临床免疫分析中使用的一组基于 PAMAM 和量子点的复合物

介绍

量子点（QD）由于其高荧光量子产率、高光稳定性和低光漂白特性而被广泛用作发光体。它们还广泛用作细胞成像和生物技术应用中的有机荧光团。特别是，含镉量子点（即 CdSe 和 CdTe）具有显着的优势，因为在 430-660 nm 范围内的相同波长照射下，它们具有与尺寸相关的发射电磁光谱 [1, 2]。因此，抗体偶联的量子点是最有前景的分子成像探针。

聚酰胺胺树枝状大分子（PAMAM）作为目前研究最广泛、研究最深入的树枝状大分子之一，具有以下特点：表面官能团数量庞大，分子内部有大量空腔，纳米级尺寸，生物相容性好。当与药物和抗体结合时，这些树枝状大分子可以提高药物的溶解度和体循环，但不会妨碍药物的生物活性 [3]。因此，PAMAM修饰的抗体常用于临床免疫。

临床免疫分析包括多种方法，如WB、ELISA、IHC（免疫组织化学）、ICC（免疫细胞化学）和FCM（流式细胞术）。其中，FCM 利用特异性抗体探针在细胞和分子水平上对单细胞或其他生物颗粒进行快速分析。因此，FCM 是应用最广泛的免疫测定法之一。如果进行细胞筛选，使用相应的抗体探针就足够了；但是，如果需要筛选生物小分子，例如小蛋白、病毒或细胞因子，则应采用 CBA（流式微珠阵列）方法，因为 FCM 无法直接检测小细胞因子。 CBA 方法利用染料标记的珠子，在表面上构建有特定的捕获抗体。当CBA珠与样品和相应染料标记的抗体混合时，会形成夹心复合物，如ELISA，小抗原可通过FCM检测。

在这项研究中，我们提出了一组复合物，包括 PAMAM 偶联的山羊抗兔 IgG 和 QDs 偶联的山羊抗小鼠 IgG。这组复合物可用于 FCM、ICC 和 IHC。当加入兔抗抗原和小鼠抗抗原时，会检测到相应的抗原。当存在相应的小鼠和兔抗体时，该模型可以检测多种类型的抗原，包括小蛋白、病毒和细胞因子。方案 1 显示了 FCM 中使用的配合物，我们以 HSP27 为例。 HSP27也称为HSPB1(热休克蛋白家族B编号1)，它是参与耐药性、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤发生和转移等的重要蛋白质[4, 5]。在该模型中，PAMAM 偶联的山羊抗兔 IgG 充当载体和捕获物，类似于 CBA（细胞计数珠阵列）珠，允许 FCM 检测小分子抗原。量子点偶联的山羊抗小鼠 IgG 充当荧光探针。如果抗原是膜蛋白或细胞内蛋白，我们可以使用传统的FCM方法来检测抗原。我们只需要添加 QD 而不是 PAMAM 部分。对于细胞内蛋白和膜蛋白，可以将细胞作为FCM法直接检测的靶标；它们不需要 PAMAM 部分来构成假细胞。因此，我们可以将复合体拆分并单独使用。

