基于PAMAM-量子点复合物的快速临床免疫检测新策略

摘要

本文报道了一组用于临床免疫检测的复合物：PAMAM偶联羊抗兔IgG与量子点（QDs）偶联羊抗鼠IgG。加入兔抗抗原和鼠抗抗原后，可检测相应抗原。该方法操作简便、耗时短、步骤少，适用于流式细胞术（FCM）、免疫细胞化学（ICC）、免疫组化（IHC）等多种检测手段，可检测多种抗原。

引言

量子点（QDs）因高荧光量子产率、高光稳定性、低光漂白，广泛用作发光探针、细胞成像和生物技术应用中的有机荧光染料。镉基QDs（CdSe、CdTe）在430-660 nm激发下呈粒径依赖性发射光谱，抗体偶联QDs是分子成像最有前途的探针。

聚酰胺胺树枝状大分子（PAMAM）作为研究最深入的树枝状大分子之一，具有大量表面官能团、内部空腔、纳米尺寸、高生物相容性。与药物、抗体偶联可提高药物溶解度和全身循环而不妨碍生物活性，故PAMAM修饰抗体常用于临床免疫。

临床免疫检测包括WB、ELISA、IHC、ICC、FCM等。FCM利用特异性抗体探针在细胞/分子水平快速分析单细胞或生物颗粒，应用最广。细胞筛选仅需相应抗体探针；但小分子生物分子（小蛋白、病毒、细胞因子）筛选需采用细胞因子微球阵列（CBA）法，因FCM无法直接检测小细胞因子。CBA利用表面固定捕获抗体的染料标记微球，与样品和荧光标记检测抗体混合形成三明治复合物，经FCM检测小抗原。

本研究构建一组复合物：PAMAM偶联羊抗兔IgG和QDs偶联羊抗鼠IgG。可用于FCM、ICC、IHC。加入兔抗抗原和鼠抗抗原后检测相应抗原。该模型在相应鼠/兔抗体存在时可检测多种抗原（含小蛋白、病毒、细胞因子）。Scheme 1以HSP27为例展示FCM检测原理。HSP27即HSPB1，参与耐药、细胞生长、凋亡、肿瘤发生转移等。PAMAM偶联羊抗兔IgG作为载体和捕获剂，类似CBA微球，使小分子抗原可被FCM检测；QDs偶联羊抗鼠IgG作为荧光探针。若抗原为膜蛋白或胞内蛋白，可用传统FCM法，仅需QDs部分。胞内/膜蛋白以细胞为靶标可直接FCM检测，无需PAMAM构建假性细胞。因此复合物可拆分单独使用。

结果与讨论

复合物含PAMAM部分和QDs部分。PAMAM部分为PAMAM偶联羊抗兔IgG。采用五代氨基末端PAMAM（G5 PAMAM）作表面稳定剂提供水溶性，但其强正电荷不利抗体结合。用琥珀酸酐中和氨基：PAMAM溶于DMSO，加入琥珀酸酐（二氢-2,5-二氧代四氢呋喃），氨基与琥珀酸酐形成酰胺键。反应后透析、冻干、称重、复溶，得近中性产物“N-PAMAM”，可与羊抗兔IgG偶联。G5 PAMAM含大量空腔，IgG可封装于空腔内。羊抗兔IgG溶于MES缓冲液（0.1 mol/L, pH 6.0），加EDC和sulfo-NHS（摩尔比1:1）孵育15 min，加入N-PAMAM，4℃振荡过夜。聚合物水溶液中自组装形成胶束包裹难溶低分子客体；透析除去未反应物，冻干、复溶于保存缓冲液，得N-PAMAM偶联羊抗兔IgG。

N-PAMAM-IgG（羊抗兔）在MES中荧光和UV-Vis光谱（图1）：与N-PAMAM和IgG相比，N-PAMAM-IgG荧光发射峰强度最低；UV-Vis显示仅N-PAMAM-IgG在200 nm有吸收峰。荧光/UV-Vis谱特征差异间接证明N-PAMAM与IgG结合而非简单混合。ELISA验证抗体活性（图2）：N-PAMAM-IgG未失去抗原结合能力。

QDs部分为QDs偶联羊抗鼠IgG。抗体偶联QDs通常通过交联反应，抗体结合QDs表面羧基/氨基。本研究用核壳CdSe/ZnS水溶性羧基配体QDs，采用EDC碳二亚胺偶联法（最流行抗体-QDs偶联方法之一）。CdSe/ZnS QDs胶束先在含EDC/sulfo-NHS硼酸盐缓冲液（5 mM BS, pH 7.2）孵育，加入羊抗鼠IgG，4℃避光振荡过夜。加10% BSA封堵未反应QDs，连续离心/复溶纯化除去未反应物。QDs-IgG（羊抗鼠）4℃避光保存3个月抗体活性保持。

