同时引发药物释放，从而实现肿瘤治疗。然而，一层密封材料包裹在液态碳氟化合物上，导致肿瘤治疗所需的超声波强度和时间增加，导致周围健康组织受损。因此需要进一步优化液态氟碳载体。

在这项研究中，我们开发了一种铁蛋白 (FRT) 纳米颗粒，其负载有液体氟碳全氟戊烷 (PFP​​)，它进一步与肿瘤靶分子叶酸 (FA) 结合形成 FA-FRT-PFP。铁蛋白是一种高度生物相容性的内源性纳米笼蛋白，显示出 pH 敏感性 [23,24,25]。蛋白质在酸性环境中可以分解，在碱性环境中可以重新组装。这允许铁蛋白的受控加载和释放以响应 pH 值变化 [26,27,28]。 PFP 是一种常用的相变材料，沸点温度为 29 ^o C. 低沸点温度有利于 LIFU 容易发生相变，比 HIFU 更安全。将 PFP 加载到铁蛋白中，所得 FA-FRT-PFP 的直径为~ 47.3 ± 2.8 nm，在生理溶液和温度下具有高稳定性。结果表明，FA-FRT-PFP具有以下优点：（1）通过将pH值从酸性变为中性，PFP可以很容易地加载到FRT中； (2) 低强度聚焦超声下（LIFU，2 W/cm ² , 3 min) 和 pH =5.0，FA-FRT-PFP 释放 PFP 并经历相变以通过声学液滴汽化 (ADV) 增强 US 成像信号； 3）在长期LIFU照射（4分钟）和pH =5.0下，FA-FRT-PFP释放的PFP爆炸并产生物理冲击波，可以有效地通过坏死破坏肿瘤细胞。据我们所知，这是 PFP 加载到 FRT 作为肿瘤美国治疗诊断的第一个例子。这些结果表明FA-FRT-PFP+LIFU是一种新的肿瘤综合诊疗策略。

材料和方法

材料

琼脂糖凝胶、铁蛋白 (FRT)、叶酸 (FA) 和全氟戊烷 (C3F8, PFP) 购自 Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。 NH2-PEG2000-FA 和 NH2-PEG2000-COOH 由西安瑞熙生物技术有限公司（中国）提供。 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)。细胞计数试剂盒 8 (CCK-8) 购自 Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)。 Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素、胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清(FBS)购自Gibco (Grand Island, NY, USA)。

细胞培养

人卵巢癌细胞系SK-OV-3由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。正常卵巢上皮细胞 HUM-CELL-0088 获自中国武汉的 PriCells。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中培养。将细胞培养在37°C、含5% CO2的湿润气氛培养箱中。

FA-FRT-PFP 的准备

首先，目标分子FA通过酯化反应与FRT结合[29]。简而言之，NH2-PEG2000-FA (10 mg) 和 FRT 溶液在 EDC (5 mg/mL) 和 NHS (20 mg/mL) 的存在下混合。在室温下轻微搅拌反应 3 小时后，混合物通过蒸馏水透析（MW 截止值 =1.2 kDa）24 小时纯化。所得溶液是FA-FRT纳米颗粒。其次，通过蛋白质的变性和复性过程制备 PFP 装入 FRT 腔内[30]。简而言之，将 FA-FRT 稀释到 5 mL PBS 中至 2 mg/mL，并在室温下轻微搅拌 30 分钟将其调节至 pH =5.0，以确保 FRT 完全解离。之后，将 500 μl PFP 加入冰浴中的溶液中，并在冰浴中以 80 W 进行脉冲超声处理，持续 5 秒和 5 秒，共 5 分钟。超声处理后，将混合物的 pH 值调至中性（pH =7.4）。由于PFP呈油状，不溶于水，多余的PFP很容易通过分液去除，得到FA-FRT-PFP。除了将NH2-PEG2000-FA改为NH2-PEG2000-COOH外，FRT-PFP的制备方法类似。