FCM 如何形成和使用复合物来检测 HSP27 的表示。首先，G5氨基PAMAM必须与琥珀酸酐反应生成中性PAMAM

结果与讨论

复合物组包括两部分，PAMAM 部分和 QD 部分。 PAMAM 部分是 PAMAM 偶联的山羊抗兔 IgG。我们使用第五代氨基封端的 PAMAM 树枝状聚合物 (G5 PAMAM) 作为表面稳定剂，以提供适用于水性环境的溶解特性，但这种树枝状聚合物具有强正电荷，对抗体结合有害。为了中和正电荷，我们将 PAMAM 溶解在 DMSO 中并添加琥珀酸酐（二氢-2,5-二酮四氢呋喃）以中和 PAMAM 氨基。 PAMAM 中的氨基与琥珀酸酐反应形成酰胺键 [6,7,8,9,10]。反应结束后，将产物透析、冻干、称重、再溶解，产物接近中性，我们将产物命名为“N-PAMAM”，它能够与山羊抗兔IgG结合。 PAMAM，尤其是G5 PAMAM，含有大量空腔，IgG可能被包裹在G5 PAMAM的空隙空间内[11]。先将山羊抗兔IgG溶于MES缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.0），加入EDC和磺基-NHS（摩尔比1:1），孵育15 min。最后，加入 N-PAMAM（中性 PAMAM），然后在 4 °C 下在摇床中孵育过夜。这种聚合物在水溶液中自组装形成聚合物胶束，包裹着原本不溶的低分子量客体 [12]；反应结束后需要透析去除未反应的物质。然后，将产物冻干，称重，重新溶解于保存缓冲液中，最终制备N-PAMAM偶联的山羊抗兔IgG。

N-PAMAM-IgG（山羊抗兔）在MES中的荧光和紫外可见光谱见图1。与N-PAMAM（中性PAMAM）和IgG相比，N-PAMAM-IgG的荧光发射峰强度最低。 UV-vis光谱表明，与IgG、MES缓冲液、PAMAM和N-PAMAM相比，只有N-PAMAM-IgG在200 nm波长处有吸收峰。无论是荧光光谱还是UV-vis光谱，N-PAMAM-IgG与N-PAMAM和IgG相比都表现出不同的特性，这间接证明了N-PAMAM和IgG已经结合而不是简单的混合。为了检测 N-PAMAM-IgG 的抗体活性，进行了 ELISA。如图2所示，与N-PAMAM偶联后IgG（山羊抗兔）抗体抗性未丧失。

一 PAMAM-IgG（山羊抗兔）在 MES 中的荧光光谱。激发波长为548 nm。 b PAMAM-IgG（山羊抗兔）在MES中的紫外-可见光谱和一定波长范围内的发射光谱

ELISA 方法检测 N-PAMAM-IgG（山羊抗兔）抗体抗性。 N-PAMAM-IgG 用作抗原并稀释至不同浓度。兔 IgG-HRP 用作抗体探针来检测 N-PAMAM-IgG 的抗性。在450 nm波长处进行吸光度测量

量子点的部分是量子点偶联的山羊抗小鼠 IgG。抗体偶联的量子点通常通过交叉偶联反应形成，其中抗体分子与量子点表面的官能团（如羧基或氨基）结合 [13, 14]。在这项研究中，我们使用了用羧基配体稳定的核/壳 CdSe/ZnS 水溶性量子点和使用 EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐）的碳二亚胺偶联反应。这种方法是将抗体偶联到 QD 表面的最常用方法之一 [15,16,17]。 CdSe/ZnS QD 的胶束首先在硼酸盐缓冲液（5 mM BS，pH 7.2）中在 EDC 和磺基-NHS 存在下进行孵育。然后加入山羊抗小鼠IgG，将混合物在4 °C的摇床中避光孵育过夜。最后，加入10% BSA（牛血清白蛋白）封闭未反应的量子点，通过连续离心和重新溶解去除未反应的物质来纯化产物。 QDs偶联的IgG（山羊抗鼠）在4 °C避光保存后，抗体活性可保持3 个月。