QDs-IgG与QDs粒径分布（图3a）：偶联后粒径明显增大，产物均一稳定，是探针应用关键。荧光光谱（图3b）：QDs-IgG发射峰与QDs一致，表明偶联未改变QDs光学特性，利于免疫检测应用。ELISA验证抗体活性（图3c）：小鼠抗AKT抗体四浓度梯度（1,10,100,200 μg/ml）与QDs-IgG（0.1 mg/ml）杂交40 min（37℃避光），PVDF膜PBST洗涤3次，UV照射测荧光强度：随抗原浓度升高荧光增强，证实QDs-IgG高抗体活性。

FCM检测HSP27蛋白

HSP27位于细胞质，肿瘤细胞大量分泌（肺癌、胰腺癌、泌尿上皮癌、肾癌、乳腺癌、黑色素瘤）。因小部分胞外分泌，需裂解细胞提取蛋白。选MCF-7（人乳腺癌细胞）作测试组，L02（正常人肝细胞）作对照。裂解提取胞内蛋白，BCA法测蛋白浓度，按浓度加入兔抗HSP27和鼠抗HSP27，37℃孵育50 min。加入N-PAMAM-IgG，37℃孵育30 min，分两等份：测试组和PAMAM对照组。测试组加QDs-IgG，37℃避光孵育30 min。流式细胞术荧光分析（图4）：MCF-7组测试曲线荧光强度远高于PAMAM对照曲线；L02组两曲线几乎重叠。若样品含HSP27，在兔/鼠抗HSP27桥接下N-PAMAM-IgG与QDs-IgG间接结合形成三明治复合物；若无HSP27仅非特异吸附少量QDs-IgG。测试曲线荧光高于对照曲线即判定含HSP27。MCF-7分泌HSP27多于L02。

复合物分拆单独应用：FCM检测β-actin

β-肌动蛋白为细胞骨架主要成分，广泛存在真核细胞。若抗原位于细胞内/表面，仅用QDs部分。HeLa细胞甲醇处理增强膜通透性，分两组：β-actin组孵育鼠抗β-actin，对照组孵育BSA。洗涤后均孵育QDs-IgG（羊抗鼠），FCM检测（图5a）：β-actin曲线荧光强度远高于对照，证实HeLa含β-actin。ICC应用（图5b）：HeLa细胞爬片，甲醇固定，封闭后孵育鼠抗β-actin，再孵育QDs-IgG，DAPI染核，荧光显微镜观察。QDs优势：紫外通道下QDs信号与DAPI信号可同时观察，据核定位靶标。β-actin为核周细胞骨架蛋白，清晰可见。

结论

本文展示了复合物在FCM、ICC等临床免疫检测中的应用。复合物含PAMAM偶联羊抗兔IgG和QDs偶联羊抗鼠IgG，更换相应初级抗体即可检测对应抗原。优势：适用谱宽、生物相容性高、光稳定性好、生物毒性低。这是一个通用模型：理论上可检测任意抗原；可根据抗原特性选择检测方法；复合物可拆分单独使用；使小分子（小蛋白、病毒）能经FCM检测。经适当改进，有望应用于免疫荧光（IF）、Western blot（WB）、侧向层析免疫条带（LCS）等。

实验方法

材料

CdSe/ZnS QDs（水溶羧基，NEPQD，中国）；PAMAM（五代氨基末端，CYD-150A，CYD，中国）；羊抗兔IgG（ab6702）、鼠抗β-actin（ab8226，Abcam，英国）；鼠抗HSP27（BF0624）、兔抗HSP27（AF6082，Affinity，美国）；羊抗鼠IgG（bs0296G，Bioss，中国）；EDC、sulfo-NHS（Thermo Fisher）；DMEM、FBS（Gibco）；PVDF膜（0.2 μm，Millipore）。其他试剂均为分析纯。

N-PAMAM-IgG（羊抗兔）制备

1. a) N-PAMAM制备：G5 PAMAM（平均MW 28826）60 mg（2.081 mM）溶于DMSO 2 mL，加琥珀酸酐0.266 g（2.66 mM）中和氨基。1 mol G5 PAMAM含128 mol氨基，60 mg PAMAM含0.266 mM氨基，氨基与琥珀酸酐摩尔比约1:10。振荡床100 rpm反应4 h，3500 MWCO透析膜透析24 h，冻干得N-PAMAM。
2. b) N-PAMAM-IgG制备：配制MES缓冲液（100 mM, pH 6.0），取100 μL加20 μM EDC、20 μM sulfo-NHS低速涡旋。加35.7 μL IgG（pH, 0.5 μM）涡旋，再加19 μg N-PAMAM，4℃过夜孵育，3500/8000 MWCO透析膜透析3天，冻干得N-PAMAM-IgG。