FA-FRT-PFP 的特征

通过 Zeta Sizer（Malvern，NanoZS，UK）测试纳米颗粒的尺寸和 zeta 电位。通过透射电子显微镜（TEM，Hitachi，Japan）和倒置荧光显微镜（Olympus，Japan）观察 FA-FRT-PFP 的形态。通过傅里叶变换红外光谱（Bruker Tensor 27，Bruker Optik，Ettlingen，Germany）检测纳米颗粒的化学结构。通过共聚焦激光扫描显微镜（LEXT OLS4100，Olympus，Japan）检测FA-FRT-PFP的细胞摄取。 FITC/PI双染细胞通过流式细胞术（BD，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析。

pH 和超声波响应气体发生的性能

FA-FRT-PFP 在 pH =5.0 和 7.5 条件下用不同声强的 LIFU (1.5 和 2.0 W/cm ² ) 和琼脂糖凝胶模型中不同的总时间（1、2、3 和 4 分钟），然后通过美国设备（Esaote Mylab 90，意大利）以 5-12 MHz 的频率和机械指数观察美国图像（ MI) 为 0.06。之后，通过光学显微镜及时观察FA-FRT-PFP的外观。用ImageJ软件分析US图像中感兴趣区域的US强度。

细胞摄取

简而言之，将 1 mg FITC 溶解在 1 mL DMSO 中，然后在温和搅拌下与 FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP 混合 30 分钟。然后，将混合溶液在去离子水中透析过夜以去除游离的FITC和DMSO以获得FITC标记的纳米颗粒。接下来，将SK-OV-3和正常卵巢细胞（HUM-CELL-0088）细胞在培养基中培养24小时，然后将游离FITC、FITC标记的FRT-PFP和FA-FRT-PFP与SK-OV-3 细胞 5 小时。此外，FITC 标记的 FA-FRT-PFP 与 FA 预处理的 SK-OV-3 细胞一起孵育 5 小时。细胞用 PBS 洗涤 3 次，用 4% 多聚甲醛固定，用 0.2 mg/mL DAPI 溶液染色 10 分钟。通过共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像以捕获荧光图像。流式细胞仪检测荧光信号。

体外超声成像

SK-OV-3 细胞在无 FA 培养基中培养 24 h，然后将 PBS、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP，以及 FA-FRT-PFP + FA 与 SK-OV-3 细胞一起培养6 小时。收集细胞并与琼脂糖凝胶混合，然后将细胞在有或没有 LIFU 的情况下照射 3 分钟（1 秒开启和 1 秒停顿共 3 分钟；1 MHz；2.0 W/cm ² ）。终于拍到了美图。

体外抗癌功效

SK-OV-3细胞以1×10 ⁴ 的密度接种于96孔板中 细胞/孔，并允许贴壁 24 小时。对于 FA-FRT 的细胞毒性，将不同浓度（0、20、40、100、200 和 500 μg/mL）的 FA-FRT 与 SK-OV-3 细胞一起培养。处理 24 小时后，将细胞用含有 10% CCK-8 的 DMEM 培养基在培养箱中处理 20 分钟。通过多模式读板机（Thermo Scientific）检测细胞在 450 nm 波长处的吸光度以表征细胞活力。此外，SK-OV-3 细胞和正常卵巢细胞 (HUM-CELL-0088) 用 PBS、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP + FA 处理 3 小时，然后LIFU 照射（1 秒，暂停 1 秒，共 4 分钟；1 MHz；2.0 W/cm ² ）。将处理过的细胞再孵育 21 小时。作为对照，在没有 LIFU 的情况下，将细胞用 PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP + FA 处理 24 小时。之后，通过CCK-8法检测处理细胞的活力。

细胞死亡分析

为了评估细胞死亡的类型，将 SK-OV-3 细胞以 5 × 10 ⁴ 的密度接种在 6 孔板中 细胞/毫升。 24 h后，用PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP和FA-FRT-PFP + FA处理细胞3 h，然后用LIFU照射（1 s，暂停1 s，共4最小；1 MHz；2.0 W/cm ² ）。将处理过的细胞再培养 23 小时。作为对照，在没有 LIFU 的情况下，用 PBS、FRT-PFP、FA-FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP + FA 处理细胞 24 小时。细胞经胰蛋白酶消化，1500×g 离心 3 min，用冰冷的 PBS 洗涤 3 次，然后重悬于 200 mL 结合缓冲液中。此后，加入 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 10 μL PI，并与细胞在黑暗中孵育 15 分钟。使用流式细胞仪分析染色的细胞。