QDs-IgG（山羊抗小鼠）和 QDs 在保存缓冲液（2.5 mM BS，pH 8.0，0.1% BSA）中的粒径如图 3a 所示。偶联反应后产物粒径明显增大，产物均一性和稳定性好。这些特性是它们用作检测探针的关键。 QDs-IgG 和 QDs 的荧光光谱如图 3b 所示，如图 3a 所示，生产直径增加表明 IgG 与 QDs 结合，但 QDs-IgG 荧光发射峰相同作为 QD。这一结果意味着 IgG 和 QD 的耦合不会改变 QD 的光学特性，这对它们在免疫测定中的应用很有用。为了检测 QDs-IgG 的抗体活性，我们使用了带有 PVDF 膜的 ELISA 方法。将小鼠抗AKT抗体稀释至1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml浓度，四种浓度梯度抗原与QDs-IgG（山羊抗鼠）杂交0.1 mg/ml 的相同浓度。 37 °C避光杂交40 min后，用PBST（pH 6.0，0.1% Tween 20）洗涤PVDF膜3次，紫外光照射PVDF膜。荧光强度如图3c所示，荧光强度随着抗原浓度的增加而增加，表明QDs-IgG具有较高的抗体活性。

一 量子点和量子点偶联的 IgG（山羊抗小鼠）的流体动力学直径分布。 (a ) 量子点的直径和 (b ) 量子点偶联的 IgG（山羊抗小鼠）。通过DLS检测，QDs的平均直径为64.87 nm，QDs-IgG的平均直径为211.4 nm。 b QDs-IgG（山羊抗小鼠）、QDs 和保存缓冲液（2.5 mM BS，pH 8.0，0.1% BSA）的荧光光谱。 QDs-IgG 荧光发射峰与 QDs 相同，表明 IgG 与 QDs 的耦合没有改变 QDs 的光学特性。 c ELISA法检测QDs-IgG（山羊抗鼠）的抗体抗性，PVDF膜用UV进行评估

本节介绍如何在 FCM 中使用这组复合体。如上所述，我们可以检测多种类型的抗原，例如小蛋白、病毒和细胞因子[18]，我们以HSP27蛋白为例，现在让我们详细介绍一下过程。 HSP27位于细胞质中，在肿瘤细胞中大量分泌，特别是在肺癌、胰腺癌、泌尿系上皮癌、肾癌、乳腺癌和黑色素瘤皮肤癌中。由于HSP27的一小部分是细胞外分泌的，我们需要裂解细胞以提取蛋白质。在本实验中，我们选择了两个细胞系，MCF-7（人乳腺癌细胞）作为测试组，L02（正常人肝细胞）作为对照组。裂解细胞以提取细胞内蛋白质。收集总蛋白，根据蛋白浓度加入兔抗HSP27和小鼠抗HSP27，37 °C孵育50 分钟。然后加入N-PAMAM-IgG，37 °C孵育30 min，然后分成两个相等的组：测试组和PAMAM组。最后，将QDs-IgG加入到测试组中，并在37 °C避光孵育30 分钟。图4为流式细胞术对两组细胞的荧光分析。 MCF-7组测试曲线的荧光强度远高于PAMAM曲线，而L02组，两条曲线几乎重叠。当细胞提取物中存在 HSP27 时，N-PAMAM-IgG 和 QDs-IgG 会在兔抗 HSP27 和小鼠抗 HSP27 存在的情况下间接结合在一起形成夹心组合。如果 HSP27 不存在，只有少量 QDs-IgG 会通过非特异性吸附与 N-PAMAM-IgG 结合。因此，如果测试曲线的荧光强度高于对照 PAMAM 曲线的荧光强度，则样品中含有 HSP27。图4显示MCF-7细胞比L02细胞分泌更多的HSP27蛋白。

通过流式细胞术对 HSP27 进行荧光分析。 一 L02 细胞。 b MCF-7 细胞。试验组与N-PAMAM-IgG和QDs-IgG孵育，PAMAM组作为对照，仅与N-PAMAM-IgG孵育形成FCM检测小分子蛋白的假细胞。当两条曲线几乎重叠时，可以确定样品中没有HSP27；因此，无论是否添加QDs-IgG，荧光强度都不会发生变化