QDs-IgG（羊抗鼠）制备

1. a) BS缓冲液配制：1) 硼砂缓冲液（50 mM）：19.07 g硼砂溶于1 L超纯水。2) 硼酸缓冲液（50 mM）：3.09 g硼酸溶于1 L超纯水。3) 混合上述两液配制pH 8.0和pH 7.2 BS缓冲液。4) 洗涤/保存缓冲液：pH 8.0 BS稀释至5 mM加0.1% Tween 20。5) 活化液：pH 7.2 BS稀释至5 mM加0.1% Tween 20。6) EDC缓冲液：0.27 g EDC溶于5 mL活化液；sulfo-NHS缓冲液：0.378 g sulfo-NHS溶于5 mL活化液。
2. b) QDs-IgG制备：450 μL QDs（CdSe/ZnS, 5 mg/mL）溶于2.25 mL活化液，加150 μL EDC缓冲液和150 μL sulfo-NHS缓冲液，冰上超声5 min。12,000 rpm离心5 min弃上清，沉淀溶于1.2 mL洗涤缓冲液，超声混匀30 min。加100 μg IgG抗体，4℃振荡床过夜孵育。加150 μL 10% BSA，30℃孵育30 min，12,000 rpm离心2 min弃上清。沉淀溶于1 mL洗涤缓冲液，12,000 rpm离心2 min，重复一次，最终沉淀溶于1 mL保存缓冲液。加10% BSA，充分超声混匀，820 g/min离心除沉淀，上清含QDs-IgG。4℃避光保存3个月。注意：仅能4℃保存，不可冷冻（即使加甘油），否则QDs大量聚集沉淀，PBST无法洗脱，导致严重背景荧光。

HSP27蛋白FCM分析

MCF-7（测试组）和L02（对照组）细胞10 cm培养皿培养，DMEM+10% FBS，37℃。80%融合度时胰酶消化，PBS洗涤两次，1 mL PBS重悬，血球计数板计数，按细胞浓度加T-PER裂解液提取胞内蛋白。裂解液14,000 rpm离心10 min取上清，BCA法测蛋白浓度。按浓度加入兔抗HSP27和鼠抗HSP27，37℃孵育50 min。实验中L02蛋白浓度~0.2 mg/mL，MCF-7~0.25 mg/mL，体积均500 μL。抗体加量：MCF-7加0.625 μL兔抗HSP27和鼠抗HSP27，L02加0.5 μL。

加1 mg/mL N-PAMAM-IgG，37℃孵育30 min（MCF-7加6.25 μL，L02加5 μL）。孵育后分两等份：测试组和PAMAM对照组。测试组加QDs-IgG，37℃避光孵育30 min。流式细胞术分析两组细胞。

β-actin蛋白FCM分析

HeLa细胞10 cm培养皿培养2天，移上清，PBS洗涤两次。胰酶消化，800 rpm离心3 min弃上清，1 mL冷甲醇重悬，5 min后800 rpm离心3 min弃上清，1 mL PBS重悬。重复一次，分两等组。测试组孵育鼠抗β-actin（PBST含1% BSA, 5 μg/mL），对照组孵育BSA。加100 μL抗体于300 μL测试组，对照组等量BSA。30 min孵育后均孵育QDs-IgG（羊抗鼠）30 min。PBS洗涤两次，FCM检测。

β-actin蛋白ICC分析

HeLa细胞10 cm培养皿培养1天，放入若干无菌爬片继续培养2天。取出爬片PBS洗涤两次，400 μL甲醇固定20 min（室温）。PBS洗涤3次。封闭液：PBST（0.1% Tween 20）、22.52 mg/mL甘氨酸、10% BSA。爬片置入封闭液室温30 min。移除封闭液，孵育鼠抗β-actin（PBS, 1% BSA）37℃ 1 h，PBST洗涤两次，孵育QDs-IgG（羊抗鼠）37℃避光1 h。PBST洗涤两次，DAPI染核2 min，PBS冲洗一次，水冲洗一次，荧光显微镜观察。

数据与材料可用性

所有数据无限制完全公开。

缩略语

CBA

细胞因子微球阵列

DMEM

Dulbecco改良Eagle培养基

FBS

胎牛血清

FCM

流式细胞术

ICC

免疫细胞化学

N-PAMAM

中性PAMAM

PAMAM

聚酰胺胺树枝状大分子

QDs

量子点