蛋白质印迹

根据先前的文献进行蛋白质印迹。用 40 μg/mL PBS（对照）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 联合或不联合 LIFU 照射（2.0 W/cm ^{2 , 4 分钟）并进一步孵育 21 小时。然后将处理过的细胞在 RIPA 缓冲液 (Sigma) 中裂解。将 50 微克的每种蛋白质与 Laemmli 样品缓冲液一起煮沸 5 分钟，然后进行 SDS-PAGE。使用半干的 Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) 将蛋白质转移到 PVDF 膜 (Bio-Rad Laboratories) 上。印迹首先在含有 2% 牛奶或 2% BSA（用于磷酸化特异性抗体）的 TBS 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时，然后在 TBST（含有 0.1% Tween20 和 2% BSA）中稀释各自的一抗4°C 过夜。随后，将印迹洗涤并在 TBST 中与适当的二抗（Santa Cruz）一起孵育，并使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物（Thermo）进行检测。}

统计分析

所有数据均表示为平均值±标准偏差。使用Student's t-检验进行统计分析。 *P <0.05, **P <0.01 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

FA-FRT-PFP 的制备和表征

FA-FRT-PFP 被合成并用于肿瘤治疗（图 1）。通过pH诱导的FRT可逆分解和重组，相变液滴被加载到FRT中。具有 LIFU 诱导的声学液滴汽化 (ADV) 的 PFP 被递送到细胞中并充当超声显像剂。图 2a-c 显示了 FRT、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP 的 TEM 图像，它们具有球形形态。 FRT、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP 的平均粒径分别为 6.9 ± 0.3 nm、43.8 ± 1.6 nm 和 47.3 ± 2.8 nm，（图 2d）表明 PFP 负载和 FA 共轭增强了FRT 的大小。 FRT和FA-FRT-PFP的平均zeta电位分别为- 43.2±3.1mV、- 46.9±2.2mV和- 41.5±2.7mV（图2e）。此外，FA 与 FRT 的结合由 FT-IR 表征，如附加文件 1 所示：图 S1。 FT-IR 光谱在 ~ 1110 cm ^-1 处显示吸收带 可能对应于 PEG 的振动 C-O-C 醚键； ~ 1601 cm ⁻¹ 处的吸收峰 和 ~ 1710 cm ⁻¹ 属于来自 PEG 和 FRT 以及来自 FA 和 FRT 的 –COOH 和 –CONH2 的振动 C=O 键； ~ 2820 cm ⁻¹ 处的谱带 , ~ 2920 cm ⁻¹ , 和 ~ 2950 cm ⁻¹ 对应于 FA 和 PEG 的 –CH2 的不对称和对称 C–H 伸缩振动； ~ 1440 cm ⁻¹ 处的吸收峰 与 FA 的苯环相连。结果证实了 FA 与 FRT 的成功结合。在 28 天的储存期内，FA-FRT-PFP 在水、PBS、盐水和 FBS 中的大小和 PDI 保持无显着变化（图 3a、b），表明 FA-FRT-PFP 显示出优异的稳定性。图 3c 显示了 FA-FRT-PFP 在 25 ^o 不同温度下的尺寸变化 C 到 45 ^o C. FA-FRT-PFP的尺寸在温度降低到25-40°C时几乎没有变化，说明FA-FRT-PFP在40 ^o 以下表现出较高的稳定性 C. 当温度达到 45 °C 时，FA-FRT-PFP 的尺寸范围从 42.1 nm 到 6 nm，这可能是由于 FA-FRT-PFP 中的 PFP 发生严重气化，导致纳米颗粒破裂。 FA-FRT-PFP的气化温度从29 ^o C（常压下PFP的气化温度）至45 ^o C，可能是由于覆盖了 FRT 外壳 [21, 31,32,33]。

FA-FRT-PFP的合成示意图及其在肿瘤诊疗中的应用

一 –c FRT、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP 的 TEM 图像。 d , e FRT、FRT-PFP和FA-FRT-PFP的尺寸和zeta电位分布