如上所述，这些复合物可以通过 FCM 检测分泌的细胞内蛋白质；原则上，这些复合物可以应用于任何种类的抗原。此外，组合的两个部分可以单独使用。如果我们要检测的抗原位于细胞内或细胞表面，则只能使用量子点的部分。例如，β-肌动蛋白是位于细胞内的细胞骨架的主要成分之一，广泛存在于真核细胞中。图 5a 显示了 FCM 对 HeLa 细胞中 β-肌动蛋白仅使用 QD 部分的荧光分析。将HeLa细胞洗涤并用甲醇处理以增强细胞膜的渗透性，然后分成相等的两组。 β-actin组与小鼠抗β-actin在37 ℃孵育30 min，对照组与BSA孵育。用 PBS 洗涤后，两组均与 QDs-IgG（山羊抗小鼠）在 37 °C 下孵育 30 分钟。 PBS洗涤2次后，FCM检测两组。 β-actin曲线的荧光强度远高于对照曲线，表明HeLa细胞含有β-actin蛋白。

一 HeLa 细胞中 β-肌动蛋白的荧光分析。 β-actin组用小鼠抗β-actin和QDs-IgG（山羊抗小鼠）孵育，对照组用BSA和QDs-IgG孵育。对照组可以排除由 QDs-IgG 的非特异性吸附引起的背景荧光。 b 紫外-可见光照射下 HeLa 细胞的荧光显微镜图像。 DAPI 染色细胞核并发出蓝色荧光； QDs-IgG 与β-肌动蛋白间接结合并发出红色荧光。比例尺 20 μm

此外，这些配合物也可应用于ICC。然而，对于ICC，要求靶抗原位于细胞内或细胞表面并大量存在[19]；否则，实验目标将难以与背景区分开来。我们以β-actin蛋白为例，将HeLa细胞接种在10 cm的细胞板中，放置显微镜盖玻片，用甲醇固定细胞。然后将细胞与小鼠抗 β-肌动蛋白（PBS，1% BSA）在 37 °C 下孵育 1 小时，用 PBST 洗涤两次，并在 37 °C 下与 QDs-IgG（山羊抗小鼠）一起孵育。黑暗 1 h。用PBST洗涤两次，用DAPI染色细胞核后，用荧光显微镜检测荧光[20, 21]。图 5b 显示了 HeLa 细胞的荧光显微镜图像。 QDs作为荧光染料的优点是在紫外通道的照射下可以同时观察到QDs的信号和DAPI信号；因此，根据原子核，可以明显定位目标。本实验中β-actin是细胞核周围的细胞骨架蛋白，可以明显观察到。

结论

总之，我们展示了在临床免疫分析中使用的复合物的应用，如 FCM 和 ICC。该复合物组包括 PAMAM 偶联的山羊抗兔 IgG 和 QDs 偶联的山羊抗小鼠 IgG。当加入兔抗抗原和小鼠抗抗原时，检测到相应的抗原。这些复合物因其广谱、高生物相容性、高光稳定性和低生物毒性而具有优势。这个复合体是一个通用模型，只需要改变相应的一抗。在本文中，我们使用复合物检测 HSP27 和 β-肌动蛋白，但理论上，此过程可应用于任何类型的抗原。此外，我们可以根据抗原的特性选择检测方法，也可以根据实际需要将复合物拆分单独使用。该方法还允许通过流式细胞术检测小分子，例如小蛋白质和病毒。我们相信，通过适当的改进，它也可以应用于其他方法，如免疫荧光（IF）、蛋白质印迹（WB）和横向流动免疫层析条（LCS）。

方法/实验

材料

CdSe/ZnS 量子点（具有羧基的水溶性量子点，cas no. N/A）购自中国 NEPQD。 PAMAM（第五代氨基封端，批号CYD-150A）购自中国CYD。山羊抗兔 IgG (ab6702) 和小鼠抗 β-actin (ab8226) 购自英国 Abcam；小鼠抗HSP27（BF0624）和兔抗HSP27（AF6082）购自美国Affinity；山羊抗小鼠IgG（bs0296G）购自Bioss，China； EDC 和 sulfo-NHS 购自 Thermo Fisher； DMEM和胎牛血清购自Gibco； PVDF 膜（0.2 μm）购自 Millipore。其他化学试剂均为分析纯。