一 , b 28 天内 FA-FRT-PFP 在水、PBS、盐水和 FBS 中的大小和 PDI 变化。 c 25 ^o 不同温度下FA-FRT-PFP的尺寸变化 C 到 45 ^o

pH 和 LIFU 响应美国增强

FA-FRT-PFP 的美国体模实验在不同的 pH 值和 LIFU 功率强度下进行。如图 4a 所示，在没有 LIFU 照射（预）的情况下，所有组的 US 信号都很弱。在 LIFU 照射 3 分钟后，pH7.5，FA-FRT-PFP 在 1.5 和 2.0 W/cm ² ，而在相同 LIFU 照射时间下 pH =5.0 时，FA-FRT-PFP 具有更强的 US 信号强度。这表明 FA-FRT-PFP 表现出时间和声学强度依赖的 ADV 效应。这是因为，在 pH =5.0 时，FA-FRT-PFP 会分解并释放 PFP，使其更容易发生相变。有趣的是，当 LIFU 照射时间延长至 4 min 时，FA-FRT-PFP 在 pH =5.0 和 2.0 W/cm ² 与较低辐照时间相比，LIFU 的 US 信号强度较弱，这可能是由于这种条件下的 LIFU 太强导致气泡破裂。这些结果表明 FA-FRT-PFP 可以在 2.0 W/cm ² 下释放 PFP，产生相变和爆炸 LIFU 照射 pH =5.0。 US强度的结果如图4b、c所示。图 4d-g 显示了 LIFU 照射 3 分钟后 FA-FRT-PFP 溶液的形态（2.0 W/cm ² ) 和 pH =7.5 和 5.0。 FA-FRT-PFP 在 pH =5.0 和 2.0 W/cm ² LIFU 产生了大气泡，进一步验证了我们的发现。

一 FA-FRT-PFP 与琼脂糖凝胶混合在不同 pH 值下并在不同 LIFU 功率强度下的 US 图像。 b , c a中US信号对应的统计数据 . d –g FA-FRT-PFP与琼脂糖凝胶混合在不同pH值下2.0 W/cm ² 的光学显微镜图像 3分钟

细胞摄取

图 5 显示了 FA-FRT-PFP 的细胞摄取能力。游离 FITC 处理的细胞显示出可忽略不计的荧光，但在标记到 FA-FRT-PFP 后，明显的荧光信号很强，表明 FA-FRT-PFP 具有很强的细胞吸收能力。 FRT-PFP 处理和 FA-FRT-PFP 处理的细胞与 FA 预孵育显示较弱的 FITC 荧光。这进一步证明 FA 增强了纳米颗粒的主动靶向。此外，FA-FRT-PFP 显示出与 FCM 相当的吸收行为（图 5c、d）。 FA-FRT-PFP 的摄取率为 46.5 ± 2.8%，明显高于游离 FITC（对照）、FRT-PFP 和 FA-FRT-PFP + FA。此外，附加文件 1：图 S2 显示了正常卵巢细胞中纳米颗粒的细胞摄取。 FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 组在细胞摄取方面没有显着差异。这可能是由于正常卵巢细胞 (HUM-CELL-0088) 与 SK-OV-3 细胞相比具有较低的 FA 受体表达。

细胞摄取。 一 , b 用游离 FITC 和 FITC 标记的 FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 处理的细胞的共聚焦荧光图像。绿色和蓝色分别代表 FITC 和 DAPI 荧光。比例尺 =25 μm。 c , d 游离FITC和FITC标记的FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA、FA-FRT-PFP处理后细胞内FITC荧光信号及相应统计数据

体外超声成像

为了证实 FA-FRT-PFP 在体外增强 ADV 的超声成像，纳米粒子与细胞一起孵育 5 小时，并在有或没有 LIFU (2.0 W/cm ² ）。如图 6a 所示，在没有 LIFU 照射的情况下，所有测试组中的细胞均未显示增强的超声信号，而在 LIFU 照射后，FA-FRT-PFP 处理的细胞与对照 FRT-PFP 和 FA-FRT 相比显示出较高的超声强度-PFP + FA 组，分别。对于超声成像，使用 ImageJ 软件计算灰度值的定量分析。结果与US成像数据一致（图6b）表明FA-FRT-PFP处理细胞的US强度在LIFU以2.0 W/cm ² 照射后增强 3 分钟。 FA-FRT-PFP 进入细胞，在溶酶体的酸性环境（pH =~ 5.0）中分解并释放 PFP 进入细胞质 [34, 35]。 LIFU 照射后，PFP 容易产生从液滴到气体的相变，从而增强了 US 强度。

体外超声成像。 一 超声图像和相应的统计数据 (b ) PBS（对照）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 处理的细胞，有或没有 LIFU 照射（2.0 W/cm ² , 3 分钟)