N-PAMAM-IgG（山羊抗兔）的制备

1. a)

   N-PAMAM（中性 PAMAM）的制备：将 PAMAM（G5 氨基封端，平均 MW 28826）（60 mg，2.081 mM）溶解在 DMSO（2 ml）和琥珀酸酐（二氢-2,5-二酮四氢呋喃）（0.2666）中。加入g，2.66 mM)以中和氨基。因为1mol G5 PAMAM大分子有128mol氨基，60 mg PAMAM含有0.266 mM氨基，PAMAM氨基与琥珀酸酐的摩尔比约为1:10。然后将混合物在摇床中以100 rpm混合4 h，然后溶液通过3500MWCO透析膜透析24 h，冻干后得到N-PAMAM。

2. b)

   N-PAMAM-IgG（山羊抗兔）的制备：配制MES缓冲液（100 mM，pH 6.0），然后将100 μl MES缓冲液放入管中，加入20 μM EDC和20 μM sulfo-NHS，然后用搅拌器搅拌低速涡旋。加入35.7 μl IgG (pH, 0.5 μM)，涡旋振荡，然后加入19 μg N-PAMAM，4 °C孵育过夜，最后通过3500MWCO和8000天的膜透析，透析3天冻干后获得N-PAMAM-IgG。

QDs-IgG（山羊抗小鼠）的制备

1. a)

   BS缓冲液的配制：

1. 1.

   制备硼砂缓冲液（50 mM）：称取19.07 g硼砂溶解于1 L超纯水中。

2. 2.

   制备硼酸缓冲液（50 mM）：称取3.09 g硼酸溶于1 L超纯水中。

3. 3.

   将上述两种溶液混合制备pH 8.0 BS缓冲液和pH 7.2 BS缓冲液。

4. 4.

   洗涤缓冲液，也用作保存缓冲液，通过将pH 8.0 BS缓冲液稀释至5 mM的浓度并加入0.1%吐温20来制备。

5. 5.

   将pH 7.2 BS缓冲液稀释至5 mM，加入0.1% Tween 20，制备活化溶液。

6. 6.

   EDC缓冲液由0.27 g EDC溶解在5 ml活化液中制成，sulfo-NHS缓冲液由0.378 g磺基-NHS溶解在5 ml活化液中制成。

1. b)

   QDs-IgG（山羊抗小鼠）的制备：

首先将450 μl QDs（CdSe/ZnS，5 mg/ml）溶解在2.25 ml活化溶液中，然后加入150 μl EDC缓冲液和150 μl磺基-NHS缓冲液，溶液在冰上超声5分钟其次，将溶液以12,000 rpm离心5 分钟，除去上清液，将沉淀溶解在1.2 ml洗涤缓冲液中。超声混合30 min后，加入100 μg IgG抗体，然后将溶液在4 ℃的摇床中孵育过夜。第三，加入 150 μl 10% BSA，然后在 30 °C 下孵育 30 分钟，然后以 12,000 rpm 离心 2 分钟以去除上清液。将沉淀重新溶解在1 ml洗涤缓冲液中，然后以12,000 rpm离心2 分钟，重复此步骤，最后将沉淀溶解在1 ml保存缓冲液中。最后加入10% BSA；将混合物充分超声震荡混合并以820 g/min离心以去除沉淀物，上清液含有QDs-IgG。 QDs-IgG 应在 4 °C 下避光保存 3 个月。需要注意的是，样品只能在4 °C下保存，不能用甘油冷冻；否则会导致大量量子点聚集成簇，形成PBST无法冲刷的沉淀，导致严重的背景荧光。

HSP27 蛋白的 FCM 分析

HSP27位于细胞质中，在肿瘤细胞中大量分泌。在本实验中，我们选择了两个细胞系，MCF-7（人乳腺癌细胞）作为测试组，L02（正常人肝细胞）作为对照组。将两组细胞接种于10 cm培养皿中，在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，37 °C培养。当细胞覆盖平板的 80% 时，用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤两次。然后，将细胞重悬于 1 ml PBS 中。用血细胞计数器计数细胞，根据细胞浓度加入T-PER细胞裂解缓冲液，然后从细胞裂解液中提取细胞内蛋白。然后将细胞裂解液14000 rpm离心10 min收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度加入兔抗HSP27和小鼠抗HSP27孵育37 °C 50 分钟。本实验中L02蛋白浓度约为0.2 mg/ml，MCF-7蛋白浓度为0.25 mg/ml，两者体积均为500 μl。将兔抗HSP27和小鼠抗HSP27这两种抗体加入细胞中（0.625 μl加入MCF-7，0.5 μl加入L02细胞）。

然后，向混合物中加入1 mg/ml N-PAMAM-IgG，然后在37 °C下孵育30 分钟； MCF-7组加入6.25 μl，L02组加入5 μl。孵化后，生产被分成两个相等的组，测试组和PAMAM组。最后，在测试组中加入QDs-IgG，37 °C避光孵育30 min。然后对两组细胞进行流式细胞术分析。

β-肌动蛋白的 FCM 分析

β-肌动蛋白是一种细胞内蛋白质，是细胞骨架的主要成分之一，广泛存在于真核细胞中。 HeLa细胞接种于10 cm培养皿中，在含10%FBS的DMEM中，37 °C培养2 天，然后除去上清液，用PBS洗涤细胞两次。细胞用胰蛋白酶消化后，800 rpm离心3 分钟去除上清液，加入1 ml冷甲醇重悬细胞。 5 分钟后，将细胞以800 rpm离心3 分钟，除去上清液，将细胞重悬于1 ml的PBS中。重复此步骤，将 HeLa 细胞分成两个相等的组。试验组与小鼠抗β-actin 37 ℃孵育30 min，对照组与BSA（牛血清白蛋白）孵育。本实验将小鼠抗β-actin溶于PBST（1% BSA，5 μg/ml）中，在300 μl的试验组中加入100 μl的IgG，并在实验组中加入等量的BSA。控制组。孵育半小时后，两组均与 QDs-IgG（山羊抗小鼠）在 37 °C 下孵育 30 分钟。 PBS洗涤2次后，FCM评价两组。

β-肌动蛋白的 ICC 分析

将 HeLa 细胞接种在 10 cm 培养皿中，并在含有 10% FBS 的 DMEM 中在 37 °C 下培养 1 天。然后，将几片消毒过的盖玻片放入细胞培养皿中，进一步培养细胞2 天。取出盖玻片并用PBS洗涤两次，然后将盖玻片在400 μl甲醇中室温孵育20 分钟。盖玻片用 PBS 洗涤 3 次。然后，用 PBST（0.1% Tween 20）、22.52 mg/ml 甘氨酸和 10% BSA 制备封闭缓冲液。将盖玻片放入封闭缓冲液中并在室温下孵育 30 分钟。然后，去除封闭缓冲液，盖玻片与小鼠抗 β-肌动蛋白（PBS，1% BSA）在 37 °C 下孵育 1 h，用 PBST 洗涤两次，并与 QDs-IgG（山羊抗小鼠）在 37 °C 下在黑暗中保持 1 小时。 PBST洗涤2次，DAPI染色细胞核2 min后，PBS漂洗1次，水洗1次，荧光显微镜下观察。

数据和材料的可用性

所有数据完全可用，不受限制。

缩写

CBA：

细胞计数珠阵列

DMEM：

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS：

胎牛血清

FCM：

流式细胞术

ICC：

免疫细胞化学

N-PAMAM：

中性PAMAM

PAMAM：

聚酰胺型胺树枝状聚合物

量子点：

量子点