体外抗癌功效和细胞死亡分析

图 7a 显示了浓度高达 0.5 mg/mL 的 FA-FRT-PFP 的细胞毒性。在没有 LIFU 照射的情况下，FA-FRT-PFP 对 SK-OV-3 细胞的活力没有明显的抑制。 CCK-8检测用于分析FA-FRT-PFP联合LIFU的抗癌功效。如图 7b 所示，在没有 LIFU 照射的情况下，与对照组相比，FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 没有显示出显着的细胞毒性。当与 LIFU 照射 4 分钟结合时，FA-FRT-PFP 显示出显着的细胞毒性，高于 FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA，峰值细胞抑制率在 40 μg/mL 时接近 90%。这可能是因为与 FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 相比，FA-FRT-PFP 更容易被吸收到细胞质中，然后被溶酶体吸收。在溶酶体的酸性环境中，FA-FRT-PFP 将 PFP 释放到细胞质中。在 LIFU 照射 4 分钟下，释放的 PFP 气化，引起空化和破裂，产生一系列物理冲击力，显着增强了肿瘤的杀伤作用 [36,37,38]。此外，附加文件 1：图 S3 显示了纳米颗粒在正常卵巢细胞中的细胞毒性。 FRT-PFP、FA-FRT-PFP+FA、FA-FRT-PFP组与LIFU联合时的细胞毒性无显着差异。结果可能是因为HUM-CELL-0088细胞FA受体表达低，无FA靶向作用。

体外抗癌功效。 一 SK-OV-3 细胞与不同浓度的 FA-FRT-PFP 孵育 24 小时后的细胞活力。 b 用 40 μg/mL PBS（对照）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 结合或不结合 LIFU 照射（2.0 W/cm ² , 4 min) 并进一步孵育 21 h

如图 8a、b 所示，在没有 LIFU 照射的情况下，所有组中的细胞都显示出最小的细胞死亡。 LIFU 照射 4 分钟后，由于 LIFP 诱导的 PFP 空化或气泡爆破产生的物理冲击波，FA-FRT-PFP 处理的细胞与其他组相比显示出明显的坏死（~ 91.6%）。此外，附加文件 1：图 S4 显示了细胞的 TNF 蛋白表达水平。没有LIFU，细胞几乎不表达TNF蛋白。与LIFU组相比，FA-FRT-PFP组细胞TNF表达水平高于FRT-PFP和FA-FRT-PFP+FA组，说明TNF蛋白是FA-FRT-PFP的重要组成部分+ LIFU 诱导的死亡相关蛋白 [39]。基于优异的体外癌症治疗效果[40,41,42]，FA-FRT-PFP有望用于未来的体内癌症治疗。

一 用 40 μg/mL PBS（对照）、FRT-PFP、FA-FRT-PFP + FA 和 FA-FRT-PFP 联合或不联合 LIFU 处理的 SK-OV-3 细胞的流式细胞术分析和相应统计数据辐照 (2.0 W/cm ² , 4 min) 并进一步孵育 23 h

结论

总之，我们成功开发了基于 FRT 和负载 PFP 的相变纳米粒子，并用 FA 靶分子 (FA-FRT-PFP) 进行了修饰。 FA-FRT-PFP 作为一种新型靶向美式诊疗方案，具有多重优势：（1）FA-FRT-PFP 具有纳米级粒径； (2)以FRT为载体，可在酸性和中性条件下分别进行分解和重组，上传和释放PFP液滴； (3) 在LIFU辅助和酸性条件下3分钟，FA-FRT-PFP释放PFP并通过ADV产生相变，可以显着提高其US对比度； (4) 在 LIFU 和酸性环境照射 4 分钟下，释放的 PFP 很容易引起细胞内的“爆炸效应”，从而产生物理抗肿瘤特性。这些结果表明，具有LIFU辅助的FA-FRT-PFP为超声分子成像和肿瘤治疗提供了一种新策略。

数据和材料的可用性

本手稿中的结论是基于本文提供和展示的所有数据。

缩写

ADV：

声学液滴汽化

ARP：

声响应平台。

CCK-8：

细胞计数试剂盒-8

EDC：

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺

FA：

叶酸

FBS：

胎牛血清

FITC：

异硫氰酸荧光素

FRT：

铁蛋白

LIFU：

低强度聚焦超声

NHS：

N-羟基琥珀酰亚胺

PFP：

全氟戊烷

美国：

超声